CN114196668A - 一种用于捕获Poly A（+）RNA的磁珠、其制备方法及应用 - Google Patents
一种用于捕获Poly A（+）RNA的磁珠、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：将羧基磁珠、活化剂和5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到捕获Poly A(+)RNA的磁珠。本发明中的工艺较链霉亲和素‑生物素法可大幅降低成本、且磁珠稳定性好，不会引入外源污染源，耐受高温以及含变性剂等样本中Poly A(+)RNA的捕获。可实现操作过程的高通量、自动化、捕获效率高、操作简单、无需昂贵设备等优点。本发明还提供了一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠及其应用。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域，尤其涉及一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠、其制备方法及应用。
背景技术
信使RNA(Messenger RNA,缩写mRNA)，是由DNA的一条链为模板转录而来的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。真核生物的mRNA是单顺反子，其最显著的特征是具有5'端帽子结构和3'端的poly A的结构，即Poly A(+)RNA。所以可以利用碱基配对原理，将Oligo dT探针偶联到固相载体上，当含mRNA的样品(总RNA或细胞裂解物)与之孵育时，mRNA的poly A尾即被特异性的结合到固相载体上，从而将其与其它Poly A(-)RNA、蛋白等杂质分开，从而达到mRNA特异性分离与富集。尤其随着mRNA疫苗的兴起，以及NGS转录组测序需求大幅提升，市场上对poly A(+)mRNA捕获纯化需求越来越多。
目前Poly A(+)RNA的纯化有多种方法，如超速离心法、免疫法，柱层析法。目前市面上纯化Poly A(+)RNA的方法应用最广泛的为层析柱法，包括阴离子交换层析柱法，但此方法相较回收率较低、应用较少。另一种为亲和层析柱法，此方法应用较广泛，回收率较高，但相较磁珠法，操作时间长、无法实现完全的自动化、高通量，且需要昂贵的设备，无法实现一次实验进行两次结合以达到更高的纯度。磁珠法应用于生物活性物质的捕获与富集等领域越来越普遍，可实现Poly A(+)RNA的全自动、高通量、高纯度捕获。
磁珠(也称，磁性微球)一般是指是直径大小为微米或纳米级别的超顺磁颗粒。磁珠可以通过外加磁场进行控制，实现处理过程的自动化；磁珠粒径小，具有较大的比表面积；磁珠具有丰富的表面材质和功能基团，易于进行生物修饰、偶联等，从而广泛应用于生物活性物质(例如，核酸、蛋白、细胞)的富集、分离与捕获、免疫检测、药物筛选、疾病的诊断和治疗等领域。
但市面上大多数采用链霉亲和素磁珠搭配生物素标记的Oligo dT(寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸)探针，来实现Poly A(+)RNA的亲和捕获，但此方法成本高、稳定性较差，不适用于含蛋白变性剂的样本以及重复再生使用等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠、其制备方法及应用，本发明中的磁珠稳定性好，不会引入外源污染源，耐受高温以及含变性剂等样本中Poly A(+)RNA的捕获。可实现操作过程的高通量、自动化、捕获效率高、操作简单、无需昂贵设备等优点。
本发明提供一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：
将羧基磁珠、活化剂和5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
优选的，所述磁珠的外层为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、琼脂糖或葡聚糖；
所述磁珠的粒径为100nm～150μm。
优选的，所述磁珠的浓度为5～100mg/mL。
优选的，所述活化剂为碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的一种或几种；
所述活化剂的浓度为10～100mg/mL。
优选的，所述5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针长度为10～30nt；
所述羧基磁珠质量与5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针的物质的量之比为1mg：(0.1～5)nmol。
优选的，所述偶联缓冲试剂包括吗啉乙磺酸、磷酸盐缓冲液、咪唑或碳酸氢钠；
所述偶联缓冲试剂的pH为4.0～9.0；所述偶联缓冲试剂的浓度为50～100mmol/L。
优选的，将反应得到的磁珠与封闭液混合，进行封闭反应，然后使用洗涤缓冲液进行洗涤，最后将磁珠置于保存液中进行保存。
优选的，所述封闭液为乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、牛血清白蛋白和甘氨酸中的一种或几种；
所述封闭液的pH为8.0～8.5，浓度为2～4mol/L。
本发明提供如上文所述的制备方法制备得到的捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
本发明提供如上文所述的捕获Poly A(+)RNA的磁珠在捕获Poly A(+)RNA中的应用。
本发明提供用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：将羧基磁珠、活化剂和5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到捕获Poly A(+)RNA的磁珠。本发明采用聚合物表面材质的磁珠，采用一步法完成活化和偶联，将特定修饰的Oligo dT探针共价偶联到磁珠上，用于Poly A(+)RNA的捕获。此工艺较链霉亲和素-生物素法可大幅降低成本、且磁珠稳定性好，不会引入外源污染源，耐受高温以及含变性剂等样本中Poly A(+)RNA的捕获。可实现操作过程的高通量、自动化、捕获效率高、操作简单、无需昂贵设备等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明应用例1中从甘蓝总RNA中捕获Poly A(+)RNA的RT-qPCR检测；图1中，曲线1表示捕获前GAPDHmRNA，曲线2表示捕获后GAPDH mRNA，曲线3表示捕获前18S rRNA，曲线4表示捕获后18S rRNA；
图2为本发明应用例2中从甘蓝叶片裂解粗提物中捕获Poly A(+)RNA的RT-qPCR检测；图2中，曲线1表示对照磁珠捕获GAPDHmRNA，曲线2表示本发明磁珠捕获GAPDH mRNA，曲线3表示对照磁珠非特异捕获18S rRNA，曲线4表示本发明磁珠非特异捕获18S rRNA。
具体实施方式
本发明提供了一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：
将羧基磁珠、活化剂和5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
本发明中的制备方法主要包括以下步骤：
(1)磁珠清洗
本发明将磁珠与清洗缓冲液混合，进行充分重悬，然后磁性分离，去除上清液，重复洗涤步骤1～3次，得到清洗后的磁珠。
在本发明中，所述磁珠的外层优选为聚合物材质，如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、琼脂糖或葡聚糖；所述磁珠的粒径优选为100nm～150μm，更优选为500nm～100μm，最优选为1～80μm。在本发明中，所述磁珠的表面具有羧基基团。
在本发明中，所述清洗缓冲液优选为MEST缓冲溶液，所述MEST缓冲溶液优选包括吗啉乙磺酸(MES)和吐温-20，所述吗啉乙磺酸的浓度优选为80～120mmol/L，更优选为90～110mmol/L，最优选为100mmol/L；所述吐温-20的质量浓度优选为0.01～0.1％，更优选为0.02～0.08％，最优选为0.05～0.06％。
(2)探针的准备
本发明中所使用的探针为Oligo dT探针，由25个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸缩合而成，5’端进行了NH2-C6-修饰。所述探针的长度优选为10～30nt，更优选为15～25nt。具体的，在本发明的实施例中，可采用由上海百力格生物合成的Oligo dT探针。
本发明将5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针与MEST缓冲液混合，充分混匀后备用。
在本发明中，所述MEST缓冲液的浓度优选为80～120mmol/L，更优选为90～110mmol/L，最优选为100mmol/L；所述MEST缓冲液的pH优选为5～6，更优选为5.5,。
在本发明中，所述5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在MEST缓冲液中的浓度优选为2～100nmol/mL，更优选为5～90nmol/mL，如2nmol/mL、5nmol/mL、10nmol/mL、15nmol/mL、20nmol/mL、25nmol/mL、30nmol/mL、35nmol/mL、40nmol/mL、45nmol/mL、50nmol/mL、55nmol/mL、60nmol/mL、65nmol/mL、70nmol/mL、75nmol/mL、80nmol/mL、85nmol/mL、90nmol/mL、95nmol/mL、100nmol/mL，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
(3)磁珠的活化与偶联
本发明将清洗后的磁珠、活化剂和准备好的5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针缓冲液在偶联缓冲试剂中混合，进行反应，得到用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
在本发明中，所述活化剂优选为碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的一种或几种，更优选的，所述活化剂为碳二亚胺(EDC)；所述活化剂在混合后体系中的浓度优选为10～100mg/mL，更优选为20～80mg/mL，如10mg/mL，20mg/mL，30mg/mL，40mg/mL，50mg/mL，60mg/mL，70mg/mL，80mg/mL，90mg/mL，100mg/mL，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
在本发明中，所述磁珠在混合后的体系中的浓度优选为5～100mg/mL，更优选为10～80mg/mL，如5mg/mL，10mg/mL，20mg/mL，30mg/mL，40mg/mL，50mg/mL，60mg/mL，70mg/mL，80mg/mL，90mg/mL，100mg/mL，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
在本发明中，所述混合后的体系中，磁珠与5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针的用量比优选为1mg：(0.1～5)nmol，更优选为1mg：(0.2～2)nmol，如1mg：0.1nmol、1mg：0.5nmol、1mg：0.8nmol、1mg：1.0nmol、1mg：1.5nmol、1mg：2.0nmol、1mg：2.5nmol、1mg：3.0nmol、1mg：3.5nmol、1mg：4.0nmol、1mg：4.5nmol、1mg：5.0nmol，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
在本发明中，所述偶联缓冲试剂优选包括吗啉乙磺酸、磷酸盐缓冲液、咪唑或碳酸氢钠；更优选的，所述偶联缓冲试剂还包括0.01％～0.1％的表面活性剂，如Tween、TritonX-100等。所述偶联缓冲试剂的pH优选为4.0～9.0，更优选为4.0～6.5；所述偶联缓冲试剂的浓度为50～100mmol/L，更优选为60～90mmol/L，如50mmol/L，60mmol/L，70mmol/L，80mmol/L，90mmol/L，100mmol/L，优选为以上述任意数值为上限或下限的范围值。
与现有技术中磁珠的活化和偶联分为两步进行不同，本申请中由于采用了特定的Oligo dT探针，为了提高共价偶联的效果，本发明将活化和偶联在一步中共同进行反应，所述反应的温度优选为室温，如20～30℃，更优选为20～25℃；所述反应的时间优选为16～20小时，更优选为17～18小时。
(4)磁珠的封闭与洗涤
完成反应后，本发明将反应后的体系进行磁性分离，去除上清液后，将得到的磁珠中加入封闭液，进行封闭反应，然后使用洗涤缓冲液进行洗涤、孵育。
在本发明中，所述封闭液优选为乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、牛血清白蛋白和甘氨酸中的一种或几种；所述封闭液的pH为8.0～8.5，浓度为2～4mol/L，更优选为3mol/L。
本发明优选重复上述封闭的步骤1～3次。
在本发明中，所述洗涤缓冲液优选包括乙酸-乙酸钠、PBS和NaHCO3中的一种或几种，且含0.01％表面活性剂，更优选为PBS和吐温-20的混合溶液(PBST缓冲液)。所述洗涤的温度优选为35～75℃，所述洗涤的时间优选为20～40min，所述洗涤的次数优选为3～6次。
所述孵育的温度优选为60～80℃，更优选为65～75℃；所述孵育的时间优选为5～20min，更优选为10～15min。本发明优选重复洗涤和孵育步骤1～3次。
(5)磁珠的保存
洗涤后的磁珠加入磁珠保存液中，振荡混匀重悬磁珠。进行磁性分离，去上清液，然后将得到的磁珠加入磁珠保存液中，使磁珠的浓度为5～10mg/mL，振荡混匀重悬磁珠，2～8℃保存，此即为捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
在本发明中，所述磁珠保存液优选包括10～50mmol/L的PBS(pH7.2-7.5)和0.05-0.2％proclin 300；所述磁珠保存液用水优选为无酶水。
本发明还提供了一种捕获Poly A(+)RNA的磁珠，按照上文所述的制备方法制得。
本发明还提供了一种捕获Poly A(+)RNA的磁珠在生物样品中捕获Poly A(+)RNA中的应用。
在本发明中，所述生物样品包括纯化的总RNA、细胞组织裂解物等。本发明在生物样品中捕获Poly A(+)RNA中包括捕获、洗涤和洗脱。
本发明在捕获Poly A(+)RNA中所使用的结合液中含有10～50mmol/L Tris-HCl(pH7.0-8.0)、0.5～1.0mol/L NaCl和1～5mmol/L EDTA；所述结合的温度优选为22～75℃，更优选为30～60℃，最优选为40～50℃；所述结合的时间优选为5～10min，所述结合的次数优选为1～2次。
优选地，本发明在捕获Poly A(+)RNA中所使用的洗涤液中10～50mmol/L Tris-HCl(pH7.0-8.0)、0.10～0.30mol/L NaCl和1～5mmol/L EDTA；所述洗涤的温度优选为16～26℃，更优选为20～25℃；所述洗涤的次数有序为2～3次。
优选地，在捕获Poly A(+)RNA中所使用的洗脱液为无酶水或10～50mmol/L Tris-HCl(pH 7.0-8.0)。所述洗脱的温度优选为22～75℃，更优选为30～60℃，最优选为40～50℃；所述洗脱的时间优选为2～10min。
在本发明中，所述结合液和洗涤液中还可添加表面活性剂，所述表面活性剂优选为非离子型表面活性剂和/或阴离子型表面活性剂，优选包括十二烷基硫酸盐(例如钠、锂盐等)、N-月桂酰肌氨酸、吐温(Tween)、曲拉通(Triton)等。所述表面活性剂的浓度优选为0.01～1％，更优选为0.05～0.8％，最优选为0.1～0.5％。
本发明提供用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：将羧基磁珠、活化剂和5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到捕获Poly A(+)RNA的磁珠。本发明采用聚合物表面材质的磁珠，采用一步法完成活化和偶联，将特定修饰的Oligo dT探针共价偶联到磁珠上，用于Poly A(+)RNA的捕获。此工艺较链霉亲和素-生物素法可大幅降低成本、且磁珠稳定性好，不会引入外源污染源，耐受高温以及含变性剂等样本中Poly A(+)RNA的捕获。可实现操作过程的高通量、自动化、捕获效率高、操作简单、无需昂贵设备等优点。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠、其制备方法及应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1捕获Poly A(+)RNA磁珠的制备
(1)磁珠清洗
将BeaverBeadsTM Mag COOH-280磁珠(2.8μm)置于摇床，200rpm,1h，使磁珠充分重悬。取1g BeaverBeadsTM Mag COOH-280(100mL)磁珠，磁性分离，去除上清。
加入200mL MEST(100mM MES pH 5.5,0.05％Tween-20)涡旋30s，使磁珠充分重悬，磁性分离，去除上清。重复洗涤步骤两次，共洗涤三次。
(2)探针的准备
Oligo dT探针由25个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸缩合而成，5’端进行了-NH2-C6-修饰，由上海百力格生物合成。用纯化水(pH6.0)溶解为浓度100μM，备用。
取2000nmol溶于100mM MEST，pH5.5，至50mL。涡旋30s，充分混匀。
(3)磁珠活化与偶联
向清洗好的磁珠中加入50mL 20mg/mL EDC(溶于100mM MEST)，混匀，后向磁珠中加入步骤(2)中稀释好的50mL 5’-NH2-Oligo(dT)25溶液，振荡混匀；置于滚轴混匀仪上，室温反应16-20h。磁性分离，去除上清。
(4)磁珠封闭与洗涤
向磁珠中加入200mL 3M乙醇胺，pH8.0，振荡混匀后置于滚轴混匀仪上，室温反应30min。磁性分离，去除上清。
重复封闭步骤两次，共三次。
加入200mL PBST，pH7.4，振荡混匀，65℃孵育10min。磁性分离，去上清。重复洗涤步骤两次，共洗涤三次。
(5)磁珠的保存
将步骤(4)的磁珠，磁性分离，去除上清。加入200mL磁珠保存液(1*PBS，pH7.4,0.1％proclin 300),振荡混匀重悬磁珠。磁性分离，去上清。
加入200mL磁珠保存液,使磁珠浓度为5mg/mL，振荡混匀重悬磁珠，2-8℃保存，此即为捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
对比例1：两步法偶联制备捕获Poly A(+)RNA磁珠
采用传统的两步法进行步骤(3)磁珠活化与偶联，其余步骤与实施例1相同。
1g磁珠先用50mL 20mg/mL EDC(溶于100mMMEST)，混匀，16-37℃活化15-20min，后磁性分离去除上清。再加入稀释好的50mL 2000nmol5’-NH2-Oligo(dT)25溶液，振荡混匀；置于滚轴混匀仪上，室温反应16-20h。磁性分离，去除上清。
磁珠Oligo(dA)30载量的检测过程同比实例2。
制备的捕获Poly A(+)RNA磁珠的Oligo(dA)30载量检测
(1)试剂准备：
Oligo(dA)30探针：5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'，nmole/OD260:2.75；
捕获缓冲液：10mM Tris-HCl,pH 7.5,1.0M NaCl,1mM EDTA，0.1％SDS
洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl,pH 7.5,0.15M NaCl,1mM EDTA
洗脱缓冲液：0.1M NaOH
(2)检测步骤：
2.1Oligo(dA)30样本准备：将100μM Oligo(dA)30用捕获缓冲液稀释至OD260值在0.7左右。
2.2涡旋磁珠，使磁珠充分重悬，每管磁珠，用移液枪取40μL磁珠(5mg/mL)至0.2mLPCR管中，磁性分离，去上清。
2.3加入100μL捕获缓冲液，吹打混匀15次，磁吸去上清，重复洗涤步骤2次，共洗涤3次。
2.4加入100μL第一步稀释好的Oligo(dA)30样本，吹打混匀15次，使磁珠充分混匀。室温孵育10min。磁性分离，去除上清。
2.5加入200μL洗涤缓冲液，吹打混匀15次，使磁珠充分混匀。磁性分离，去上清。重复洗涤步骤2次，共洗涤3次。
2.6加入100μL洗脱缓冲液，吹打混匀15次，使磁珠充分混匀。室温孵育5min，磁性分离，取上清。
2.7用OneDrop 2000(Nucleic Acid模块，ssDNA模式)测定各管ssDNA A260值(重复测定三次取平均值)。
2.8磁珠对Oligo(dA)30载量计算
每mg磁珠对Oligo(dA)30载量(pmol)＝洗脱OD260×5×2.75×100。
按照上述方法检测实施例1和对比例1中的得到的捕获Poly A(+)RNA的磁珠Oligo(dA)30载量，结果如表1所示。
表1不同活化偶联工艺偶联磁珠的Oligo(dA)30载量
| 活化偶联工艺 | Oligo(dA)<sub>30</sub>载量(pmol/mg) |
| 一步法(实施例1) | 507 |
| 两步法(对比例1) | 2 |
由表1实验结果显示，不同活化偶联工艺对最终磁珠上偶联量和载量有很大影响，一步制备的磁珠载量很高，但两步法偶联的磁珠其载量很低，不能满足后续对Poly A(+)RNA的捕获。
对比例2不同偶联缓冲液和pH值对磁珠Oligo(dA)30载量的影响
捕获Poly A(+)RNA的磁珠制备过程与实例(1)相同，其中不同在于偶联缓冲液，分为以下三组：
组1：使用pH5.5 100mM MES缓冲液
组2：使用pH7.0 100mM咪唑缓冲液
组3：使用pH8.2 100mM NaHCO3缓冲液
磁珠Oligo(dA)30载量的检测过程同上。
表2不同偶联缓冲液偶联磁珠的Oligo(dA)30载量
| 偶联缓冲液 | Oligo(dA)30载量(pmol/mg) |
| pH5.5 100mM MES | 541 |
| pH7.0 100mM咪唑 | 106 |
| pH8.2 100mM NaHCO<sub>3</sub> | 8 |
由表2实验结果显示，不同偶联缓冲液对最终磁珠上偶联量和载量有很大影响，随着pH升高，载量急剧下降。所以低pH的偶联缓冲条件可有效提升偶联效率，从而提升捕获载量。
应用例1从甘蓝总RNA中纯化Poly A(+)RNA
(1)Poly A(+)RNA捕获
试剂：
结合缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.5),1.0M NaCl,1mM EDTA，0.5％SDS
洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.5),0.15M NaCl,1mM EDTA
洗脱液：无酶水
1.将磁珠涡旋混匀，吸取20μL(5mg/mL)实施例1中制备的捕获磁珠于0.2mL的PCR管中，磁吸去上清。加入50μL结合缓冲液，吸吹洗涤磁珠，磁吸去上清，重复洗涤步骤一次，共洗涤2次。最后将磁珠重悬于50μL磁珠结合缓冲液中，待用。
2.用Nuclease-Free ddH2O将约600ng总甘蓝RNA稀释至50μL，冰上放置备用。
3.取50μL稀释后的总RNA加入2步骤中的50μL磁珠悬液中。吹吸混匀。置于PCR仪中(启用热盖105℃)，65℃，2min；20℃，5min。
4.将反应后的PCR管，磁吸弃上清。加入200μL洗涤缓冲液，反复吸吹几次，磁吸弃上清。
5.加入50μL Nuclease-Free ddH2O充分悬浮磁珠，之后置于PCR仪中(启用热盖105℃)，75℃，2min；20℃，5min。
6.向上述的反应液中加入50μL结合缓冲液，反复吹吸混匀，室温结合5min。
7.将PCR管置于磁力架上，磁吸弃上清。
8.加入200μL洗涤缓冲液，反复吹吸洗涤，置于磁力架上，弃上清。
9.加入16μL Nuclease-Free ddH2O，吹打混匀磁珠，室温静置2min。磁吸待溶液澄清后，吸取15μL上清至新的无酶PCR管。
10.取2μL纯化后的Poly A(+)RNA以及捕获前的样本(相同稀释倍数)进行RT-qPCR检测。
(2)RT-qPCR检测捕获效果：
试剂：
RT-qPCR检测试剂盒：FastKing One Step RT-qPCR Kit(天根生化，FP313)
GAPDH mRNA引物：
Forward primer AGAAGACCCTTCTCTTCGGT
Reverse primer CTTTCTTCGCACCACCCTTC
18S rRNA引物
Forward primer CATACCACGGTGGGGTCTTC
Reverse primer TCAATCCAGCCACAGGTTCC
RT-qPCR反应体系如下表:
表3：RT-qPCR体系组成：
| 成分 | 体积/反应(μL) |
| 2×FastKing RT-qPCR Buffer(SYBRGreen) | 12.5 |
| 25×RT-PCR Enzyme Mix | 1 |
| 上游特异性引物(10μM) | 0.65 |
| 下游特异性引物(10μM) | 0.65 |
| RNA模板 | 2 |
| RNase-Free ddH2O | 8.2 |
| 总体系 | 25 |
按下表进行RT-qPCR PCR程序：
表4 Real Time One Step RT-qPCR反应程序：
所采用的qPCR仪为雅睿MA6000。
结果见表5和图1：
表5捕获植物总RNA中Poly A(+)RNA的效果
| 目标RNA | 捕获前 | 捕获后 |
| GAPDH | 21.03 | 21.36 |
| 18S rRNA | 11.91 | 25.03 |
由表5实验结果显示，本发明制备的磁珠对Poly A(+)RNA的特异性捕获效果很高，回收率＞90％，且能明显降低rRNA的含量。
应用例2从甘蓝叶片裂解粗提物中纯化Poly A(+)RNA
(1)Poly A(+)RNA捕获
试剂：
裂解缓冲液：RNA Easy Fast Plant Tissue Kit,裂解液SG(天根生化，DP452,Buffer SG)
结合缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.5),1.0M NaCl,1mM EDTA，0.5％SDS
洗涤缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.5),0.15M NaCl,1mM EDTA
洗脱液：无酶水
磁珠：对照进口磁珠和本发明磁珠
1、将甘蓝叶片在液氮中迅速研磨成粉末，取50mg样本加入600μl裂解液SG和10μlProteinase K，立即涡旋剧烈震荡混匀，混匀后室温放置5min。
2、12,000rpm离心2min，取上清至新的EP管中，置于冰上，待用。
3、将磁珠涡旋混匀，分别吸取20μL(5mg/mL)实施例1中制备的捕获磁珠和进口对照磁珠，于两支0.2mL的PCR管中，磁吸去上清。加入50μL结合缓冲液，吸吹洗涤磁珠，磁吸去上清，重复洗涤步骤一次，共洗涤2次。
4、取100μL步骤2中的叶片裂解粗提物加入至步骤3中的磁珠中。吹吸混匀。室温静置5min。
5、将反应后的PCR管，磁吸弃上清。加入200μL洗涤缓冲液，反复吸吹几次，磁吸弃上清。
6、加入50μL Nuclease-Free ddH2O充分悬浮磁珠，之后置于PCR仪中(启用热盖105℃)，75℃，2min；20℃，5min。
7、向上述的反应液中加入50μL结合缓冲液，反复吹吸混匀，室温结合5min。
8、将PCR管置于磁力架上，磁吸弃上清。
9、加入200μL洗涤缓冲液，反复吹吸洗涤，置于磁力架上，弃上清。
10、加入16μL Nuclease-Free ddH2O，吹打混匀磁珠，室温静置2min。磁吸待溶液澄清后，吸取15μL上清至新的无酶PCR管。
11、取2μL纯化后的Poly A(+)RNA进行RT-qPCR检测。
(2)RT-qPCR检测捕获效果步骤同上.结果见表6和图2
表6：从甘蓝叶片裂解粗提物中纯化Poly A(+)RNA的效果
由表6实验结果显示，本发明制备的磁珠对Poly A(+)RNA的特异性捕获效率高，且针对rRNA的非特异性捕获低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：
将羧基磁珠、活化剂和5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁珠的外层为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、琼脂糖或葡聚糖；
所述磁珠的粒径为100nm～150μm。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述磁珠的浓度为5～100mg/mL。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述活化剂为碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的一种或几种；
所述活化剂的浓度为10～100mg/mL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针长度为10～30nt；
所述羧基磁珠质量与5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针的物质的量之比为1mg：(0.1～5)nmol。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲试剂包括吗啉乙磺酸、磷酸盐缓冲液、咪唑或碳酸氢钠；
所述偶联缓冲试剂的pH为4.0～9.0；所述偶联缓冲试剂的浓度为50～100mmol/L。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的制备方法，其特征在于，将反应得到的磁珠与封闭液混合，进行封闭反应，然后使用洗涤缓冲液进行洗涤，最后将磁珠置于保存液中进行保存。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述封闭液为乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、牛血清白蛋白和甘氨酸中的一种或几种；
所述封闭液的pH为8.0～8.5，浓度为2～4mol/L。
9.如权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的捕获Poly A(+)RNA的磁珠。
10.如权利要求9所述的捕获Poly A(+)RNA的磁珠在捕获Poly A(+)RNA中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116904445A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-10-20 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种mRNA富集方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103308680A (zh) * | 2013-06-05 | 2013-09-18 | 南昌大学 | 志贺氏菌在复杂基质中磁富集分离方法 |
| CN107254465A (zh) * | 2017-07-01 | 2017-10-17 | 济凡生物科技（北京）有限公司 | 一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法 |
| US20190292544A1 (en) * | 2016-11-08 | 2019-09-26 | Dots Technology Corp. | Allergen detection agents and assays |
| CN110699427A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-17 | 江苏为真生物医药技术股份有限公司 | 羧基磁珠偶联修饰的核酸探针及其制备方法和应用 |
| CN111235314A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-06-05 | 苏州白垩纪生物科技有限公司 | 一种病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其应用 |
| CN112226489A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-01-15 | 深圳百纳心致生命科学有限公司 | 一种基于磁珠靶向富集目标基因的核酸提取方法及其应用 |
| US20210115503A1 (en) * | 2017-04-06 | 2021-04-22 | Qing Wang | Nucleic acid capture method |
| WO2021109684A1 (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-10 | 南京师范大学 | 一种基于光亲和共价连接的蛋白质分子弱相互作用捕获磁珠及其制备方法和应用 |
-
2021
- 2021-12-22 CN CN202111582378.3A patent/CN114196668B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103308680A (zh) * | 2013-06-05 | 2013-09-18 | 南昌大学 | 志贺氏菌在复杂基质中磁富集分离方法 |
| US20190292544A1 (en) * | 2016-11-08 | 2019-09-26 | Dots Technology Corp. | Allergen detection agents and assays |
| US20210115503A1 (en) * | 2017-04-06 | 2021-04-22 | Qing Wang | Nucleic acid capture method |
| CN107254465A (zh) * | 2017-07-01 | 2017-10-17 | 济凡生物科技（北京）有限公司 | 一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法 |
| CN110699427A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-17 | 江苏为真生物医药技术股份有限公司 | 羧基磁珠偶联修饰的核酸探针及其制备方法和应用 |
| WO2021109684A1 (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-10 | 南京师范大学 | 一种基于光亲和共价连接的蛋白质分子弱相互作用捕获磁珠及其制备方法和应用 |
| CN111235314A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-06-05 | 苏州白垩纪生物科技有限公司 | 一种病毒灭活、捕获和实时荧光恒温扩增检测试剂盒及其应用 |
| CN112226489A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-01-15 | 深圳百纳心致生命科学有限公司 | 一种基于磁珠靶向富集目标基因的核酸提取方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| K S JAKOBSEN等: "Purification of mRNA diretly from crude plant tissues in 15 minutes using magnetic oligo dT microspheres.", 《NUCLEIC ACIDS RES.》, vol. 18, no. 12 * |
| MICHAEL R.GREEN等: "Isolation of Poly(A)+ Messenger RNA using magnetic oligo(dT) beads.", 《COLD SPRING HARB PROTOC》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116904445A (zh) * | 2023-09-12 | 2023-10-20 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种mRNA富集方法 |
| CN116904445B (zh) * | 2023-09-12 | 2023-12-29 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种mRNA富集方法 |
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