CN115612686A - 一种核酸提取磁珠的泡腾片、合成方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种核酸提取磁珠的泡腾片、合成方法及其应用。将核酸提取磁珠与保护剂、崩解剂、防腐剂等多种不同的组分，在特定压力下压制成不同的泡腾片，并成功应用于核酸提取试剂中。同时，通过老化实验结果显示，该磁珠泡腾片具有良好的稳定性。

Description

一种核酸提取磁珠的泡腾片、合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，特别涉及一种核酸提取磁珠的泡腾片、合成方法及其应用。
背景技术
目前，市场上常规的核酸提取用磁珠的类型为水分散溶液，该产品类型存在显著的存储、运输问题，即需要低温条件（2-8 ℃）存储、存储容器密封性要求高，且液体试剂质量大、可选择的运输方式有限（液体无法空运）。对于出口市场，成本、时效均是重要的考量因素。
仅将产品磁珠制成粉末存在较大问题，即干粉在溶液中自主分散困难。在主要的应用场景（核酸提取）下，而磁珠试剂的重悬分散性、速度等会影响磁珠的性能和使用体验。另一方面，在核酸提取试剂使用过程中，磁珠的用量很小，每个样本的提取仅有0.5-2 mg，磁珠的干粉难以准确称量、分配。
磁珠泡腾片有一篇文献报道（Analytica Chimica Acta, 2016, 118-127），该文献报道了将Fe3O4纳米颗粒（每个泡腾片中磁纳米颗粒含量10-20 mg）和碳酸钠、磷酸二氢钠制备的泡腾片，在离子液体的辅助下应用于水中的有机农药残留的萃取回收，利用的是“相似相溶原则”，水溶液中的离子强度对该过程的影响有限。直接用此方法制备的核酸提取磁珠的泡腾片（每个泡腾片磁珠含量0.5-2 mg）在核酸提取试剂中无法应用，因为泡腾片会引入大量的盐，影响到水中的离子分布，进而影响了依靠“静电吸附原则”的核酸提取过程。另一方面，我们观测到，该方法制备的泡腾片磁珠，无法长时间保存，会出现磁珠氧化，性能下降等情况。
发明内容
为了改善上述技术问题，本发明提供一种核酸提取磁珠的泡腾片、合成方法及应用。
第一方面，本发明提供一种核酸提取磁珠的泡腾片，包括以下组分：
核酸提取磁珠、保护剂、崩解剂；
其中，崩解剂包括酸剂和碱剂。
在一些实施方案中，崩解剂中的碱剂选自碳酸盐和碳酸氢盐中的一种或多种；其中，碳酸盐和碳酸氢盐是无机盐；
优选地，碳酸盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸钙、碳酸镁中的一种或多种，和/或碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢镁中的一种或多种；
更优选地，崩解剂中的碱剂选自碳酸钠和/或碳酸氢钠。
在一些实施方案中，崩解剂中的酸剂选自无机酸、有机酸、和/或无机盐中的一种或多种；优选地，无机盐为强酸弱碱盐；优选地，无机盐选自磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等磷酸盐中的一种或多种，和/或有机酸选自柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、酒石酸等中的一种或多种；
更优选地，无机酸选自磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钾，有机酸选自柠檬酸、苹果酸和/或酒石酸；
最为优选地，崩解剂中的酸剂选自柠檬酸、苹果酸和/或酒石酸。
在一些实施方案中，崩解剂中作为碱剂或酸剂的无机盐组分含量小于60%，优选为40%-60%，更优选为50%-60%。
在一些实施方案中，崩解剂中的碱剂与酸剂的质量比为20-60:40-80，优选为40-60:60-40，更优选为40:60。
在一些实施方案中，崩解剂用量的比例为10-95%，优选为90-95%。
在一些实施方案中，所述保护剂为抗氧化或防潮保护剂。
在一些实施方案中，所述抗氧化保护剂化或防潮保护剂选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨酯、BSA（牛血清蛋白）、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、二苯酮、水杨酸乙基己酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、西诺沙酯、甲氧基肉桂酸辛酯、对-胺基苯甲酸等中的一种或多种，优选为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨酯中的一种或多种；
和/或，保护剂用量的比例为0.1-5%，优选为1-2%。
在一些实施方案中，核酸提取磁珠选自硅羟基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠等中的至少一种，优选为硅羟基磁珠、羧基磁珠中的至少一种，更优选为硅羟基磁珠；
和/或，核酸提取磁珠的粒径范围选自100-1200 nm；
和/或，核酸提取磁珠的表面材料选自二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸、多巴胺、聚羧甲基甘油醛、聚氨酯、聚甲基丙烯酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯等不同的材料中的一种或多种，优选为二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸；
和/或，核酸提取磁珠的用量比例为0.1-5%，优选为1-2%。
在一些实施方案中，上述核酸提取磁珠的泡腾片还包括防腐剂。
在一些实施方案中，防腐剂选自叠氮化钠、山梨醇、山梨酸钾、苯氧乙醇、多菌清、百菌灵中的一种或几种，优选为叠氮化钠和/或山梨酸钾；
和/或，防腐剂的用量比例为0-3 %，优选为1%。
在一些实施方案中，核酸提取磁珠、保护剂、崩解剂、防腐剂的质量比为1:1:100:1。
在一些实施方案中，泡腾片的直径大小范围为1-15 mm，优选为3-6 mm，
和/或，泡腾片的厚度为3-5 mm，优选为3 mm；
和/或，泡腾片的紧实程度以硬度表征，范围为10-200N，优选的硬度为100N。
在一些实施方案中，泡腾片压制时压力范围为0.1-5 MPa，优选为0.5 Mpa；
和/或，泡腾片压制时间范围为5-20s，优选为10s。
第二方面，本发明提供上述核酸提取磁珠的泡腾片的合成方法，包括以下步骤：
将各组分分别用玛瑙研钵碾碎后，按照一定比例混合均匀，利用压片机在一定压力下压制成泡腾片。
第三方面，本发明提供上述核酸提取磁珠的泡腾片在核酸提取中的应用。
在一些实施方案中，核酸提取的样本选自拭子、全血、血浆、血清、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液、土壤、粪便、细菌、脑脊液、耳槽、精液等中的至少一种。
在一些实施方案中，拭子为口腔拭子。
在一些实施方案中，核酸提取的样本为全血、血清、血浆。
在一些实施方案中，核酸为DNA或RNA。
在一些实施方案中，核酸为新型冠状病毒核酸。
第四方面，本发明提供一种核酸提取的试剂盒，包括上述核酸提取磁珠的泡腾片。
有益效果
本发明主要是将核酸提取磁珠与保护剂、崩解剂、防腐剂等多种不同的组分，在特定压力下压制成不同的泡腾片，并成功应用于核酸提取试剂中。同时，通过老化实验结果显示，该磁珠泡腾片具有良好的稳定性。
附图说明
图1显示了磁珠泡腾片在水中的不同崩解阶段和情况。
图2显示了磁珠泡腾片、磁珠原分散液在37摄氏度恒温烘箱中处理，不同时间取出进行新冠假病毒RNA提取的稳定性实验结果。
图3显示了磁珠泡腾片、磁珠原分散液在60摄氏度恒温烘箱中处理，不同时间取出进行新冠假病毒RNA提取的稳定性实验结果。
图4显示了加入柠檬酸的泡腾片在空气中10min的潮解情况（未加入保护剂和防腐剂）。
图5显示了加入柠檬酸的泡腾片在室温下放置0、1、3天后的外观图（未加入保护剂和防腐剂）。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1：崩解速度
按下表1中所示试剂分别用玛瑙研钵研磨破碎后，按表中添加量混合均匀用压片机在0.5 MPa压力下压制10 s时间，制成直径6 mm的泡腾片片剂。将磁珠泡腾片分别投入水中，静置等待崩解，录像观测泡腾片崩解、分散情况。
表1 不同核酸提取磁珠的泡腾片的组分和崩解时间
Figure DEST_PATH_IMAGE001
崩解时间的结果如表1所示，序号1-6号不同核酸提取磁珠的泡腾片的崩解时间分别为3542、3038、68、43、62、80秒。
崩解分散情况如图1所示，从左至右，依次为序号1-6号。
分析上述实验结果可知：
1) 不同崩解剂造成磁珠泡腾片的崩解速度差异明显：以碳酸钠与磷酸二氢盐及磷酸一氢盐等作为崩解剂的泡腾片（序号1-2），在水中崩解困难，分散性极差；以碳酸氢钠与柠檬酸、苹果酸、酒石酸等作崩解剂后的泡腾片（序号4-6）在水中崩解迅速，分散更为均匀。
2) 添加保护剂、防腐剂可能造成磁珠泡腾片的崩解速度减缓，但通过上述实验，保护剂和防腐剂带来的崩解速度的减缓仍在可控可预期的范围内，且崩解后分散性、均匀性无显著衰减。
实施例2：新冠2019-nCov假病毒RNA提取
将40.3 mg Na2CO3、59.7 mg柠檬酸、1 mg硅羟基磁珠、1 mg聚乙二醇和1 mg山梨酸钾用玛瑙研钵研磨粉碎，混合后以0.5 MPa压力压制10 s形成直径6 mm的磁珠泡腾片1。
将52.9 mg NaHCO3、47.1 mg柠檬酸、1 mg硅羟基磁珠、1 mg聚氨酯和1 mg叠氮化钠以相同方式制得磁珠泡腾片2。
将磁珠泡腾片投入不含磁珠的裂解结合液中，静置等待崩解分散。将已添加新冠2019-nCov假病毒( 添加后终浓度为105 copies/mL ) 的口腔拭子样本加入泡腾片已崩解分散完成的裂解结合液中，经裂解、结合、去蛋白、盐洗涤、洗脱的磁珠法新冠核酸提取流程后，取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增。将结果与磁珠原分散液、阴性对照，进行对比。
磁珠法新冠核酸提取流程参照市售产品：MAGBETTER® 磁珠法病毒核酸提取试剂盒——MNAPure Virus RNA kit中说明书所述提取流程。
表2中的磁珠原分散液的组分为：硅羟基磁珠的水分散液；阴性对照为ddH2O。
表2新冠2019-nCov假病毒核酸提取结果
Figure 12753DEST_PATH_IMAGE002
结果显示：该磁珠泡腾片可在新冠2019-nCov假病毒RNA提取实验中正常使用，且提取性能与含磁珠的原分散液相当。
实施例3：不同种类磁珠的新冠2019-nCov假病毒RNA提取对比
分别将崩解剂1(40.3 mg Na2CO3)、崩解剂2(59.7 mg柠檬酸)、保护剂(1 mg聚乙二醇)和防腐剂(1 mg山梨酸钾)用瑙研钵研磨粉碎，分别与1 mg硅羟基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠混合均匀，按实施例2中流程进行新冠假病毒RNA提取，取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增。将结果进行对比。
表3不同种类磁珠的新冠2019-nCov假病毒RNA提取
Figure DEST_PATH_IMAGE003
结果显示：
1) 硅羟基、羧基和氨基磁珠均可在泡腾片环境下进行新冠假病毒RNA提取；
2) 此条件下，羧基磁珠和氨基磁珠的提取性能均较硅羟基磁珠差，且羧基磁珠重复性略低于其他两款磁珠；
3) 硅羟基磁珠的提取性能最好，与含磁珠的原分散液提取性能相当。
实施例4：磁珠泡腾片应用不同试剂盒提取
将40.3 mg Na2CO3、59.7 mg柠檬酸、一定量的硅羟基磁珠、1 mg聚乙二醇和1 mg山梨酸钾用玛瑙研钵研磨粉碎，混合均匀用压片机在0.5 MPa压力下压制10 s时间，制成泡腾片。
将磁珠泡腾片分别将口腔拭子DNA提取试剂盒、全血DNA提取试剂盒和植物DNA提取试剂盒中的磁珠进行替换，等待泡腾片崩解分散后，使用对应试剂盒内的试剂及对应样本，依据试剂盒说明书流程进行样本提取。使用NanoDrop对洗脱液进行结果测定。结果与原产品分散液（含磁珠）进行对比。
表4磁珠泡腾片应用不同试剂盒提取
Figure 382423DEST_PATH_IMAGE004
结果显示：
1) 磁珠泡腾片在口腔拭子DNA提取试剂盒、全血DNA提取试剂盒和植物DNA提取试剂盒中均可正常进行提取；
2) 磁珠泡腾片在相对原磁珠含量较高的情况下，对样本核酸的提取量均较原产品高。
实施例5：稳定性测试
将每片40.3 mg Na2CO3、59.7 mg柠檬酸、1 mg硅羟基磁珠、1 mg聚乙二醇和1 mg山梨酸钾用玛瑙研钵研磨粉碎，混合均匀用压片机在0.5 MPa压力下压制10 s时间，制成泡腾片。将半数磁珠泡腾片置于37摄氏度恒温烘箱中，其余磁珠泡腾片置于60摄氏度恒温烘箱中，密封静置。置于37摄氏度恒温烘箱中的磁珠泡腾片分别在0、1、3、5、7、14、21、28、56、84、112、140、168和196天时取出进行新冠假病毒RNA提取测试，取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增，进行稳定性(老化)测试。置于60摄氏度恒温烘箱中的磁珠泡腾片分别在0、1、3、5、7、14、21和28天时取出进行新冠假病毒RNA提取测试，取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增，进行稳定性(老化)测试。将结果进行对比。
结果如图2-3所示：磁珠泡腾片在37摄氏度下密闭放置196天，即6个月内性能没有下降，且泡腾片未发生明显的吸潮、氧化及变色；磁珠泡腾片在60摄氏度下密闭放置28天，即4周内性能无明显下降，且泡腾片未发生明显的吸潮、氧化及变色。
对比例1. 常规泡腾片的崩解实验
按表5中所示试剂（崩解剂和硅羟基磁珠）分别用玛瑙研钵研磨破碎后，按表中添加量混合均匀用压片机在0.5 MPa压力下压制10 s时间，制成直径6 mm的泡腾片片剂。将泡腾片分别投入水中，静置等待崩解，录像观测泡腾片崩解、分散情况。由表5可知：不同崩解剂崩解的时间差异显著。
表5 常规泡腾片的配方和崩解时间
Figure DEST_PATH_IMAGE005
吸潮实验：将上述表5中的序号1和3制成泡腾片后，敞开静置于气温为29.7℃、相对湿度为44.2%的实验室环境中；结果如图4所示，加入柠檬酸的泡腾片易吸潮。
对比例2.常规泡腾片的核酸提取实验
将表5中的常规磁珠泡腾片投入不含磁珠的裂解结合液中，静置等待崩解分散。将已添加新冠2019-nCov假病毒( 添加后终浓度为105 copies/mL ) 的口腔拭子样本加入泡腾片已崩解分散完成的裂解结合液中，经裂解、结合、去蛋白、盐洗涤、洗脱的磁珠法新冠核酸提取流程后，取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增。将结果与磁珠原分散液、阴性对照，进行对比。
磁珠法新冠核酸提取流程参照市售产品：MAGBETTER® 磁珠法病毒核酸提取试剂盒——MNAPure Virus RNA kit中说明书所述提取流程。
表6中，序号2-9分别对应于表5中的序号1-8的泡腾片；序号1磁珠原分散液的组分为：硅羟基磁珠的水分散液；阴性对照为ddH2O。
表6核酸提取效果
Figure DEST_PATH_IMAGE007
* 中国食品药品检定研究院提供的新型冠状病毒（2019-nCov）的假病毒质控品作为样本，检测试剂：nCOV-2019荧光定量PCR试剂。
对比例3. 泡腾片放置不同时间的核酸提取效果
表7 泡腾片放置不同时间的核酸提取效果
Figure 286794DEST_PATH_IMAGE008
* 中国食品药品检定研究院提供的新型冠状病毒（2019-nCov）的假病毒质控品作为样本，检测试剂：nCOV-2019荧光定量PCR试剂。
上述表7的2、3、4号泡腾片实例均取自表6中的序号4泡腾片实例，在制片后立即密封存放于试剂瓶中；序号1磁珠原分散液的组分为：硅羟基磁珠的水分散液；阴性对照为ddH2O。
分析表6：核酸提取效果显示，即使磁珠量增加到原磁珠分散液中的磁珠量的2倍，使用泡腾片进行核酸提取的性能仍然较磁珠原分散液差，其中仅3、4、6、7号数据有阳性检出。此外，如图4所示，序号1和3的泡腾片在空气中易潮解，约10 min就出现坍塌、裂开等，不易储存。
分析表7：所制泡腾片经过储存稳定性测试，其在室温下存放3天，出现磁珠性能降低的情况。图5显示了序号2-4泡腾片，在缺少保护剂、防腐剂的保护下，存放一定时间后，泡腾片出现了氧化、变色的情况。
结论：
崩解速度：比较实施例1(表1)与对比例1(表5)中的各配方崩解速度，可知本专利所述的一些实施例在包含了多种非崩解剂组分后，其崩解速度、分散性能仍能与常规泡腾片接近，该速度可满足应用过程中快速、均匀的需求。
提取性能：比较实施例2、3(表2、3)与对比例2(表6)中的新冠假病毒RNA提取效果，可知本发明的实施例加入保护剂和防腐剂后，核酸提取性能较不含保护剂和防腐剂的泡腾片(对比例2)显著提升，与溶剂型磁珠分散液提取性能相当。实施例4的数据进一步表明，本发明的核酸提取磁珠可应用于各类常见的试剂盒。
稳定性：比较实施例5(图2-3)与对比例3(表7)中的稳定性数据(主要以外观和核酸提取性能作为表征)，可知本发明的实施例加入保护剂和防腐剂后，稳定性能显著提升，存储有效期可满足相关市场中对于产品运输、存储的有关需求。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核酸提取磁珠的泡腾片，其特征在于，包括以下组分：
核酸提取磁珠、保护剂、崩解剂；
其中，崩解剂包括酸剂和碱剂。
2.根据权利要求1所述的核酸提取磁珠的泡腾片，其特征在于，
崩解剂中的碱剂选自碳酸盐和碳酸氢盐中的一种或多种，
其中，碳酸盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸钙、碳酸镁中的一种或多种，和/或碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢镁中的一种或多种；
和/或，崩解剂中的酸剂选自无机酸、有机酸、和/或无机盐中的一种或多种，
其中，无机盐选自磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或多种，和/或有机酸选自柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、酒石酸中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的核酸提取磁珠的泡腾片，其特征在于，
崩解剂中作为碱剂或酸剂的无机盐组分含量小于60%，
和/或，崩解剂中的碱剂与酸剂的质量比为20-60:40-80，
和/或，崩解剂用量的比例为10-95%。
4.根据权利要求1-3任一项中所述的核酸提取磁珠的泡腾片，其特征在于，
所述保护剂为抗氧化或防潮保护剂，所述抗氧化或防潮保护剂选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨酯、BSA牛血清蛋白、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、二苯酮、水杨酸乙基己酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、西诺沙酯、甲氧基肉桂酸辛酯、对-胺基苯甲酸中的一种或多种；
和/或，保护剂的用量比例为0.1-5%。
5.根据权利要求1-3任一项中所述的核酸提取磁珠的泡腾片，其特征在于，
核酸提取磁珠选自硅羟基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠中的至少一种；
和/或，核酸提取磁珠的粒径范围选自100-1200 nm；
和/或，核酸提取磁珠的表面材料选自二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸、多巴胺、聚羧甲基甘油醛、聚氨酯、聚甲基丙烯酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯中的一种或多种；
和/或，核酸提取磁珠的用量比例为0.1-5%。
6.根据权利要求1-3任一项中所述的核酸提取磁珠的泡腾片，其特征在于，核酸提取磁珠的泡腾片还包括防腐剂，防腐剂选自叠氮化钠、山梨醇、山梨酸钾、苯氧乙醇、多菌清、百菌灵中的一种或几种，
和/或，防腐剂的用量比例为0-3 %。
7.根据权利要求1-3任一项中所述的核酸提取磁珠的泡腾片，其特征在于，
泡腾片的直径大小范围为1-15 mm，
和/或，泡腾片的厚度为3-5 mm；
和/或，泡腾片的紧实程度以硬度表征，范围为10-200N；
和/或，泡腾片压制时压力范围为0.1-5 MPa；
和/或，泡腾片压制时间范围为5-20s。
8.权利要求1-7任一项中所述的核酸提取磁珠的泡腾片的合成方法，包括以下步骤：
将各组分分别用玛瑙研钵碾碎后，按照一定比例混合均匀，利用压片机在一定压力下压制成泡腾片。
9.权利要求1-7任一项中所述的核酸提取磁珠的泡腾片在核酸提取中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，
核酸提取的样本选自拭子、全血、血浆、血清、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液、土壤、粪便、细菌、脑脊液、耳槽、精液中的至少一种。
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