CN114058616A - 一种基于磁珠法快速提取血浆游离核酸的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于磁珠法快速提取血浆游离核酸的试剂盒。所述试剂盒包括：裂解液、去蛋白漂洗液、去盐漂洗液、洗脱液及磁珠；所述裂解液含有2‑6M离液剂、0.05‑10%十二烷基硫酸钠、50‑200mM乙二胺四乙酸、10‑200mM三羟甲基氨基甲烷、50‑500mM氯化钠、0.1%‑5%十二烷基苯磺酸钠、1%‑5%月桂醇聚醚硫酸酯钠和5%‑15%非离子表面活性剂。本发明采用含有独特的裂解液组分及磁珠，无需加入蛋白酶K，能够有效提高核酸产量，从而提高下游NGS建库产量。

Description

一种基于磁珠法快速提取血浆游离核酸的试剂盒

技术领域

本发明提供一种基于磁珠法快速提取血浆游离核酸的试剂盒，属于生物医药领域。

背景技术

血浆游离核酸，是指存在于人体血浆中游离在细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。游离核酸检测广泛应用于无创产前筛查、肿瘤诊断及各类疾病检验中。

目前市场上对于从血浆中提取游离核酸的方法有很多，根据核酸提取原理分为沉淀法、柱膜离心法、磁珠法等，根据提取通量高低分为手工法和仪器法。

沉淀法：采用酚氯仿等有机试剂提取核酸。

柱膜离心法：DNA在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐、高pH值时DNA从硅胶膜上洗脱下来。

磁珠法：以超顺磁性的纳米磁性粒子为基质，这种磁性粒子在高浓度离液剂的条件下可通过氢键和静电特异的吸附核酸，而蛋白质或其它非特异吸附的少量杂质经洗涤被去除，最后用低盐缓冲液或 RNase Free ddH2O 洗脱核酸。

手工法：操作步骤均由手动操作。

仪器法：基于磁棒法原理的自动核酸提取仪。

传统的游离核酸提取试剂盒，通常采用沉淀法和柱膜离心法, 沉淀法需采用酚氯仿抽提，操作复杂，试剂毒性大，不宜使用。采用柱膜法需要配合离心机使用，操作复杂，核酸得率较低，且不能实现高通量核酸提取。

发明内容

本发明基于磁珠法进行核酸提取，提取试剂无酚氯仿等有机试剂，含有独特的裂解液组分，能够有效提高核酸质量。采用本发明独特核酸提取试剂，能够手工提取0.1ml-10ml的血浆，并且搭配32通道核酸提取仪可提取0.1ml-0.6ml的血浆游离核酸，搭配24通道核酸提取仪可提取1ml-8ml的血浆游离核酸，能够满足不同客户的需求。

本发明的目的是提供一种基于磁珠法提取血浆游离核酸的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括：裂解液、去蛋白漂洗液、去盐漂洗液、洗脱液及磁珠；

所述裂解液含有2-6M离液剂、0.05-10%（100ml的裂解液中含有0.05-10g的十二烷基硫酸钠）十二烷基硫酸钠、50-200mM的乙二胺四乙酸、10-200mM的三羟甲基氨基甲烷、50-500mM 氯化钠、0.1%-5%十二烷基苯磺酸钠、1%-5%月桂醇聚醚硫酸酯钠和5%-15%非离子表面活性剂。

具体地，所述裂解液含有2-6M离液剂、1-5%（m/v）十二烷基硫酸钠、50-150mM乙二胺四乙酸、80-120mM三羟甲基氨基甲烷、80-120mM 氯化钠、1%-3%（m/v）的十二烷基苯磺酸钠、2%-4%（m/v）月桂醇聚醚硫酸酯钠和5%-15%非离子表面活性剂；

所述离液剂可为盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素中的一种或几种的混合物，具体可为异硫氰酸胍；

所述非离子表面活性剂可选自：TritonX-100、Tween-20、Tween-80、NP40中的至少一种，具体可为TritonX-100；

更优选地，所述裂解液由以下物质组成：3mol/L异硫氰酸胍，2%十二烷基硫酸钠，100mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷，100mmol/L 氯化钠，2%十二烷基苯磺酸钠，2.5%月桂醇聚醚硫酸酯钠，8% TritonX-100；

所述去蛋白漂洗液含有1-3M胍盐、0.1-1M氯化钠和80%乙醇（V/V）；

所述胍盐具体可为异硫氰酸胍、盐酸胍的一种或者两种的混合物；

优选地，所述去蛋白漂洗液由以下物质组成：2mol/L异硫氰酸胍、500mmol/L氯化钠、80%乙醇（V/V）。

所述去盐漂洗液为70%-80%乙醇（V/V）；

优选地，所述去盐漂洗液为80%乙醇（V/V）；

所述洗脱液为5-20mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.0；

优选地，所述洗脱液为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH8.0。

所述磁珠为一种结合核酸特异性高的硅羟基磁珠，具体可为磁珠K，货号M11，苏州星谱生物科技有限公司的产品。

本发明的试剂盒含有独特组成的裂解液和磁珠，对血浆游离核酸能够高效裂解结合，能够提高核酸质量。

本发明还提供一种使用上述试剂盒提取血浆游离核酸的方法。

本发明所提供的提取血浆游离核酸的方法，为手工法提取血浆游离核酸的方法或采用自动化核酸提取仪提取血浆游离核酸的方法。

所述手工法提取血浆游离核酸的方法，包括如下步骤：

1）在血浆中加入磁珠和裂解液，混匀，放置，磁力架吸附弃上清；

2）向步骤1）磁珠中加入去蛋白漂洗液，混匀，磁力架吸附弃上清；

3）向步骤2）磁珠中加入去盐漂洗液，混匀，磁力架吸附弃上清；

4）向步骤3）磁珠中加入洗脱液，加热，洗脱核酸，得到血浆游离核酸；

上述方法步骤1）中，血浆与磁珠、裂解液的配比可为0.1-1ml：30ul：0.4-1ml，具体可为300ul：30ul：400ul，其中磁珠浓度为100mg/ml；

所述混匀具体可为涡旋混匀，时间可为30s；

放置的时间可为5-20min，具体可为10min；

步骤2）中加入的去蛋白漂洗液与步骤1）中的血浆的配比可为0.5-1ml：0.1-1ml，具体可为500ul：300ul；

所述混匀具体可为涡旋混匀，时间可为30s；

步骤3）中加入的去盐漂洗液与步骤1）中的血浆的配比可为0.5-1ml：0.1-1ml，具体可为600ul：300ul；

所述混匀具体可为涡旋混匀，时间可为30s；

步骤4）中加入的洗脱液与步骤1）中的血浆的配比可为0.06-0.1ml：0.1-1ml，具体可为60ul：300ul；

所述加热为采用56度水浴加热10min。

采用自动化核酸提取仪提取血浆游离核酸的方法，包括如下步骤：

1）将试剂加入到预分板中，1、7列加入磁珠悬浮液（磁珠悬浮液除了含有磁珠还有磷酸盐缓冲液，300ul血浆样本需要30ul磁珠，磁珠浓度为100mg/ml），2、8列加入400ul裂解液，3、9列加入500ul去蛋白漂洗液，4、10列加入600ul去盐漂洗液，6、12列加入60ul洗脱液；

2）将300ul血浆样本直接加入预分板2、8列中；

3）将预分板放入自动核酸提取仪中，运行程序，吸出核酸洗脱液，即得血浆游离核酸。

相对于沉淀法涉及酚氯仿有毒试剂，本发明采用磁珠法，不含酚氯仿试剂，安全无毒。相对于柱膜离心柱法的操作复杂，不易实现通量，本发明采用磁珠法，可提供手动法和高通量机提两种方法，并且针对客户不同样本起始量的要求可以提供不同的完整的解决方案。

针对目前市场上同类磁珠法提取血浆游离核酸得率低的问题，本发明采用含有独特的裂解液组分及特殊内嵌结构的磁珠，无需加入蛋白酶K，能够有效提高核酸产量，从而提高下游NGS建库产量。

本发明利用基于磁珠的快速提取血浆游离核酸的试剂盒提取核酸方法操作简便，不含酚氯仿等有毒试剂，可实现手工操作，并且可整合各种自动化核酸提取仪，步骤简便，只需要加入样品即可上机提取获得核酸，在最大程度上简化了实验操作步骤和保证了实验人员的安全。针对医院临床样本较多时对核酸提取速度和通量的需求和对核酸提取质量的要求，所以研发毒性低、操作简便、样本通量高、核酸提取效果佳的核酸提取方法意义重大。

本发明的利用基于磁珠的快速提取血浆游离核酸的试剂盒快速提取细菌基因组的方法，采用胍盐等离液剂与特定组成和配比的表面活性剂共同裂解的方法，促使核蛋白体解体，使核酸酶失活，使释放出的核酸不被降解，达到裂解结合一步完成的目的，并且搭配使用我们独特内嵌结构的磁珠，不需要酚氯仿试剂，只需要裂解结合、漂洗、洗脱三个步骤，就可以提取高质量的血浆游离核酸，核酸质量高。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的试剂盒与竞品试剂盒提取的血浆游离核酸Agilent2100结果。注：1和2是血浆样本1，其中1是实施例结果，2是竞品结果；3和4是血浆样本2，其中3是实施例结果，4是竞品结果。

图2为本发明实施例1制备的试剂盒与竞品试剂盒提取核酸进行DNA构建的文库Agilent 2100结果。注：5和6是血浆样本1，其中5是实施例结果，6是竞品结果；7和8是血浆样本2，其中7是实施例结果，8是竞品结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、利用本发明磁珠法提取血浆游离核酸的试剂盒手工提取血浆游离核酸

1.1本实施例利用基于磁珠的快速提取血浆游离核酸的试剂盒手工提取核酸的试剂盒中具体试剂包括：

1）裂解液：3mol/L异硫氰酸胍，2%十二烷基硫酸钠，100mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/L三羟甲基氨甲烷，100mmol/L 氯化钠，2%十二烷基苯磺酸钠，2.5%月桂醇聚醚硫酸酯钠，8% TritonX-100；

2）去蛋白漂洗液：2mol/L异硫氰酸胍、500mmol/L氯化钠、80%乙醇（V/V）；

3）去盐漂洗液：80%乙醇（V/V）；

4）核酸洗脱液：10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH8.0。

1.2 一种手工法利用基于磁珠的快速提取血浆游离核酸的试剂盒提取血浆游离核酸的方法，包括以下步骤：

1）取300ul血浆样本，加入30ul磁珠（磁珠K，货号M11，济凡子公司苏州星谱生产，磁珠浓度为100mg/ml，溶剂为磷酸盐缓冲液）和400ul裂解液，涡旋振荡30s，室温放置10min，磁力架吸附1min，弃上清；加入500uL的去蛋白漂洗液，涡旋混匀30s，磁力架吸附1min，弃上清；加入600uL的去盐漂洗液，涡旋混匀30s，磁力架吸附1min，弃上清；加入60uL的核酸洗脱液，56℃水浴加热10min洗脱核酸；

2） 按照竞品试剂盒的说明书继续操作，竞品试剂盒是天根生化的磁珠法血浆游离核酸提取试剂盒；

3）Qubit测定核酸浓度，Agilent2100测定核酸片段大小，相同起始量核酸进行建库，DNA建库试剂盒测定核酸是否抑制建库；实验例方法提取的核酸浓度及DNA建库产量结果见表1，实验例方法与竞品试剂盒提取的核酸Agilent 2100结果见图1，实验例试剂盒与竞品试剂盒提取核酸进行DNA构建的文库Agilent 2100结果见图2，结果表明本实验例试剂盒方法提取血浆能够提取正确大小的游离核酸，提取后核酸能够成功建库，且核酸产量、建库产量均优于竞品。

表1 核酸产量及DNA建库产量

参照实施例1中1.2的操作，所得核酸产量、DNA建库产量如表2。

实施例2

参照实施例1配制试剂，其中裂解液含有1%十二烷基苯磺酸钠，3.5%月桂醇聚醚硫酸酯钠，其他组成相同；

参照实施例1中1.2的操作，所得核酸产量、DNA建库产量如表2。

实施例3

参照实施例1配制试剂，其中裂解液含有3%十二烷基苯磺酸钠，1.5%月桂醇聚醚硫酸酯钠，其他组成相同；

参照实施例1中1.2的操作，所得核酸产量、DNA建库产量如表2。

对比例1

参照实施例1配制试剂，其中裂解液含有4.5%十二烷基苯磺酸钠，不含月桂醇聚醚硫酸酯钠，其他组成相同；

对比例2

参照实施例1配制试剂，其中裂解液含有4.5%月桂醇聚醚硫酸酯钠，不含十二烷基苯磺酸钠，其他组成相同；

参照实施例1中1.2的操作，所得核酸产量、DNA建库产量如表2。

表2 核酸产量及DNA建库产量

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (9)

1.一种基于磁珠法提取血浆游离核酸的试剂盒，包括：裂解液、去蛋白漂洗液、去盐漂洗液、洗脱液及磁珠：所述裂解液含有2-6M离液剂、0.05-10%十二烷基硫酸钠、50-200mM的乙二胺四乙酸、10-200mM的三羟甲基氨基甲烷、50-500mM 氯化钠、0.1%-5%十二烷基苯磺酸钠、1%-5%月桂醇聚醚硫酸酯钠和5%-15%非离子表面活性剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述离液剂为盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素中的一种或几种的混合物；

所述非离子表面活性剂选自：TritonX-100、Tween-20、Tween-80、NP40中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述裂解液含有2-6M离液剂、1-5%十二烷基硫酸钠、50-150mM乙二胺四乙酸、80-120mM三羟甲基氨基甲烷、80-120mM 氯化钠、1%-3%十二烷基苯磺酸钠、2%-4%月桂醇聚醚硫酸酯钠和5%-15%的非离子表面活性剂。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述去蛋白漂洗液含有1-3M胍盐、0.1-1M氯化钠和80%乙醇,V/V；

其中，所述胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍的一种或两种的混合物。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述去盐漂洗液为70%-80%乙醇，V/V。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述洗脱液为5-20mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.0。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述磁珠为结合核酸特异性高的硅羟基磁珠。

8.一种采用权利要求1-7中任一项所述的试剂盒手工法提取血浆游离核酸的方法，包括如下步骤：

1）在血浆中加入磁珠和裂解液，混匀，放置，磁力架吸附弃上清；

2）向步骤1）磁珠中加入去蛋白漂洗液，混匀，磁力架吸附弃上清；

3）向步骤2）磁珠中加入去盐漂洗液，混匀，磁力架吸附弃上清；

4）向步骤3）磁珠中加入洗脱液，加热，洗脱核酸，得到血浆游离核酸。

9.一种采用权利要求1-7中任一项所述的试剂盒通过自动化核酸提取仪提取血浆游离核酸的方法，包括如下步骤：

1）将试剂加入到预分板中，1、7列加入磁珠悬浮液，2、8列加入裂解液，3、9列加入去蛋白漂洗液，4、10列加入去盐漂洗液，6、12列加入洗脱液；

2）将血浆样本直接加入预分板2、8列中；

3）将预分板放入自动核酸提取仪中，运行程序，吸出核酸洗脱液，即得血浆游离核酸。

Images