CN111187769A

CN111187769A - 一步快速高效提取病毒核酸的方法

Info

Publication number: CN111187769A
Application number: CN202010252513.7A
Authority: CN
Inventors: 单玉飞; 曹飞婷; 方利
Original assignee: Changzhou Smart Lifesciences Co ltd
Current assignee: Changzhou Smart Lifesciences Co ltd
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2040-04-01
Also published as: CN111187769B

Abstract

本发明公开了一步快速高效提取病毒核酸的方法，包括以下步骤：（1）病毒抗体或受体通过与磁性微球（MNP）表面的羟基、羧基、氨基或环氧基键合，形成稳定的磁性微球‑抗体复合物（MNP‑Ab）；（2）将MNP‑Ab与核酸提取磁珠按一定比例混匀成磁珠混合物；（3）将磁珠混合物加入到样本中，使待检样本中病毒与MNP‑Ab结合；（4）富集的病毒利用裂解液将病毒裂解释放核酸，同时核酸与磁珠混合物中的核酸提取磁珠结合；（5）利用洗脱液将核酸洗脱；本发明真正实现“一步一管法”，将免疫磁珠和核酸提取磁珠置于同一容器中，无需在操作过程中，除去任一磁珠，操作简单，免疫磁珠特异性吸附率高，病毒的回收率高，且可重复性强。

Description

一步快速高效提取病毒核酸的方法

技术领域

本发明属于病毒核酸提取和检测领域，具体涉及一步快速高效提取病毒核酸的方法。

背景技术

核酸提取纯化是下游核酸检测、生物学研究或新产品开发的基础，获得的核酸的质量和完整性直接影响检测的结果。经典的核酸提取纯化方法有酚-氯仿提取法，碱裂解法，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取法等。但是这些方法存在操作繁琐、耗时、提取微量核酸效果欠佳。

磁珠法作为近年来兴起的新型核酸提取方法，主要原理是基于磁性纳米材料在高盐环境下对核酸进行特异性的吸附，经过磁性分离和漂洗杂质后，在低盐溶液中被洗脱下来，从而达到对核酸进行提取纯化的目的。如专利CN101851617B公开了一种可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法，先在生物样品中将病毒吸附到磁珠I上，得到吸附有病毒的磁珠I，外加磁场将病毒-磁珠I复合物与样品分开，将病毒-磁珠I复合物悬浮于裂解液I中，在裂解液I中病毒从磁珠I上解离，外加磁场除去磁珠I，加热使病毒裂解；再用磁珠II吸附病毒裂解物中的病毒核酸，外加磁场将吸附有病毒核酸的磁珠II与病毒裂解物分开，用洗涤液洗涤吸附有病毒核酸的磁珠II后，用溶解液将病毒核酸从磁珠II上洗脱下来得到纯化的病毒核酸。该技术方案提取过程操作简便快速；无需复杂设备。但该技术方案并未实现真正意义上的“一步及一管法”提取病毒核酸，根据其说明书中记载中的内容，磁珠I和磁珠II需要在不同的容器中进行，操作步骤相对较多，影响病毒的回收率，自动化操作时耗材用量大成本高；且其采用的磁珠I为凝胶磁珠，对病毒特异性选择相对较弱，并不适合一些特种病毒的核酸提取。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提出一步法快速、高效提取病毒核酸的方法，真正实现“一步一管法”，将免疫磁珠和核酸提取磁珠置于同一容器中，无需在操作过程中，除去任一磁珠，操作简单，免疫磁珠特异性吸附率高，病毒的回收率高，且可重复性强。自动化操作步骤少，成本低。

本发明提供的技术方案如下：

一步快速高效提取病毒核酸的方法，包括以下步骤：

（1）将待测样品加入装有混合磁珠的容器中，混合均匀后静置5~10min；

（2）将步骤（1）得到的装有混合液的容器置于磁力架上1~2min后，吸弃上清液；

（3）向步骤（2）得到的容器中加入裂解液、振荡混匀，静置5~8min，放置磁力架上1~2min，吸弃上清液；；

（4）加入洗涤液Ⅰ，振荡混匀，在磁力架上放置1~2min后，吸弃管内上清液；

（5）加入洗涤液Ⅱ，振荡混匀，在磁力架上放置1~2min，吸弃管内上清液，在磁力架上放置3~5min，室温挥发酒精；

（6）往容器中加入洗脱液，混合均匀，室温放置3~5min后，置于磁力架上，收集病毒RNA洗脱液，即得病毒核酸溶液；

其中：所述混合磁珠为免疫磁珠和核酸提取磁珠混合溶液，免疫磁珠为病毒抗体或受体通过与磁性微球（MNP）表面的羟基、羧基、氨基或环氧基键合得到的MNP-Ab。

优选地，步骤（1）中，静置时间为5~10min，步骤（3）中的静置时间为5~10min。

优选地，洗涤液Ⅰ为5.5M盐酸胍、56%无水乙醇以及80μg/mL蛋白酶K的混合溶液，其pH值为6~7，洗涤液Ⅱ为75%乙醇溶液。

优选地，病毒抗体包括囊膜病毒的外膜蛋白、不带囊膜病毒的外壳蛋白抗体或核衣壳蛋白抗体。

更优选地，所述囊膜病毒的外膜蛋白抗体为F蛋白、M蛋白、N蛋白或S蛋白的抗体。

优选地，所述病毒受体为与病毒特异性结合的单体或多分子复合物。

优选地，所述核酸提取磁珠为硅羟基磁珠、羧基磁珠或其它可在特定条件下结合病毒核酸的磁珠。

优选地，混合磁珠混合液中，MNP-Ab的质量分数为10~90%。

优选地，所述裂解液为10~100mMTris-HCl、1~6M异硫氰酸胍、0~1%Triton X-100、1~10mM DTT以及1~20mMEDTA的混合溶液，其pH值为3.0~7.5。

与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：

（1）本发明真正实现“一步一管法”提取病毒核酸，将免疫磁珠和核酸提取磁珠置于同一容器中，两种磁珠分别进行各自的吸附操作，相互之间不受影响，无需在操作过程中，除去任一磁珠，操作简单，免疫磁珠特异性吸附率高，病毒的回收率高，且可重复性强。自动化操作步骤少，成本低。

（2）本发明开发的一步快速高效提取病毒核酸的技术体系，可在病毒RNA释放之前对病毒进行富集，减小样本体积，有效降低样本中酶、多糖、细菌等杂质的污染；同时，可使用磁力架人工快速操作，亦可以使用机器进行自动化高通量操作以降低人为影响。与荧光定量PCR检测试剂盒结合可以提高样本病毒RNA的浓度以及稳定性，最终改进现有荧光定量RT-PCR检测试剂盒的灵敏度，可应用于新型冠状病毒的核酸提取和检测。

附图说明

图1采用荧光定量PCR方法检测后的数据结果图

其中：标“1”的线条表示阳性对照样本的检测曲线，标“2”的线条表示本发明中的混合磁珠“一步法”提取核酸的检测曲线，标“3”的线条表示两种磁珠分步提取核酸的检测曲线，标“4”的线条表示阴性对照的检测曲线。标“1”、“2”、“3”、“4”处的两条曲线表示本发明所做的重复实验所得。

具体实施例

现结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

病毒S蛋白抗体免疫磁珠的制备：

（1）取1ml羧基活化磁珠 Carboxyl-activated Magpoly Beads 于离心管中，将离心管置于磁分离器上1min，待溶液变澄清后，用移液器吸取上清液并丢弃；注：不要抽掉磁珠，下同；

（2）加入1ml，50mM MES，pH5.0，混合均匀，将离心管置于磁分离器上1min，待溶液变澄清后，用移液器吸取上清液并丢弃；

（3）加入 1ml（10mg/ml）EDC 溶液，混合均匀，室温孵育 30min。确保磁珠充分混匀，否则影响活化效率；

（4）将离心管置于磁分离器上1min，待溶液变澄清后，用吸取上清液并丢弃。用预冷的去离子水和活化溶液清洗2次，尽可能的快速，避免活化基团的水解；

（5）加入1ml含1mg/ml Anti- Covid-19 Spike Mab(新型冠状病毒抗体)的活化溶液，充分混匀，室温孵育至少2小时，确保磁珠充分混匀；

（6）将离心管置于磁分离器上约 1min，待溶液变澄清后，用移液器吸取上清液并丢弃；加入1ml，50mM Tris，pH7.4 或50mM的乙醇胺，pH8.0，室温孵育 30min；

（7）采用PBS 溶液清洗 2 次，即得偶联病毒抗体的免疫磁珠。

病毒核酸提取：

（1）将制备好的免疫磁珠与硅羟基磁珠按照等量比例混合均匀；

（2）取100μl混合磁珠加入到装有样本的离心管中，可以是口腔拭子、咽拭子等样本，混合均匀后，室温孵育5min，放置磁力装置上1min，待溶液澄清，吸取上清液并丢弃；

（3）混合磁珠中加入200ul 50mMTris-HCl，6M异硫氰酸胍，0.8%Triton X-100，10mMDTT，20mMEDTA，pH6.5，混合均匀，放置5min；

（4）将吸附核酸的混合磁珠管放置磁力架上1min，吸取上清液并丢弃；

（5）加入600μl的洗涤液Ⅰ（5.5M盐酸胍，56%无水乙醇，80μg/mL蛋白酶K，PH在6.5），振荡混匀，磁力架上放置1min，吸取上清液并丢弃；

（6）加入600μL的洗涤液Ⅱ（75%乙醇），振荡混匀，磁力架上放1min，吸取上清液并丢弃，并于磁力架上，室温挥发酒精3min；

（8）加100μl 洗脱液，室温放置5min，磁力架上放置5min，收集病毒RNA洗脱液，即得新型冠状病毒核酸溶液。

实施例2

病毒N蛋白抗体免疫磁珠的制备：

（1）取1ml氨基活化磁珠到离心管中，将离心管置于磁分离器上1min，待溶液变澄清后，用移液器吸取上清液并丢弃；注：不要抽掉磁珠，下同；

（2）用1ml PBS溶液清洗一次，将离心管置于磁分离器上1min，吸取上清液并丢弃；

（3）加入新鲜配制的200ul 戊二醛溶液（15%），混合均匀，室温避光反应1h，期间一直保持磁珠混匀状态;

（4）加入1mg的N蛋白抗体，混合均匀，室温反应2h以上，将离心管置于磁分离器上1min，吸取上清液并丢弃；

（5）加入500ul含 1%BSA的PBS缓冲液，室温封闭反应1h，将离心管置于磁分离器上1min，吸取上清液并丢弃；

（6）采用PBS 溶液清洗 2 次，即得偶联病毒N蛋白抗体的免疫磁珠。

病毒核酸提取：

将制备好的免疫磁珠与硅羟基磁珠按照3：2比例混合均匀；核酸提取步骤同实施案例1。

实施例3

抗体免疫磁珠的制备：同实施例2。

病毒核酸提取

（1）将制备好的免疫磁珠与硅羟基磁珠按照2：3比例混合均匀；

（2）取100μl混合磁珠加入到装有样本的离心管中，可以是口腔拭子、咽拭子等样本，混合均匀后，室温孵育10min，放置磁力装置上2min，待溶液澄清，吸取上清液并丢弃；

（3）混合磁珠中加入200ul 80mMTris-HCl，4M异硫氰酸胍，0.5%Triton X-100，5mMDTT，15mMEDTA，pH5.0，混合均匀，放置8min；

（4）将吸附核酸的混合磁珠管放置磁力架2min上，吸取上清液并丢弃；

（5）加入600μl的洗涤液Ⅰ（5.5M盐酸胍，56%无水乙醇，80μg/mL蛋白酶K，PH在6.5），振荡混匀，磁力架上放置2min，吸取上清液并丢弃；

（6）加入600μL的洗涤液Ⅱ（75%乙醇），振荡混匀，磁力架上放2min，吸取上清液并丢弃，并于磁力架上，室温挥发酒精5min；

（8）加50μl 洗脱液，室温放置3min，磁力架上放置1min，收集病毒RNA洗脱液，即为提取的新型冠状病毒核酸溶液。

病毒检测

取实施例1得到的核酸样本按照常规荧光定量PCR方法检测，PCR试剂使用量如表1；

PCR反应条件如表2；

检测结果如图1，当Cp值相同时，采用本发明中的“一步法”提取的核酸检测后的Ct值明显低于两种磁珠分步提取核酸的检测后的Ct值，在实际应用中，本发明中的病毒核酸提取效率高，检测灵敏度更高。

Claims

1.一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

其中：所述混合磁珠为免疫磁珠和核酸提取磁珠混合溶液，免疫磁珠为病毒抗体或受体等通过与磁性微球（MNP）表面的羟基、羧基、氨基或环氧基键合得到的MNP-Ab。

2.根据权利要求1所述的一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于：步骤（1）中，静置时间为5~10min，步骤（3）中的静置时间为5~10min。

3.根据权利要求1所述的一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于：洗涤液Ⅰ为5.5M盐酸胍、56%无水乙醇以及80μg/mL蛋白酶K的混合溶液，其pH值为6~7，洗涤液Ⅱ为75%乙醇溶液。

4.根据权利要求1所述的一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于：病毒抗体包括囊膜病毒的外膜蛋白、不带囊膜病毒的外壳蛋白抗体或核衣壳蛋白抗体。

5.根据权利要求4所述的一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于：所述囊膜病毒的外膜蛋白抗体为F蛋白、M蛋白、N蛋白或S蛋白的抗体。

6.根据权利要求1所述的一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于：所述病毒受体为与病毒特异性结合的单体或多分子复合物。

7.根据权利要求1所述的一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于：所述核酸提取磁珠为硅羟基磁珠、羧基磁珠或其它可在特定条件下结合病毒核酸的磁珠。

8.根据权利要求1所述的一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于：混合磁珠混合液中，MNP-Ab的质量分数为10~90%。

9.根据权利要求1所述的一步快速高效提取病毒核酸的方法，其特征在于：所述裂解液为10~100mMTris-HCl、1~6M异硫氰酸胍、0~1%Triton X-100、1~10mM DTT以及1~20mMEDTA的混合溶液，其pH值为3.0~7.5。