CN107254465A - 一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法 - Google Patents

一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法，属于生物技术领域，采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法基于包括偶联Oligo(dT)25的磁性微球和含有Poly‑A、序列为L(k)2‑d(k)5‑L(k)2‑d(k)5‑L(k)2‑dT5dA15的非特异捕获探针捕捉外周血样品中的核酸并通过磁性分离，配合进一步优化配方的裂解缓冲液、蛋白酶K、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，从而实现了如下优点：快速裂解，高效漂洗和洗脱，外周血样本中的游离核酸提取效率高，少量样本即可获得足够量的游离核酸；易操作，安全、绿色；大大简化了步骤，提高了实验效率，且重复性好，更利于高通量自动化操作。

Description

一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及核酸纯化，具体涉及一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法。
背景技术
早在1948年，Mandel等就发现了外周血中有游离核酸，研究发现，游离核酸不仅可以应用于胎儿性别、RHD血型、Y染色体连锁的遗传疾病的诊断与预防，还可以应用于检测肿瘤、癌症的发生以及骨髓移植后嵌合状态的研究。1989年，Stroun等研究表明，游离核酸中部分基因具有肿瘤组织基因的类似特征；几年后，Vasioukhin等于血浆游离核酸中发现了突变的N-ras，进一步为两者相关性提供了依据，至此，游离核酸开始被用作一种预测肿瘤发生的新型生物标记。近几年，除肿瘤外的其他疾病也出现了游离核酸的报道，如急性(心脑血管疾病)或恶性疾病(系统性免疫疾病)、需机械通气危重症、中风、脊髓小脑性共济失调、心肌梗塞、急性登革热病等。Lo等认为在免疫学上，胚胎对于母体类似于肿瘤对于机体，可能在母体血浆中存在游离的胎儿DNA，1997年，他们通过实时PCR从一孕男胎妇女血液游离DNA扩增出胎儿Y染色体特异序列，首次证明孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，为非创伤产前诊断开辟了一条新途径。随后在1998年，他们发现胎儿游离核酸在妊娠早期便存在于孕妇血液中，且浓度随孕周的延长而增加。同年，他们建立方法以检测孕中期RhD阴性孕妇外周血中是否存在RhD基因，从而揭开了利用母体血浆中游离胎儿DNA进行产前诊断研究的序幕。随着研究的广泛和深入，游离核酸还可用于三体综合征、地中海贫血症、连锁遗传性疾病和早产的产前诊断。
然而，外周血中游离核酸数量较少，另一方面，提取体系的复杂性使得提取纯度和效率上困难度较大，应用常用的苯酚-氯仿抽提法、硅膜离心柱吸附法及磁珠吸附法提取分离核酸时，显现出诸多不足，苯酚-氯仿抽提法的主要原理是基于DNA在不同溶剂中溶解度不同从而分离纯化DNA，其优点在于提取DNA产率较高，成本低，但缺点主要是费时费力，提取DNA纯度低，且大量使用有毒溶剂，对环境及操作者危害大，还难以实现自动操作。目前市面商品化核酸提取试剂盒大多是采用裂解法结合硅膜离心吸附柱，该方法简单快速，能有效的去除样本中的各种PCR抑制物，获得较纯的DNA，但是游离核酸提取效率低，且成本较高，同时需要高速离心，不适合临床常规使用和高通量操作。
近几年磁珠法提取收到热衷，主要原理是在磁性微球(或者说磁珠，主要为铁氧体)表面以共价键的形式偶联-COOH，-NH2，-OH，-COH，-SH，-SO3等活性基团，制备成具有磁性的亲和吸附剂，然后与生物样品共同孵育后，目标分子能够迅速被磁珠捕获，在磁场作用下从液相中沉降，经洗涤可分离得到表面结合有目标分子的磁性微球复合物，改变洗涤条件可以将目标分子从磁性微球上洗脱下来，该方法操作简便、快速，获得的核酸纯度高，尤其适合游离核酸的提取。但目前的磁珠法从样本中分离游离核酸的提取试剂盒操作复杂，需要先在56℃条件下用蛋白酶K和裂解缓冲液裂解样本，然后冷却至室温，再加入无水乙醇混匀，室温放置5分钟后再加入磁珠悬浮液进行混匀，经过三次漂洗步骤后置于室温晾干10-15分钟。裂解及漂洗步骤的繁琐性导致其自动化操作程度低，仪器普适性差，同时也无法保证核酸提取的重复性。针对于血浆样品中游离核酸提取同样出现提取效率低，导致提取时需要更多的起始样本量或者额外添加Carrier RNA或糖原才能满足后续检测的要求，这造成了成本的增加和临床应用的难度的增加。因此迫切需要开发简单快速、稳定高效、价格便宜及普适性好的磁珠法游离核酸提取的方法及试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法，用以解决现有技术中游离核酸提取效率低、步骤复杂、重复性差、成本较高，且临床使用难度大、自动化及高通量操作程度低的问题，通过开发非特异捕获探针、借助Oligo(dT)25与Poly-A的特异性结合，并优化裂解缓冲液、结合缓冲液及漂洗缓冲液等组成，实现了快速、高效、充分提取外周血中的游离核酸，且成本低、重复性好，适合临床常规使用，易于自动化及高通量操作。
为实现上述目的，本发明提供一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒，包括裂解缓冲液、蛋白酶K、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，关键在于，还包括偶联Oligo(dT)25的磁性微球和含有Poly-A的非特异捕获探针，非特异捕获探针的序列为L(k)2-d(k)5-L(k)2-d(k)5-L(k)2-dT5dA15。
优选的，所述裂解缓冲液为组成中包括浓度为0.4-0.8M的氯化苄、8-15mM的乙二胺四乙酸二钠、3-8mM的二硫苏糖醇、0.1-0.5mM的氢氧化钠和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸锂的水溶液。
优选的，所述结合缓冲液为组成中包括浓度为3-6M的氯化苄、0.5-1M的盐酸胍、0.5-1.5M的乙酸和体积比5-13％的乙酸钾的水溶液。
优选的，所述漂洗缓冲液为组成中包括浓度为5-15mM的三羟甲基氨基甲烷、0.1-0.3M的氯化苄和0.1-2的乙二胺四乙酸二钠的水溶液。
优选的，所述洗脱缓冲液为浓度5-15mM的三羟甲基氨基甲烷的水溶液。
本发明还提供一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
①将50-300μL外周血的样本加入至无核酸酶的离心管中，加入400-600μL裂解缓冲液和10-25μL蛋白酶K，混匀反应5-20min，得裂解样本；
②向裂解样本中加入80-150μL结合缓冲液和20-50μL包含偶联Oligo(dT)25的磁性微球及带有Poly-A的非特异捕获探针的核酸结合试剂，混匀后室温静置15-30min，将离心管于磁力架上磁吸附1-3min，吸弃上清，得磁珠-核酸复合物，其中非特异捕获探针的序列为L(k)2-d(k)5-L(k)2-d(k)5-L(k)2-dT5dA15；
③向磁珠-核酸复合物中加入700-1000μL漂洗缓冲液，混匀后磁吸附1-3min，吸弃上清，得纯化的磁珠-核酸复合物，向纯化的磁珠-核酸复合物中加入50-100μL洗脱缓冲液，晃动下室温孵育3-8min，得纯化的游离核酸。
优选的，所述裂解缓冲液为组成中包括浓度为0.4-0.8M的氯化苄、8-15mM的乙二胺四乙酸二钠、3-8mM的二硫苏糖醇、0.1-0.5mM的氢氧化钠和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸锂的水溶液。
优选的，所述结合缓冲液为组成中包括浓度为3-6M的氯化苄、0.5-1M的盐酸胍、0.5-1.5M的乙酸和体积比5-13％的乙酸钾的水溶液。
优选的，所述漂洗缓冲液为组成中包括浓度为5-15mM的三羟甲基氨基甲烷、0.1-0.3M的氯化苄和0.1-2的乙二胺四乙酸二钠的水溶液。
优选的，所述洗脱缓冲液为浓度5-15mM的三羟甲基氨基甲烷的水溶液。
上述技术方案中，采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒和方法，是基于含有Poly-A的非特异性捕获探针与样本中的游离核酸特异性结合，偶联Oligo(dT)25的磁性微球借助Oligo(dT)25与Po ly-A特异性结合形成复合体，再通过磁性实现游离核酸的分离提取。其中所述的外周血样本可以是血清或血浆样本，所述的非特异捕获探针的序列为L(k)2-d(k)5-L(k)2-d(k)5-L(k)2-dT5dA15，该序列是经过无数次实验设计筛选出来的核酸序列，具有高度的序列兼并性，能高效捕获游离核酸中的核酸；所述的磁性微球可以是四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒或内核层由磁性四氧化三铁(Fe3O4)颗粒构成的纳米颗粒，表面偶联Oligo(dT)25。本发明的方法只需一次漂洗，洗脱时无需额外分离磁珠即可进行后续实验的应用，大大简化了步骤，同时也避免了高温孵育，避免了多次漂洗和洗脱后磁珠分离对高通量自动化操作带来的不便。
本发明具有如下优点：
①本发明偶联Oligo(dT)25的磁性微球和含有poly A的非特异性捕获探针能高效、完全捕获外周血样本中的游离核酸，保证了提取效率，少量样本即可获得足够量的游离核酸；所纯化的游离核酸样本完整、纯净无污染。②所有操作步骤均在室温下进行，易操作；无需酚、氯仿等有毒溶剂抽提，对环境及操作者安全、绿色、友好；无需离心、沉淀等耗时步骤，大大缩短了实验进程，本方法只需一次漂洗，洗脱时无需额外分离磁珠即可将纯化的游离核酸用于后续实验应用，大大简化了步骤，提高了实验效率，且重复性好，更利于高通量自动化操作。③优选的技术方案中，对裂解缓冲液、结合缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液的组成进行了优化，实现了快速裂解，高效稳定结合、高效漂洗和洗脱，大大提高了提取及分离效率。
附图说明
图1实施例1中提取游离核酸后进行文库构建后的Caliper峰图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围，实施例中涉及的试剂，如无特殊说明，可从商业途径获得，所涉及的操作，如无特殊说明，均为常规操作，浓度中的“M”表示“mol/L”，“mM”表示“mmol/L”，wt.％为质量百分比。
实验试剂的配制：
(1)按照0.4-0.8M的氯化苄、8-15mM的乙二胺四乙酸二钠、3-8mM的二硫苏糖醇、0.1-0.5mM的氢氧化钠和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸锂的浓度计算各试剂用量，称取或量取后加去离子水定容并混合均匀，得裂解缓冲液，示例性的或优选的，各组分及浓度如下：氯化苄0.5M、乙二胺四乙酸二钠10mM、二硫苏糖醇5mM、氢氧化钠0.2mM、十二烷基硫酸锂1wt.％。其中，氯化苄可以协助破坏细胞；乙二胺四乙酸二钠可以螯合二价金属离子，从而抑制核酸酶对核酸的降解；二硫苏糖醇作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂，可以进一步增加核酸的稳定性；氢氧化钠主要起碱裂解样本，从而释放核酸的作用；十二烷基硫酸锂协助氢氧化钠进行裂解，同时提供核酸结合的条件，在上述浓度下，裂解快速、彻底，有效保证了后续所得游离核酸DNA的提取效率高，纯度高。
(2)按照3-6M的氯化苄、0.5-1M的盐酸胍、0.5-1.5M的乙酸和5-13wt.％的乙酸钾的浓度计算各试剂用量，称取或量取后加去离子水定容并混合均匀，得结合缓冲液，示例性的或优选的，各组分及浓度如下：氯化苄0.5M、盐酸胍1M、乙酸1M、乙酸钾104.1mg。乙酸和乙酸钾提供缓冲液体系和一定盐离子浓度，盐酸胍和氯化苄提供结合条件，使非特异探针与核酸的复合体能更好与磁珠进行稳定高效结合，保证提取效率。
(3)按照5-15mM的三羟甲基氨基甲烷、0.1-0.3M的氯化苄和0.1-2的乙二胺四乙酸二钠的浓度计算各试剂用量，称取或量取后加去离子水定容并混合均匀，得漂洗缓冲液，示例性的或优选的，各组分及浓度如下：三羟甲基氨基甲烷(pH7.5)10mM、氯化苄0.15M、乙二胺四乙酸二钠1mM，以该组成比例制成的漂洗缓冲液，漂洗效率高，只需一次漂洗即可去除杂质，保证了提取游离核酸的纯净。
实施例1采用磁性微球分离血浆样本中的游离核酸
①将200μL血浆样本加入至无核酸酶的离心管中，然后向离心管中加入450μL裂解缓冲液混合均匀，再加入20μL蛋白酶K，用移液器吹吸或上下颠倒至充分混匀至均匀，并保持10min，得裂解样本；
②向裂解样本中加入100μL结合缓冲液和30μL核酸结合试剂，核酸结合试剂为包含偶联Oligo(dT)25的磁性微球和带有Poly-A的非特异捕获探针的水溶液，其中偶联Oligo(dT)25的磁性微球浓度为0.1-5mg/mL，磁性微球上偶联Oligo(dT)25的量为50-200nmol/g，带有Poly-A的非特异捕获探针浓度为0.5-5nmol/mL，用移液器吹吸或上下颠倒方式混合均匀，室温下静置20min，将离心管置于磁力架上磁吸附1.5min，此时，磁性微球富集在磁铁部位，与上清分离，吸弃上清，得磁珠-核酸复合物，其中，偶联Oligo(dT)25的磁性微球可购买获得，亦可实验室制备，本实施例中选用内核层由磁性四氧化三铁(Fe3O4)颗粒构成的纳米颗粒为磁性微球，非特异捕获探针的序列为L(k)2-d(k)5-L(k)2-d(k)5-L(k)2-dT5dA15，带有Poly-A的非特异捕获探针为委托生物技术公司制备；
③将含有磁珠-核酸复合物的离心管从磁力架上取下，向磁珠-核酸复合物中加入900μL漂洗缓冲液，用移液器吹吸或涡旋振荡的方式将体系混匀，再将离心管置于磁力架上，磁吸附1.5min，吸弃上清，得纯化的磁珠-核酸复合物，最后向纯化的磁珠-核酸复合物中加入60μL洗脱缓冲液，用移液器吹吸混匀，室温孵育5min，期间轻轻晃动使核酸充分洗脱，此时体系中共存磁珠及核酸，但两者呈分离状态，得到纯化的游离核酸，该体系可直接用于应用游离核酸的下游实验，其中的磁珠对核酸检测无影响。
采用上述提取的纯化的游离核酸进行借助PCR试剂盒并按照常规程序进行扩增及文库构建，文库构建的Caliper峰图见图1，图中纵坐标表示荧光值，横坐标表示片段大小(单位为bp)，结果可知本实施例中提取游离核酸的浓度为609.40nmol/L，DNA提取效率高，因为RNA易降解，且所提取的游离核酸在建库过程中无反转录步骤，单链RNA对建库无明显影响，可知上述提取的游离核酸为DAN，无RNA污染。
相比于普通试剂盒或方法需要1-10ml样本，本方法只需200μL样本即可提取足量游离核酸DNA，且可直接用于下游实验，大大减小了样本量；配方优化，实现了快速裂解，高效漂洗和洗脱，整个提取分离过程仅需40min左右，步骤简化，相比目前的2-6h，提取效率大大提高，缩短了实验时间；均在室温下进行，且无需酚、氯仿等有毒溶剂抽提，对环境及操作者安全友好。
实施例2采用磁性微球分离血清样本中的游离核酸
①将150μL血清样本加入至无核酸酶的离心管中，然后向离心管中加入400μL裂解缓冲液混合均匀，再加入15μL蛋白酶K，用移液器吹吸或上下颠倒至充分混匀至均匀，并保持6min，得裂解样本；
②向裂解样本中加入100μL结合缓冲液和35μL核酸结合试剂，核酸结合试剂为包含偶联Oligo(dT)25的磁性微球和带有Poly-A的非特异捕获探针的水溶液，用移液器吹吸或上下颠倒方式混合均匀，室温下静置15min，将离心管置于磁力架上磁吸附1min，此时，磁性微球富集在磁铁部位，与上清分离，吸弃上清，得磁珠-核酸复合物，其中非特异捕获探针的序列为L(k)2-d(k)5-L(k)2-d(k)5-L(k)2-dT5dA15；
③将含有磁珠-核酸复合物的离心管从磁力架上取下，向磁珠-核酸复合物中加入700μL漂洗缓冲液，用移液器吹吸或涡旋振荡的方式将体系混匀，再将离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清，得纯化的磁珠-核酸复合物，最后向纯化的磁珠-核酸复合物中加入70μL洗脱缓冲液，用移液器吹吸混匀，室温孵育5min，期间轻轻晃动使核酸充分洗脱，得到含有磁性微球的纯化的游离核酸，可直接用于下一步检测。
采用上述提取的纯化的游离核酸进行借助PCR试剂盒并按照常规程序进行扩增，结果发现本实施例中提取游离核酸的浓度为589.82nmol/L，提取效率高。
实施例3采用磁性微球分离血浆样本中的游离核酸
①将100μL血浆样本加入至无核酸酶的离心管中，然后向离心管中加入400μL裂解缓冲液混合均匀，再加入15μL蛋白酶K，用移液器吹吸或上下颠倒至充分混匀至均匀，并保持10min，得裂解样本；
②向裂解样本中加入80μL结合缓冲液和20μL核酸结合试剂，核酸结合试剂为包含偶联Oligo(dT)25的磁性微球和带有Poly-A的非特异捕获探针的水溶液，用移液器吹吸或上下颠倒方式混合均匀，室温下静置15min，将离心管置于磁力架上磁吸附1min，吸弃上清，得磁珠-核酸复合物，其中非特异捕获探针的序列为L(k)2-d(k)5-L(k)2-d(k)5-L(k)2-dT5dA15；
③将含有磁珠-核酸复合物的离心管从磁力架上取下，向磁珠-核酸复合物中加入700μL漂洗缓冲液，用移液器吹吸或涡旋振荡的方式将体系混匀，再将离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清，得纯化的磁珠-核酸复合物，最后向纯化的磁珠-核酸复合物中加入60μL洗脱缓冲液，用移液器吹吸混匀，室温孵育5min，期间轻轻晃动使核酸充分洗脱，得到纯化的游离核酸。
采用上述提取的纯化的游离核酸进行借助PCR试剂盒并按照常规程序进行扩增，结果发现本实施例中提取游离核酸的浓度为616.40nmol/L，提取效率高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒，包括裂解缓冲液、蛋白酶K、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，其特征在于，还包括偶联Oligo(dT)25的磁性微球和含有Poly-A的非特异捕获探针，非特异捕获探针的序列为L(k)2-d(k)5-L(k)2-d(k)5-L(k)2-dT5dA15。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解缓冲液为组成中包括浓度为0.4-0.8M的氯化苄、8-15mM的乙二胺四乙酸二钠、3-8mM的二硫苏糖醇、0.1-0.5mM的氢氧化钠和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸锂的水溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液为组成中包括浓度为3-6M的氯化苄、0.5-1M的盐酸胍、0.5-1.5M的乙酸和5-13wt.％的乙酸钾的水溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗缓冲液为组成中包括浓度为5-15mM的三羟甲基氨基甲烷、0.1-0.3M的氯化苄和0.1-2的乙二胺四乙酸二钠的水溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱缓冲液为浓度5-15mM的三羟甲基氨基甲烷的水溶液。
6.一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
①将50-300μL外周血的样本加入至无核酸酶的离心管中，加入400-600μL裂解缓冲液和10-25μL蛋白酶K，混匀反应5-20min，得裂解样本；
②向裂解样本中加入80-150μL结合缓冲液和20-50μL包含偶联Oligo(dT)25的磁性微球及带有Poly-A的非特异捕获探针的核酸结合试剂，混匀后室温静置15-30min，将离心管于磁力架上磁吸附1-3min，吸弃上清，得磁珠-核酸复合物，其中非特异捕获探针的序列为L(k)2-d(k)5-L(k)2-d(k)5-L(k)2-dT5dA15；
③向磁珠-核酸复合物中加入700-1000μL漂洗缓冲液，混匀后磁吸附1-3min，吸弃上清，得纯化的磁珠-核酸复合物，向纯化的磁珠-核酸复合物中加入50-100μL洗脱缓冲液，晃动下室温孵育3-8min，得纯化的游离核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述所述裂解缓冲液为组成中包括浓度为0.4-0.8M的氯化苄、8-15mM的乙二胺四乙酸二钠、3-8mM的二硫苏糖醇、0.1-0.5mM的氢氧化钠和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸锂的水溶液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述结合缓冲液为组成中包括浓度为3-6M的氯化苄、0.5-1M的盐酸胍、0.5-1.5M的乙酸和体积比5-13％的乙酸钾的水溶液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述漂洗缓冲液为组成中包括浓度为5-15mM的三羟甲基氨基甲烷、0.1-0.3M的氯化苄和0.1-2的乙二胺四乙酸二钠的水溶液。所述试剂盒中还包括洗脱液。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液为浓度5-15mM的三羟甲基氨基甲烷的水溶液。
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