CN114621948A - 一种高效核酸提取试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸提取领域，公开了一种高效核酸提取试剂盒及其使用方法，试剂盒包括：裂解液，以重量份计，裂解液的组分包括：变性剂50~100份、表面活性剂10~30份、甘油5份、三羟甲基氨基甲烷2~5份、异丙醇200份、无机盐8~10份、水75~100份；磁珠分散液；洗涤液，以重量份计，洗涤液的组分包括：表面活性剂10~30份、缓冲液10份、水100份、无水乙醇300~400份；洗脱液，以重量份计，洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250~500份、硫柳汞钠1~2份、水500000份。本发明通过对裂解液、洗涤液和洗脱液组分的优化，提高了核酸提取效率，并提高了对含杂质较多样本的抗干扰能力。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，尤其是涉及一种高效核酸提取试剂盒及其使用方法。
背景技术
核酸检测是通过查找患者来源于呼吸道、血液或粪便的样本是否存在外来入侵的病原微生物的核酸，来确定是否被病原微生物感染的方法。目前，核酸检测已广泛应用于呼吸道疾病的检测。进行核酸检测前，需要使用核酸提取试剂分离出病原微生物的核酸，而后才能用于后续的PCR、等温扩增、测序等下游应用。核酸提取作为整个检测体系的关键步骤之一，分离出的核酸质量和产量对后续的核酸检测有决定性的影响。
传统的核酸提取方法有酚-氯仿、碱裂解、热裂解、离心柱法、磁珠法等。酚-氯仿提取法得到的核酸质量好，但所需化学试剂对人体有害，且提取效率较低。碱裂解法和热裂解法成本低，但提取出来的核酸纯度低且易受干扰物质的影响，且碱裂解法对RNA的提取有局限。离心柱法提取的核酸得率和纯度较高，但操作繁琐且不能实现高通量自动化提取。磁珠法能在保证核酸得率和纯度的前提下，实现短时间内大通量的自动化提取，适合呼吸道疾病大范围筛查的应用场景，因此磁珠法核酸提取试剂盒得到了广泛研究。例如，在中国专利文献上公开的“一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法”，其公开号CN109022417A，所述试剂盒包括裂解液、蛋白酶K、磁珠液、转化试剂、核酸保护剂、结合液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ及洗脱剂。
但目前现有的磁珠法核酸提取试剂盒的提取效率仍较低，提取所需时间较长，且对粪便、宫颈脱落细胞等杂质较多的样本，其抗干扰能力比较差，不利于实际使用。
发明内容
本发明是为了克服现有的磁珠法核酸提取试剂盒的提取效率较低，提取所需时间较长，且对粪便、宫颈脱落细胞等杂质较多的样本，其抗干扰能力比较差的问题，提供一种高效核酸提取试剂盒及其使用方法，通过对裂解液、洗涤液和洗脱液组分的优化，在保证核酸提取率的前提下有效缩短了提取时间，并提高了对粪便、宫颈脱落细胞等含杂质较多样本的抗干扰能力。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，所述裂解液的组分包括：变性剂50～100份、表面活性剂10～30份、甘油5份、三羟甲基氨基甲烷2～5份、异丙醇200份、无机盐8～10份、水75～100份；
所述洗涤液的组分包括：表面活性剂10～30份、缓冲液10份、水100份、无水乙醇300～400 份；
所述洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250～500份、硫柳汞钠1～2份、水500000份。
本发明的核酸提取试剂盒包含裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液四种主要成分。裂解液中的变性剂和表面活性剂具有裂解病毒外壳和细胞膜的功能，同时能将蛋白质与核酸分子分离，高浓度无机盐能破坏核酸分子表面的水化膜从而促进核酸与磁珠的结合，异丙醇带来非极性环境对核酸与磁珠的结合也有促进作用。磁珠是一种具有超顺磁性的纳米颗粒，在高盐和非极性环境下能与核酸特异地结合，在低盐和高pH条件下能将核酸从磁珠上洗脱下来。洗涤液中含有缓冲液、表面活性剂和无水乙醇，能够洗去蛋白质、糖类和盐类，同时保证核酸与磁珠的结合；缓冲液不但可以起到维持pH作用，还能沉淀蛋白质与糖类并洗去盐类等杂质。洗脱液是pH在7.8-8.4之间的三羟甲基氨基甲烷与硫柳汞钠的水溶液，三羟甲基氨基甲烷能使核酸从磁珠上脱附，硫柳汞钠可以稳定核酸，有利于后续核酸溶液的保存。
本发明通过对磁珠法核酸提取过程中的裂解液、洗涤液和洗脱液组分进行优化，在保证核酸提取率的前提下，可以实现6min完成核酸提取，有效减少了提取所需时间，提高了核酸提取效率；并且采用本发明中的试剂盒对核酸进行提取，后续检测灵敏度能达到250cp/mL，且对粪便、宫颈脱落细胞等复杂样本有良好的的抗干扰性。
作为优选，所述裂解液中的变性剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素中的一种或多种；所述裂解液中的表面活性剂选自吐温20、曲拉通X-100、NP-40、SDS中的一种或多种。本发明通过裂解液中特定变性剂和表面活性剂的配合，可以实现病毒的快速裂解，从而有效提高了核酸的提取效率。
作为优选，所述裂解液中的无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化锂中的一种或多种。本发明通过添加特定种类的无机盐，可以起到促进核酸与磁珠的结合、提高核酸提取率和提取效率的作用，并且在裂解液中添加本发明中的无机盐，不会影响后续的核酸检测实验。
作为优选，所述洗涤液中的表面活性剂选自吐温20、曲拉通、NP-40中的一种或多种；所述洗涤液中的缓冲液选自醋酸钠-醋酸缓冲液、醋酸钾-醋酸缓冲液、醋酸钠-盐酸缓冲液或醋酸钾-盐酸缓冲液中的一种，缓冲液的pH为5.5-7.5。本发明通过对洗涤液中的表面活性剂和缓冲液种类进行限定，使洗涤液能够有效洗去蛋白质和盐类，同时可以保证核酸与磁珠的结合，提高了核酸的提取率。
作为优选，所述磁珠分散液中磁珠的浓度为2～5mg/mL。
本发明还提供了一种上述核酸提取试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)加样：将待提取的样本加入裂解液中；
(2)磁珠转移：给磁珠分散液外加磁场吸附，将磁珠转移至步骤(1)得到的混合液中；
(3)裂解与结合：将步骤(2)得到的混合液混匀后裂解1～3分钟，然后外加磁场吸附磁珠，将磁珠转移至洗涤液；
(4)洗涤：震荡洗涤后外加磁场吸附磁珠，将磁珠转移至洗脱液；
(5)洗脱：震荡洗脱后外加磁场吸附磁珠，转移洗脱液，得到核酸提取液。
作为优选，加入的样本、裂解液、磁珠分散液、洗涤液、洗脱液的体积比为 4～6:10:10:10～16:1～2。
作为优选，步骤(3)中吸附时间15～25s，吸附温度75～95℃。
作为优选，步骤(4)中的洗涤时间为25～35s。
作为优选，步骤(5)中洗脱温度75-100℃，洗脱时间50～70s。
因此，本发明的有益效果为：通过对裂解液、洗涤液和洗脱液组分的优化，在保证核酸提取率的前提下有效缩短了提取时间，并提高了对粪便、宫颈脱落细胞等含杂质较多样本的抗干扰能力。
附图说明
图1是实施例1和对比例1的扩增曲线。
图2是实施例2和对比例2的扩增曲线。
图3是实施例3和对比例3的扩增曲线。
图4是实施例4和对比例4的扩增曲线。
图5是实施例4和对比例5的扩增曲线。
图6是实施例5和对比例6的扩增曲线。
图7是实施例5和对比例7的扩增曲线。
图8是实施例6和对比例8的扩增曲线。
图9是实施例6和对比例9的扩增曲线。
图10是实施例7的扩增曲线。
图11是实施例8和对比例10的扩增曲线。
图12是实施例9的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
在本发明中，若非特指，所有原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
总实施例：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，所述裂解液的组分包括：变性剂50～100份、表面活性剂10～30份、甘油5份、三羟甲基氨基甲烷2～5份、异丙醇200份、无机盐8～10份、水75～100份；所述变性剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素中的一种或多种；所述表面活性剂选自吐温20、曲拉通X-100、NP-40、SDS 中的一种或多种；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化锂中的一种或多种；
所述洗涤液的组分包括：表面活性剂10～30份、缓冲液10份、水100份、无水乙醇300～400 份；所述表面活性剂选自吐温20、曲拉通、NP-40中的一种或多种；所述缓冲液选自醋酸钠- 醋酸缓冲液、醋酸钾-醋酸缓冲液、醋酸钠-盐酸缓冲液或醋酸钾-盐酸缓冲液中的一种，缓冲液的pH为5.5-7.5；
所述磁珠分散液中磁珠的浓度为2～5mg/mL；
所述洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250～500份、硫柳汞钠1～2份、水500000份。
上述核酸提取试剂盒的使用方法为：
(1)加样：将待提取的样本加入裂解液中；
(2)磁珠转移：给磁珠分散液外加磁场吸附，将磁珠转移至步骤(1)得到的混合液中；
(3)裂解与结合：将步骤(2)得到的混合液混匀后裂解1～3分钟，然后外加磁场吸附磁珠，将磁珠转移至洗涤液；
(4)洗涤：震荡洗涤25～35s后外加磁场吸附磁珠，将磁珠转移至洗脱液；
(5)洗脱：75-100℃下震荡洗脱50～70s后外加磁场吸附磁珠，转移洗脱液，得到核酸提取液；
加入的样本、裂解液、磁珠分散液、洗涤液、洗脱液的体积比为4～6:10:10:10～16:1～2。
实施例1：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，
裂解液的组分包括：异硫氰酸胍80份、NP-40 20份、甘油5份、三羟甲基氨基甲烷3份、异丙醇200份、氯化钾9份、纯化水80份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠终浓度2mg/mL(无核酸酶水稀释)；
洗涤液的组分包括：Tween 20 10份、pH＝5.5的醋酸钾-醋酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇360份；
洗脱液，以重量份计，洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对人体粪便中的肠道病毒核酸进行提取，方法为：
(1)样本制备：取两粒豌豆大小的粪便至2mL EP管中，添加1.5mL的生理盐水，涡旋震荡充分混匀，然后以12000rmp离心10min，取上清原液备用；将上述上清原液用生理盐水分别稀释2倍、5倍和10倍，作为待提取样本；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 板位 | 名称 | 体积(μL) | 温度(℃) | 振动时间(s) | 磁吸时间(sec) | 温度(℃) |
| 1 | 2 | 抓取 | / | / | / | / | / |
| 2 | 3 | 取磁珠 | 500 | / | / | 15 | / |
| 3 | 1 | 结合 | 700 | 90 | 120 | 20 | 90 |
| 4 | 2 | 洗涤 | 500 | / | 30 | 15 | / |
| 5 | 4 | 洗脱 | 50 | 80 | 60 | 10 | 80 |
| 6 | 2 | 丢弃 | 500 | OFF | 10 | / | / |
(4)将上述上清原液和稀释2倍、5倍和10倍后的稀释液分别按上述方法进行提取，各2 个重复，得到核酸提取液。
对比例1：
采用市售核酸提取或纯化试剂(磁珠法)，江苏默乐生物科技股份有限公司，苏泰械备20170121 号，搭配奥盛Auto-Pure 32A核酸提取仪对人体粪便中的肠道病毒核酸进行提取，方法为：
(1)样本准备：取两粒豌豆大小的粪便至2mL EP管中，添加1.5mL的生理盐水，涡旋震荡充分混匀，然后以12000rmp离心10min，取上清原液备用；将上述上清原液用生理盐水分别稀释2倍、5倍和10倍，作为待提取样本；
(2)在96深孔板的第1列和第7列中分别加入200μL待提取样本，然后将深孔板和磁棒套放置在仪器(型号：奥盛Auto-Pure 32A)的相应位置；
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
(4)将上述上清原液和稀释2倍、5倍和10倍后的稀释液分别按上述方法进行提取，各2 个重复，得到核酸提取液。
使用默乐生物的《肠道病毒(通用型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例1 和对比例1中得到核酸提取液进行检测，结果如图1和表1中所示。
表1：粪便样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(对比例1) | Ct值(实施例1) |
| 上清原液1 | 29.1 | 19.38 |
| 上清原液2 | NoCt | 20.14 |
| 2倍稀释液1 | 30.31 | 20.42 |
| 2倍稀释液2 | 31.23 | 20.46 |
| 5倍稀释液1 | 22.74 | 21.79 |
| 5倍稀释液2 | 22.47 | 21.73 |
| 10倍稀释液1 | 23.34 | 22.59 |
| 10倍稀释液2 | 23.18 | 22.53 |
从图1和表1中可以看出，实施例1中采用本发明中的试剂盒对粪便样本进行提取，与对比例1中的市售磁珠法提取试剂相比，Ct值显著减小，对高浓度粪便样本的抗干扰优势明显。
实施例2：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，裂解液的组分包括：异硫氰酸50份、SDS 5份、甘油5份、三羟甲基氨基甲烷2份、异丙醇200份、氯化钠8份、纯化水75份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠终浓度2mg/mL(用无核酸酶水稀释)；
洗涤液的组分包括Tween 20 10份、pH＝5.5的醋酸钾-醋酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇360份；
洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对手足口样本(咽拭子)中的核酸进行提取，方法为：
(1)样本制备：取一例手足口样本，进行3倍梯度稀释，共稀释4个梯度，分别标记为EV-1、 EV-2、EV-3和EV-4；作为待提取样本；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 板位 | 名称 | 体积(μL) | 温度(℃) | 振动时间(s) | 磁吸时间(sec) | 温度(℃) |
| 1 | 2 | 抓取 | / | / | / | / | / |
| 2 | 3 | 取磁珠 | 500 | / | / | 15 | / |
| 3 | 1 | 结合 | 700 | 90 | 120 | 20 | 90 |
| 4 | 2 | 洗涤 | 500 | / | 30 | 15 | / |
| 5 | 4 | 洗脱 | 50 | 80 | 60 | 10 | 80 |
| 6 | 2 | 丢弃 | 500 | OFF | 10 | / | / |
(4)将上述样本分别按上述方法进行提取，各2个重复，得到核酸提取液。
对比例2：
采用市售核酸提取或纯化试剂(磁珠法)，江苏默乐生物科技股份有限公司，苏泰械备20150076 号，搭配奥盛Auto-Pure 32A核酸提取仪对手足口样本(咽拭子)中的核酸进行提取，方法为： (1)样本制备：取一例手足口样本，进行3倍梯度稀释，共稀释4个梯度，分别标记为EV-1、EV-2、EV-3和EV-4；作为待提取样本；
(2)在96深孔板的第1列和第7列中分别加入200μL待提取样本，然后将深孔板和磁棒套放置在仪器(型号：奥盛Auto-Pure 32A)的相应位置；
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 槽位 | 名称 | 混合时间(min) | 磁吸时间(sec) | 体积(μL) | 温度状态 | 温度(℃) |
| 1 | 1/7 | 裂解 | 10 | 90 | 533 | 裂解加热 | 90 |
| 2 | 1/7 | 结合 | 10 | 90 | 533 | 无 | -- |
| 3 | 2/8 | 洗涤1 | 2 | 90 | 500 | 无 | -- |
| 4 | 3/9 | 洗涤2 | 2 | 90 | 500 | 无 | -- |
| 5 | 4/10 | 洗涤3 | 0 | 30 | 550 | 无 | -- |
| 6 | 6/12 | 洗脱 | 5 | 90 | 100 | 洗脱加热 | 80 |
| 7 | 2/8 | 弃磁珠 | 1 | 0 | 500 | 无 | -- |
(4)将上述样本分别按上述方法进行提取，各2个重复，得到核酸提取液。
使用默乐生物的《肠道病毒(通用型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例2 和对比例2中得到核酸提取液进行检测，结果如图2和表2中所示。
表2：手足口样本扩增Ct值。
从上述结果中可以看出，实施例2中采用本发明中的试剂盒对手足口样本进行提取，提取用时6min；而对比例2中采用市售磁珠法提取试剂时，提取用时需24min。本发明中的试剂盒的提取效率优于市售同类试剂。
实施例3：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，
裂解液的组分包括：盐酸胍100份、NP-40 30份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠浓度 2mg/mL；
洗涤液的组分包括：NP-40 30份、pH＝7.0的醋酸钠-盐酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇400份；
洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对宫颈脱落细胞中的人乳头瘤病毒(HPV)核酸进行提取，方法为：
(1)样本准备：选取HPV宫颈脱落细胞样本6例，命名为HPV1～6；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
(4)将上述样本分别按上述方法进行提取，得到核酸提取液。
对比例3：
采用市售核酸提取或纯化试剂(磁珠法)，江苏默乐生物科技股份有限公司，苏泰械备20170121 号，并使用热裂解法对宫颈脱落细胞中的人乳头瘤病毒(HPV)核酸进行提取，方法为：
(1)使用与实施例3同样的6例HPV样本，先取1mL HPV宫颈脱落细胞样本于1.5mL离心管，然后以7500rpm/min离心10分钟；
(2)弃上清，然后在沉淀中添加200μL裂解液，于95℃条件下浴温10min；
(3)浴温结束后，将离心管放入高速离心机以12000rpm/min离心10分钟；
(4)将上清液转移至干净的离心管，得到核酸提取液。
使用默乐生物的《人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例3和对比例3中得到核酸提取液进行检测，结果如图3和表3中所示。
表3：HPV样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(对比例3) | Ct值(实施例3) |
| HPV1 | 27.19 | 26.38 |
| HPV2 | 27.29 | 26.53 |
| HPV3 | 32.95 | 33.62 |
| HPV4 | 27.06 | 26.44 |
| HPV5 | 23.89 | 24.42 |
| HPV6 | 17.75 | 19.73 |
从图3和表3中的结果可以看出，实施例3采用本发明中的磁珠提取法，与对比例3中采用HPV提取的主流方法热裂解法相比，使用更少的样本量能达到一样的灵敏度。
实施例4：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，裂解液的组分包括：异硫氰酸胍100份、NP-40 30份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠浓度 2mg/mL；
洗涤液的组分包括：NP-40 30份、pH＝7.0的醋酸钠-盐酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇400份；
洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对宫颈脱落细胞中的人乳头瘤病毒(HPV)核酸进行提取，方法为：
(1)样本准备：选取HPV宫颈脱落细胞样本8例，命名为HPV7～14；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 板位 | 名称 | 体积(μL) | 温度(℃) | 振动时间(s) | 磁吸时间(sec) | 温度(℃) |
| 1 | 2 | 抓取 | / | / | / | / | / |
| 2 | 3 | 取磁珠 | 500 | / | / | 15 | / |
| 3 | 1 | 结合 | 700 | 90 | 120 | 20 | 90 |
| 4 | 2 | 洗涤 | 500 | / | 30 | 15 | / |
| 5 | 4 | 洗脱 | 50 | 80 | 60 | 10 | 80 |
| 6 | 2 | 丢弃 | 500 | OFF | 10 | / | / |
(4)将上述样本分别按上述方法进行提取，得到核酸提取液。
对比例4：
对比例4与实施例4的区别在于：对比例4中的裂解液组分包括：尿素100份、NP-4010份，曲拉通X-100 10份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份，其余均与实施例4中相同。
对比例5：
对比例5与实施例4的区别在于：对比例5中的裂解液组分包括：异硫氰酸胍100份、月桂酰基氨酸钠10份，曲拉通X-100 10份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份，其余均与实施例4中相同。
使用默乐生物的《人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例4和对比例4～5中得到核酸提取液进行检测，结果如图4～5和表4～5中所示。
表4：HPV7～10样本扩增Ct值。
表5：HPV11～14样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(实施例4) | Ct值(对比例5) |
| HPV11 | 28.63 | 28.21 |
| HPV12 | 18.06 | 26.83 |
| HPV13 | 19.52 | 22.19 |
| HPV14 | 27.45 | 29.12 |
从上述结果中可以看出，对比例4和5与实施例4相比，改变了裂解液中的变性剂及表面活性剂的组合，Ct值与实施例4中相比明显增大，灵敏度显著下降；说明不是任意的变性剂和表面活性剂组合都可以达到本发明的提取效果，本发明对裂解液中变性剂及表面活性剂的选择不是常规选择。
实施例5：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，裂解液，以重量份计，裂解液的组分包括：盐酸胍100份、SDS 10份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠浓度 2mg/mL；
洗涤液，以重量份计，洗涤液的组分包括：NP-40 30份、pH＝7.0的醋酸钠-盐酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇400份；
洗脱液，以重量份计，洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对宫颈脱落细胞中的人乳头瘤病毒(HPV)核酸进行提取，方法为：
(1)样本准备：选取HPV宫颈脱落细胞样本8例，命名为HPV15～22；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 板位 | 名称 | 体积(μL) | 温度(℃) | 振动时间(s) | 磁吸时间(sec) | 温度(℃) |
| 1 | 2 | 抓取 | / | / | / | / | / |
| 2 | 3 | 取磁珠 | 500 | / | / | 15 | / |
| 3 | 1 | 结合 | 700 | 90 | 120 | 20 | 90 |
| 4 | 2 | 洗涤 | 500 | / | 30 | 15 | / |
| 5 | 4 | 洗脱 | 50 | 80 | 60 | 10 | 80 |
| 6 | 2 | 丢弃 | 500 | OFF | 10 | / | / |
(4)将上述样本分别按上述方法进行提取，得到核酸提取液。
对比例6：
对比例6与实施例5的区别在于：对比例6中的裂解液组分包括：盐酸胍100份、Tween20 10 份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份，其余均与实施例5中相同。
对比例7：
对比例7与实施例5的区别在于：对比例7中的裂解液组分包括：盐酸胍100份、曲拉通X-100 10份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份，其余均与实施例5中相同。
使用默乐生物的《人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例5和对比例6～7中得到核酸提取液进行检测，结果如图6～7和表6～7中所示。
表6：HPV15～18样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(实施例5) | Ct值(对比例6) |
| HPV15 | 21.13 | 24.83 |
| HPV16 | 20.15 | 24.28 |
| HPV17 | 28.68 | 32.25 |
| HPV18 | 16.49 | 19.38 |
表7：HPV15～18样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(实施例5) | Ct值(对比例7) |
| HPV19 | 29.85 | 33.71 |
| HPV20 | 12.84 | 16.56 |
| HPV21 | 28.81 | 31.81 |
| HPV22 | 19.63 | 22.15 |
从上述结果中可以看出，对比例6和7与实施例5相比，仅改变了裂解液中的表面活性剂种类，Ct值与实施例5中相比均明显增大，灵敏度显著下降；进一步说明不是任意的表面活性剂都可以达到本发明的提取效果，本发明对裂解液中的表面活性剂的选择不是常规选择。
实施例6：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，裂解液的组分包括：异硫氰酸胍100份、Tween20 20份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠浓度 2mg/mL；
洗涤液的组分包括：NP-40 30份、pH＝7.0的醋酸钠-盐酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇400份；
洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对咽拭子样本中肠道病毒(EV) 的核酸进行提取，方法为：
(1)样本准备：选取EV咽拭子样本8例，命名为EV5～12；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 板位 | 名称 | 体积(μL) | 温度(℃) | 振动时间(s) | 磁吸时间(sec) | 温度(℃) |
| 1 | 2 | 抓取 | / | / | / | / | / |
| 2 | 3 | 取磁珠 | 500 | / | / | 15 | / |
| 3 | 1 | 结合 | 700 | 90 | 120 | 20 | 90 |
| 4 | 2 | 洗涤 | 500 | / | 30 | 15 | / |
| 5 | 4 | 洗脱 | 50 | 80 | 60 | 10 | 80 |
| 6 | 2 | 丢弃 | 500 | OFF | 10 | / | / |
(4)上述样本分别按上述方法进行提取，得到核酸提取液。
对比例8：
对比例8与实施例6的区别在于：对比例8中的裂解液组分包括：异硫氰酸胍100份、Tween20 20份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钙10份、纯化水100份，其余均与实施例6中相同。
对比例9：
对比例9与实施例6的区别在于：对比例8中的裂解液组分包括：异硫氰酸胍100份、Tween20 20份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化锌10份、纯化水100份，其余均与实施例6中相同。
使用默乐生物的《肠道病毒(通用型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例6 和对比例8～9中得到核酸提取液进行检测，结果如图8～9和表8～9中所示。
表8：EV5～8样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(实施例6) | Ct值(对比例8) |
| EV5 | 27.19 | 28.43 |
| EV6 | 27.30 | 29.84 |
| EV7 | 28.85 | 31.18 |
| EV8 | 30.11 | 31.03 |
表9：EV9～12样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(实施例6) | Ct值(对比例9) |
| EV9 | 26.68 | 28.65 |
| EV10 | 28.33 | 29.34 |
| EV11 | 31.21 | 31.80 |
| EV12 | 30.28 | 33.19 |
从上述结果中可以看出，对比例8和9与实施例6相比，仅改变了裂解液中的无机盐种类，Ct值与实施例6中相比均明显增大，灵敏度显著下降；说明不是添加任意种类的无机盐都可以达到本发明的提取效果，本发明对裂解液中的无机盐种类的选择不是常规选择。
实施例7
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，裂解液的组分包括：尿素100份、Tween20 20份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钾10份、纯化水100份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠浓度 2mg/mL；
洗涤液的组分包括：NP-40 30份、pH＝7.0的醋酸钠-盐酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇400份；
洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对咽拭子样本中肠道病毒(EV) 的核酸进行提取，方法为：
(1)样本准备：选取EV咽拭子样本4例，命名为EV13～16；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 板位 | 名称 | 体积(μL) | 温度(℃) | 振动时间(s) | 磁吸时间(sec) | 温度(℃) |
| 1 | 2 | 抓取 | / | / | / | / | / |
| 2 | 3 | 取磁珠 | 500 | / | / | 15 | / |
| 3 | 1 | 结合 | 700 | 90 | 120 | 20 | 90 |
| 4 | 2 | 洗涤 | 500 | / | 30 | 15 | / |
| 5 | 4 | 洗脱 | 50 | 80 | 60 | 10 | 80 |
| 6 | 2 | 丢弃 | 500 | OFF | 10 | / | / |
(4)上述样本分别按上述方法进行提取，得到核酸提取液。
使用默乐生物的《肠道病毒(通用型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例7 得到核酸提取液进行检测，结果如图10和表10中所示。
表10：EV13～16样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(实施例7) |
| EV13 | 26.49 |
| EV14 | 28.76 |
| EV15 | 29.54 |
| EV16 | 32.15 |
实施例8：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，裂解液的组分包括：异硫氰酸胍100份、Tween20 20份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钠15份、纯化水100份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠浓度 2mg/mL；
洗涤液的组分包括：NP-40 30份、pH＝7.0的醋酸钠-盐酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇400份；
洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对咽拭子样本中肠道病毒(EV) 的核酸进行提取，方法为：
(1)样本准备：选取EV咽拭子样本4例，命名为EV17～20；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 板位 | 名称 | 体积(μL) | 温度(℃) | 振动时间(s) | 磁吸时间(sec) | 温度(℃) |
| 1 | 2 | 抓取 | / | / | / | / | / |
| 2 | 3 | 取磁珠 | 500 | / | / | 15 | / |
| 3 | 1 | 结合 | 700 | 90 | 120 | 20 | 90 |
| 4 | 2 | 洗涤 | 500 | / | 30 | 15 | / |
| 5 | 4 | 洗脱 | 50 | 80 | 60 | 10 | 80 |
| 6 | 2 | 丢弃 | 500 | OFF | 10 | / | / |
(4)上述样本分别按上述方法进行提取，得到核酸提取液。
对比例10：
对比例10与实施例8的区别在于：对比例10中的裂解液组分包括：异硫氰酸胍100份、Tween20 20份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钠5份、纯化水100份；其余均与实施例8中相同。
使用默乐生物的《肠道病毒(通用型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例8 和对比例10得到核酸提取液进行检测，结果如图11和表11中所示。
表11：EV17～20样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(实施例8) | Ct值(对比例10) |
| EV17 | 25.50 | 27.66 |
| EV18 | 26.94 | 29.71 |
| EV19 | 28.60 | 31.68 |
| EV20 | 30.96 | 33.22 |
从上述结果中可以看出，对比例10与实施例8相比，仅改变了裂解液中的无机盐用量，Ct值与实施例8中相比也明显增大，灵敏度显著下降；说明不是无机盐添加量都可以达到本发明的提取效果，本发明对裂解液中的无机盐添加量的选择也不是常规选择。
实施例9：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，裂解液的组分包括：异硫氰酸胍100份、Tween20 20份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化锂10份、纯化水100份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠浓度 2mg/mL；
洗涤液的组分包括：NP-40 30份、pH＝7.0的醋酸钠-盐酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇400份；
洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、硫柳汞钠1.5份、纯化水500000份。
使用上述试剂盒，搭配默乐Mole Fast96核酸提取仪对咽拭子样本中肠道病毒(EV) 的核酸进行提取，方法为：
(1)样本准备：选取EV咽拭子样本4例，命名为EV21～24；
(2)在裂解液中分别加入200μL待提取样本，每一个孔位对应一个样本，然后将各96孔板放到对应位置：
(3)按以下程序设置核酸提取仪进行自动化提取：
| 步骤 | 板位 | 名称 | 体积(μL) | 温度(℃) | 振动时间(s) | 磁吸时间(sec) | 温度(℃) |
| 1 | 2 | 抓取 | / | / | / | / | / |
| 2 | 3 | 取磁珠 | 500 | / | / | 15 | / |
| 3 | 1 | 结合 | 700 | 90 | 120 | 20 | 90 |
| 4 | 2 | 洗涤 | 500 | / | 30 | 15 | / |
| 5 | 4 | 洗脱 | 50 | 80 | 60 | 10 | 80 |
| 6 | 2 | 丢弃 | 500 | OFF | 10 | / | / |
(4)上述样本分别按上述方法进行提取，得到核酸提取液。
使用默乐生物的《肠道病毒(通用型)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》对实施例9 得到核酸提取液进行检测，结果如图12和表12中所示。
表12：EV21～24样本扩增Ct值。
| 样本名称 | Ct值(实施例9) |
| EV21 | 26.09 |
| EV22 | 27.56 |
| EV23 | 29.58 |
| EV24 | 31.31 |
对比例11：
一种高效核酸提取试剂盒，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，裂解液的组分包括：异硫氰酸胍100份、Tween20 20份、甘油20份、三羟甲基氨基甲烷5份、异丙醇200份、氯化钠15份、纯化水100份；
磁珠分散液(苏州纳微科技有限公司，货号：MSRSC-050-05，浓度为20mg/mL)，磁珠浓度 2mg/mL；
洗涤液的组分包括：NP-40 30份、pH＝7.0的醋酸钠-盐酸缓冲液10份、纯化水100份、无水乙醇400份；
洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250份、纯化水500000份。
对实施例9和对比例11中的洗脱液对核酸的保存性能进行测试，测试方法为：
(1)将单纯疱疹病毒质粒原液(500ng/μL)用洗脱液稀释106、107、108和109倍；
(2)将稀释好的质粒溶液置于42℃条件下进行加速破坏试验；
(3)在第1天、第3天和第5天使用默乐生物的《单纯疱疹病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR 法)》检测两种洗脱液稀释的质粒溶液，结果如表13中所示。
表13：核酸稳定性测试结果。
从上述结果中可以看出，对比例11与实施例9相比，洗脱液中不添加硫柳汞钠，提取液中的核酸稳定性降低，不利于核酸提取液的保存。
Claims (9)
1.一种高效核酸提取试剂盒，其特征是，包括：裂解液、磁珠分散液、洗涤液和洗脱液；以重量份计，
所述裂解液的组分包括：变性剂50~100份、表面活性剂10~30份、甘油5份、三羟甲基氨基甲烷2~5份、异丙醇200份、无机盐8~10份、水75~100份；
所述洗涤液的组分包括：表面活性剂10~30份、缓冲液10份、水100份、无水乙醇300~400份；
所述洗脱液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷250~500份、硫柳汞钠1~2份、水500000份。
2.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征是，所述裂解液中的变性剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素中的一种或多种；所述裂解液中的表面活性剂选自吐温20、曲拉通X-100、NP-40、SDS中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的核酸提取试剂盒，其特征是，所述裂解液中的无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化锂中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征是，所述洗涤液中的表面活性剂选自吐温20、曲拉通、NP-40中的一种或多种；所述洗涤液中的缓冲液选自醋酸钠-醋酸缓冲液、醋酸钾-醋酸缓冲液、醋酸钠-盐酸缓冲液或醋酸钾-盐酸缓冲液中的一种，缓冲液的pH为5.5-7.5。
5.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征是，所述磁珠分散液中磁珠的浓度为2~5mg/mL。
6.一种如权利要求1~5任一所述的核酸提取试剂盒的使用方法，其特征是，包括如下步骤：
（1）加样：将待提取的样本加入裂解液中；
（2）磁珠转移：给磁珠分散液外加磁场吸附，将磁珠转移至步骤（1）得到的混合液中；
（3）裂解与结合：将步骤（2）得到的混合液混匀后裂解1~3分钟，然后外加磁场吸附磁珠，将磁珠转移至洗涤液；
（4）洗涤：震荡洗涤后外加磁场吸附磁珠，将磁珠转移至洗脱液；
（5）洗脱：震荡洗脱后外加磁场吸附磁珠，转移洗脱液，得到核酸提取液。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征是，加入的样本、裂解液、磁珠分散液、洗涤液、洗脱液的体积比为4~6:10:10:10~16:1~2。
8.根据权利要求6或7所述的使用方法，其特征是，步骤（4）中的洗涤时间为25~35s。
9.根据权利要求6或7所述的使用方法，其特征是，步骤（5）中洗脱温度75-100℃，洗脱时间50~70s。
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