CN115612687B - 一种磁珠法核酸提取试剂泡腾片、制备方法及其应用 - Google Patents

一种磁珠法核酸提取试剂泡腾片、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种磁珠法核酸提取试剂泡腾片、制备方法及其应用。创新性地将传统核酸提取试剂中的主要成分压制成片，可灵活调节片剂的组分大小，可使目前的核酸提取流程得到简化：做到一片/几片泡腾片投入简单组分的试剂即可，克服以往需反复添加多种试剂的痛点，节省检测流程时间，减少加液过程中飞溅造成的浪费及潜在气溶胶污染，节约人力成本，易于实现自动化，方便科研、检测等应用。

Description

一种磁珠法核酸提取试剂泡腾片、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，特别涉及一种磁珠法核酸提取试剂泡腾片、制备方法及其应用。
背景技术
目前，市场上常规核酸提取试剂以溶液试剂为主要的产品类型，以预装板形式封装出售，或以试剂瓶套装形式出售，均存在显著的存储、运输问题，即需要低温条件（2-8℃）存储、存储容器密封性要求高，且液体试剂质量大、可选择的运输方式有限（液体无法空运）。对于出口市场，成本、时效均是重要的考量因素。
市售磁珠法核酸提取试剂（溶液剂）的主要成分如下：核酸提取磁珠、蛋白洗涤剂、金属离子洗涤剂、表面活性剂、pH调节剂、促进剂、无机盐。
本发明所述磁珠法核酸提取试剂（泡腾片剂）包括裂解泡腾片和去蛋白泡腾片，其中裂解泡腾片的主要成份有磁珠、裂解试剂成分和崩解剂，而去蛋白泡腾片的主要成分有去蛋白液成分和崩解剂。
预实验中，尝试将溶液剂型的磁珠法核酸提取试剂的各种组分，直接压制成泡腾片剂，预实验结果显示存在多个问题，如：对核酸的提取效果较原溶液剂型的产品差，且泡腾片存在易吸潮、氧化的问题导致泡腾片易破碎，进一步导致核酸提取性能下降。
发明内容
为了改善上述技术问题，本发明提供一种磁珠法核酸提取试剂泡腾片、制备方法及其应用。
第一方面，本发明提供一种磁珠法核酸提取试剂的泡腾片或其组合，包括裂解泡腾片、去蛋白泡腾片中的任意一种或两种。
在一些实施方案中，裂解泡腾片包括以下组分：
核酸提取磁珠、蛋白洗涤剂、金属离子洗涤剂、表面活性剂、pH调节剂、促进剂、无机盐、崩解剂、保护剂。
在一些实施方案中，去蛋白泡腾片包括以下组分：
蛋白洗涤剂、表面活性剂、pH调节剂、促进剂、崩解剂、保护剂。
在一些实施方案中，崩解剂包括酸剂和碱剂。
在一些实施方案中，崩解剂中的碱剂选自碳酸盐和碳酸氢盐中的一种或多种；
优选地，碳酸盐选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸钙、碳酸镁中的一种或多种，和/或碳酸氢盐选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铵、碳酸氢镁中的一种或多种；
更优选地，崩解剂中的碱剂为碳酸氢钠、碳酸钠。
在一些实施方案中，崩解剂中的酸剂选自无机酸、有机酸、和/或无机盐中的一种或多种；优选地，无机盐为强酸弱碱盐；
优选地，无机盐选自磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等磷酸盐中的一种或多种，和/或有机酸选自柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、酒石酸等中的一种或多种；
更优选地，无机酸选自磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钾，有机酸选自柠檬酸、苹果酸和/或酒石酸；
最为优选地，崩解剂中的酸剂选自磷酸二氢钠、柠檬酸、苹果酸。
在一些实施方案中，崩解剂中的碱剂与酸剂的质量比为15-30:20-35，优选为20:30。
在一些实施方案中，崩解剂用量的比例为10-95%。
在一些实施方案中，裂解泡腾片中，崩解剂用量的优选比例为50%；
和/或，去蛋白泡腾片中，崩解剂用量的优选比例为30%。
在一些实施方案中，核酸提取磁珠选自硅羟基磁珠、羧基磁珠、氨基磁珠中的至少一种，优选为硅羟基磁珠、羧基磁珠中的至少一种，更优选为硅羟基磁珠；
和/或，核酸提取磁珠粒径范围为100-1200 nm；
和/或，核酸提取磁珠的表面材料为二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸、多巴胺、聚羧甲基甘油醛、聚氨酯、聚甲基丙烯酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯等不同的材料中的一种或多种，优选为二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸；
和/或，核酸提取磁珠的用量比例为0.1-5%，优选为0.1-1%。
在一些实施方案中，蛋白洗涤剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素、十二烷基硫酸钠中的一种或几种，优选为异硫氰酸胍、盐酸胍；
和/或，蛋白洗涤剂用量的比例为10-50%。
在一些实施方案中，裂解泡腾片中，蛋白质洗涤剂用量的比例为20%；
和/或，去蛋白泡腾片，蛋白质洗涤剂用量的比例为45%。
在一些实施方案中，金属离子洗涤剂选自乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸四钠、次氨基三乙酸二钠、二乙烯三胺五乙酸五钠、柠檬酸钠、柠檬酸铵、酒石酸钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸铵、羟乙基乙二胺三乙酸三钠、三聚磷酸钠等中的至少一种；优选为乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠中的至少一种；
和/或，金属离子洗涤剂用量的比例为0.1-1%，优选比例为0.4%。
在一些实施方案中，表面活性剂选自莎梵婷、四丁基氟化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、皂角粉、Morwet EFW （丁基萘磺酸钠）、十二烷基酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基醇醚磷酸酯钾椰油酰胺丙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、十六烷基三甲基溴化铵、吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、Brij-58、曲拉通X-100中的一种或几种；优选为十二烷基酰肌氨酸钠、莎梵婷中的一种或几种；
和/或，表面活性剂用量的比例为0.1-5%。
在一些实施方案中，裂解泡腾片中，表面活性剂用量的比例为1.2%；
和/或，去蛋白泡腾片中，表面活性剂用量的优选比例为0.6%。
在一些实施方案中，pH调节剂选自三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉乙酸钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、氢氧化钠等中的一种或几种；优选为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；
和/或， pH调节剂用量的比例为0.1-1%。
在一些实施方案中，裂解泡腾片中，pH调节剂用量的比例为0.4%；
和/或，去蛋白泡腾片中，pH调节剂用量的比例为0.2%。
在一些实施方案中，促进剂选自二甲基亚砜、甲酰胺、N, N-二甲基甲酰胺、冠醚（如：18-冠-6）、甘露醇、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、十四醇、十六醇、十八醇、聚乙烯吡咯烷酮（K = 10-20）、聚乙烯吡咯烷酮（K =30）、聚乙烯吡咯烷酮（K = 40）、聚乙烯吡咯烷酮（K = 80）、糖原、线性聚丙烯酰胺、N-正烷基苯丙异噻酮唑酮中等的一种或几种；优选为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；
和/或，促进剂用量的比例为20-80%。
在一些实施方案中，裂解泡腾片中，促进剂用量的比例为45%；
和/或，去蛋白泡腾片中，促进剂用量的比例为30%。
在一些实施方案中，无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、氟化钠、氟化氢钾、氟化铯、氯化钠、氯化钾和溴化钠等中的至少一种；优选地，所述无机盐选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、氟化钠、氯化钠或溴化钠中的至少一种；
和/或，泡腾片中无机盐用量的比例为0.1-1%，优选比例为0.3%。
在一些实施方案中，保护剂选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨酯、BSA（牛血清蛋白）、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、二苯酮、水杨酸乙基己酯、甲氧基肉桂酸乙基己酯、西诺沙酯、甲氧基肉桂酸辛酯、对-胺基苯甲酸等中的一种或多种，保护剂优选为聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；
和/或，保护剂用量的比例为0.1-5%，优选为1-2%。
在一些实施方案中，上述裂解泡腾片和/或去蛋白泡腾片中还包括防腐剂。
在一些实施方案中，防腐剂选自叠氮化钠、山梨醇、山梨酸钾、苯氧乙醇、多菌清、百菌灵等中的一种或几种；优选为叠氮化钠、山梨酸钾；
和/或，防腐剂的用量比例为0-3%，用量比例优选为1%。
在一些实施方案中，泡腾片直径大小范围为1-15 mm，优选的直径为6 mm；
和/或，泡腾片厚度为3-5 mm，优选的厚度为4 mm；
和/或，泡腾片的紧实程度以硬度表征，范围为10-200N，优选的硬度为100N。
在一些实施方案中，泡腾片压制时压力范围为0.1-5 MPa，优选为0.5 Mpa；
和/或，泡腾片压制时间范围为5-20s，优选为10s。
第二方面，本发明提供上述磁珠法核酸提取试剂泡腾片的制备方法，包括以下步骤：
用玛瑙研钵分别研磨粉碎各组分，按照比例混合均匀，利用压片机在一定的压力下压制形成泡腾片。
第三方面，本发明提供上述磁珠法核酸提取试剂泡腾片在核酸提取中的应用。
在一些实施方案中，核酸提取的样本选自拭子、全血、血浆、血清、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液、土壤、粪便、细菌、脑脊液、耳槽、精液等。
在一些实施方案中，拭子为口腔拭子；
在一些实施方案中，核酸提取的样本为全血、血清、血浆。
在一些实施方案中，核酸为DNA或RNA。
在一些实施方案中，核酸为新型冠状病毒核酸。
第四方面，本发明提供一种核酸提取的试剂盒，包括裂解结合液、洗涤A液、洗涤B液和洗脱液，
其中，裂解结合液为上述裂解泡腾片，
和/或，洗涤A液为上述去蛋白泡腾片，
和/或，洗涤B液为核酸沉淀剂，优选为IPA异丙醇、乙醇，更优选为60-80%乙醇，最优选为70-80%乙醇，
和/或，洗脱液为水，优选为双蒸水。
有益效果
本发明创新性地将传统核酸提取试剂中的主要成分压制成片，可灵活调节片剂的组分大小，可使目前的核酸提取流程得到简化：做到一片/几片泡腾片投入简单组分的试剂即可，克服以往需反复添加多种试剂的痛点，节省检测流程时间，减少加液过程中飞溅造成的浪费及潜在气溶胶污染，节约人力成本，易于实现自动化，方便科研、检测等应用。
本发明主要是将核酸提取磁珠、蛋白洗涤剂、金属离子洗涤剂、表面活性剂、pH调节剂、促进剂、无机盐、崩解剂、保护剂、防腐剂等多种不同的组分，在特定压力下压制成不同大小的泡腾片，成功地应用于拭子、全血、血清、血浆、组织匀浆液等样本的核酸提取中。
本发明利用纯铝袋对泡腾片进行独立密封包装，方便物流运输，可避免使用不当、运输破损等造成交叉污染的可能性。同时，经稳定性(老化)实验检测，结果显示，该磁珠法核酸提取试剂泡腾片具有良好的稳定性。
附图说明
图1是裂解泡腾片（上图）和去蛋白泡腾片（下图）的崩解过程。
图2是原试剂、裂解泡腾片、去蛋白泡腾片在37摄氏度恒温烘箱中处理，不同时间取出进行新冠假病毒RNA提取的稳定性实验结果。
图3是原试剂、裂解泡腾片、去蛋白泡腾片在60摄氏度恒温烘箱中处理，不同时间取出进行新冠假病毒RNA提取的稳定性实验结果。
图4是磁珠法核酸提取试剂泡腾片（裂解泡腾片和去蛋白泡腾片）的产品包装图。
图5是对比例中的裂解&磁珠泡腾片在室温放置一天前后的实验图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1：泡腾片崩解实验
将1 mg硅羟基磁珠、34.5 mg异硫氰酸胍、1 mg乙二胺四乙酸二钠、3 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、80 mg聚乙二醇8000、0.5 mg NaCl、20 mg Na2CO3、30mg 柠檬酸、1 mg聚乙烯醇和1 mg山梨酸钾用玛瑙研钵研磨粉碎，混合后以0.5 MPa压力压制10 s形成直径6 mm的裂解泡腾片。
将91.7 mg异硫氰酸胍、1 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、60 mg聚乙二醇8000、20 mg Na2CO3、30 mg 柠檬酸、1 mg聚乙烯醇和1 mg山梨酸钾以上述裂解泡腾片制备的相同方式制得去蛋白泡腾片。
将裂解泡腾片投入500 μL ddH2O中，去蛋白泡腾片投入600 μL ddH2O，静置等待崩解，录像观测泡腾片崩解、分散情况。
崩解过程截图如图1所示。结果显示：裂解泡腾片经71 s完全崩解分散；去蛋白泡腾片经65 s完全崩解分散。
实施例2：新冠2019-nCov假病毒RNA提取
将1 mg硅羟基磁珠、34.5 mg异硫氰酸胍、1 mg乙二胺四乙酸二钠、3 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、80 mg聚乙二醇8000、0.5 mg NaCl、20.5 mg NaHCO3、29.5 mg NaH2PO4、1 mg聚乙烯醇和1 mg山梨酸钾用玛瑙研钵研磨粉碎，混合后以0.5 MPa压力压制10 s形成直径6 mm的裂解泡腾片。
将91.7 mg异硫氰酸胍、1 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、60 mg聚乙二醇8000、20.5 mg NaHCO3、29.5 mg NaH2PO4、1 mg聚乙烯醇和1 mg山梨酸钾以上述裂解泡腾片制备的相同方式制得去蛋白泡腾片。
裂解泡腾片投入含200 μL 105 copies/mL新冠假病毒的口腔拭子样本与500 μL水的样本板孔中，等待崩解分散；去蛋白泡腾片投入含600 μL水的样本板孔中，等待崩解分散。
待崩解分散后，分别按照表1方法，采用表1中的裂解结合试剂、洗涤A试剂、洗涤B试剂和洗脱试剂提取新冠2019-nCov假病毒RNA。取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增。将结果与原试剂进行对比。
磁珠法新冠核酸提取流程参照市售产品： MAGBETTER® 磁珠法病毒核酸提取试剂盒——MNAPure Virus RNA kit中说明书所述提取流程。
MAGBETTER® 磁珠法病毒核酸提取试剂盒——MNAPure Virus RNA kit中的对应试剂，包括裂解结合液、磁珠分散液、去蛋白液（洗涤A液）、洗涤液（洗涤B液）、洗脱液。其中，磁珠分散液加入裂解结合液后即为表1中所示的原试剂(含0.5 mg磁珠)；原试剂指的是使用MAGBETTER® 磁珠法病毒核酸提取试剂盒中的相应试剂；阴性对照是ddH2O。
表1 不同试剂提取新冠2019-nCov假病毒RNA的结果
Figure 607794DEST_PATH_IMAGE001
表中，Ct值、FAM、HEX内标、ROX的含义是：Ct值指荧光信号达到所设阈值时的循环数，读数单位为cycles（循环）；FAM荧光信号对应新冠病毒基因组中ORF1ab(open readingframe 1ab，开放读码框1ab)；HEX荧光信号对应人源基因RNase P，作为内标指示；ROX荧光信号对应新冠病毒基因组中的N（nucleocapsid protein，核壳蛋白）。
结果显示：
1) 裂解泡腾片和去蛋白泡腾片单独使用时均可正常提取，提取性能与原试剂相当；
2) 裂解泡腾片和去蛋白泡腾片共同使用时可正常提取，提取性能与原试剂相当。
实施例3：口腔拭子DNA提取
将1 mg硅羟基磁珠、35 mg盐酸胍、1 mg乙二胺四乙酸二钠、3 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、100 mg甘露醇、0.8 mg NaCl、20.5 mg NaHCO3、29.5 mgNaH2PO4、2 mg聚乙烯吡咯烷酮和1 mg山梨酸钾用玛瑙研钵研磨粉碎，混合后以0.5 MPa压力压制10 s形成直径6 mm的裂解泡腾片。
将90 mg盐酸胍、2 mg吐温-40、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、100 mg甘露醇、20.5mg NaHCO3、29.5 mg NaH2PO4、2 mg聚乙烯吡咯烷酮和1 mg山梨酸钾以上述裂解泡腾片制备的相同方式制得去蛋白泡腾片。
裂解泡腾片投入300 μL口腔拭子样本与500 μL水的样本板孔中，等待崩解分散；去蛋白泡腾片投入含500 μL水的样本板孔中，等待崩解分散。
待崩解分散后，分别按照表2方法，采用表2中的裂解结合试剂、洗涤A试剂、洗涤B试剂和洗脱试剂提取口腔拭子DNA。按常规磁珠法口腔拭子DNA提取流程进行提取。使用NanoDrop对洗脱液进行结果测定。将结果与原试剂进行对比。
磁珠法口腔拭子DNA提取流程，参照市售产品：MAGBETTER® 磁珠法口腔拭子核酸提取试剂盒——MNAPure Swab DNA kit中说明书所述提取流程。
MAGBETTER® 磁珠法口腔拭子核酸提取试剂盒——MNAPure Swab DNA kit中的对应试剂，包括裂解结合液、磁珠分散液、去蛋白液（洗涤A液）、洗涤液（洗涤B液）、洗脱液。其中，磁珠分散液加入裂解结合液后即为表2中所示的原试剂(含0.5 mg磁珠)；原试剂指的是使用MAGBETTER® 磁珠法口腔拭子核酸提取试剂盒中的相应试剂；此外该提取过程中使用的蛋白酶K及蛋白酶K保存液也使用试剂盒中的原试剂。
表2 不同试剂提取口腔拭子DNA的结果
Figure 29154DEST_PATH_IMAGE002
结果显示：
1) 单独或同时应用裂解泡腾片和去蛋白泡腾片在口腔拭子样本中进行DNA提取的性能与原试剂相比没有下降。
实施例4：血液DNA提取
将2 mg羧基磁珠、42 mg盐酸胍、1.2 mg乙二胺四乙酸二钠、2 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、100 mg聚乙二醇4000、1 mg NaCl、20.2 mg Na2CO3、29.8 mg柠檬酸、2 mg聚乙烯吡咯烷酮和1 mg山梨酸钾用玛瑙研钵研磨粉碎，混合后以0.5 MPa压力压制10 s形成直径6 mm的裂解泡腾片。
将95 mg盐酸胍、2 mg吐温-40、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、100 mg聚乙二醇4000、20.2 mg Na2CO3、29.8 mg 柠檬酸、2 mg聚乙烯吡咯烷酮和1 mg山梨酸钾以上述裂解泡腾片制备的相同方式制得去蛋白泡腾片。
裂解泡腾片投入含200 μL绵羊全血样本与500 μL水的样本板孔中，等待崩解分散；去蛋白泡腾片投入含500 μL水的样本板孔中，等待崩解分散。
待崩解分散后，分别按照表3方法，采用表3中的裂解结合试剂、洗涤A试剂、洗涤B试剂和洗脱试剂提取血液DNA。依据常规的磁珠法血液DNA提取流程进行样本提取。使用NanoDrop对洗脱液进行结果测定。将结果与原试剂进行对比。
磁珠法血液DNA提取流程参照市售产品：MAGBETTER® 磁珠法血液DNA提取纯化试剂盒——MNAPure Blood DNA kit中说明书所述提取流程。
MAGBETTER® 磁珠法血液DNA提取纯化试剂盒——MNAPure Blood DNA kit中的对应试剂，包括裂解结合液、磁珠分散液、去蛋白液（洗涤A液）、洗涤液（洗涤B液）、洗脱液。其中，磁珠分散液加入裂解结合液后即为表3中所示的原试剂(含1 mg磁珠)；原试剂指的是使用MAGBETTER® 磁珠法血液DNA提取试剂盒中的相应试剂；此外该提取过程中使用的蛋白酶K及蛋白酶K保存液也使用试剂盒中的原试剂。
表3 不同试剂提取血液DNA的结果
Figure 493634DEST_PATH_IMAGE003
结果显示：
1) 血液样本提取实验中，单独将去蛋白泡腾片对原试剂的去蛋白液(洗涤A)进行替换使用，提取量稍有降低，但整体提取性能仍在可接受的范围内；
2) 单独将裂解泡腾片对原试剂的裂解结合试剂及磁珠进行替换使用，提取性能无下降，且提取量较原试剂高；
3) 裂解泡腾片和去蛋白泡腾片共同使用在所述条件下提取性能较原试剂高。
实施例5：植物DNA提取
将4 mg硅羟基磁珠、50 mg盐酸胍、1 mg乙二胺四乙酸二钠、2.5 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、60 mg聚乙二醇10000、1 mg NaCl、27.9 mg NaHCO3、22.1mg 苹果酸、2 mg聚乙烯吡咯烷酮和1 mg山梨酸钾用玛瑙研钵研磨粉碎，混合后以0.5 MPa压力压制10 s形成直径6 mm的裂解泡腾片。
将110 mg盐酸胍、2 mg吐温-40、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、60 mg聚乙二醇10000、27.9 mg NaHCO3、22.1 mg 苹果酸、2 mg聚乙烯吡咯烷酮和1 mg山梨酸钾以上述裂解泡腾片制备的相同方式制得去蛋白泡腾片。
裂解泡腾片投入含300 μL新鲜紫花地丁叶片样本与700 μL水的样本板孔中，等待崩解分散；去蛋白泡腾片投入含1000 μL水的样本板孔中，等待崩解分散。
待崩解分散后，分别按照表4方法，采用表4中的裂解结合试剂、洗涤A试剂、洗涤B试剂和洗脱试剂提取植物DNA。依据常规的磁珠法植物DNA提取流程进行样本提取。使用NanoDrop对洗脱液进行结果测定。将结果与原试剂进行对比。
磁珠法植物DNA提取流程，参照市售产品：MAGBETTER® 磁珠法植物核酸提取试剂盒——MNAPure Plant DNA kit中说明书所述提取流程。
MAGBETTER® 磁珠法植物核酸提取试剂盒——MNAPure Plant DNA kit中的对应试剂，包括裂解结合液、磁珠分散液、去蛋白液（洗涤A液）、洗涤液（洗涤B液）、洗脱液。其中磁珠分散液加入裂解结合液后即为表4中所示的原试剂(含2 mg磁珠)；原试剂指的是使用MAGBETTER® 磁珠法植物核酸提取试剂盒中的相应试剂；此外该提取过程中使用的RNaseA也使用试剂盒中的原试剂。
表4 不同试剂提取植物DNA的结果
Figure 365775DEST_PATH_IMAGE004
结果显示：
1) 植物DNA提取中，单独使用裂解泡腾片或共同使用裂解泡腾片与去蛋白泡腾片提取性能要优于原试剂；
2) 单独将去蛋白泡腾片对原试剂的去蛋白液(洗涤A)进行替换使用，提取量较原试剂稍低。
实施例6：稳定性测试
按实施例1的相同配方和方式制备裂解泡腾片和去蛋白泡腾片。将半数裂解泡腾片和半数去蛋白泡腾片置于37摄氏度恒温烘箱中，其余泡腾片置于60摄氏度恒温烘箱中，使用铝袋密封静置。其中，置于37摄氏度恒温烘箱中的裂解泡腾片和去蛋白泡腾片分别在0、1、3、5、7、14、21、28、56、84、112、140、168和196 天时取出进行新冠假病毒RNA提取测试，取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增，进行稳定性(老化)测试；置于60摄氏度恒温烘箱中的裂解泡腾片和去蛋白泡腾片分别在0、1、3、5、7、14、21和28天时取出进行新冠假病毒RNA提取测试，取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增，进行稳定性(老化)测试。并以原试剂作为对照试剂。将结果进行对比。
结果如图2-3所示：
1) 去蛋白泡腾片的稳定性较裂解泡腾片稍好；
2) 裂解泡腾片和去蛋白泡腾片均可在37摄氏度下密闭放置196天，约6个月内性能没有下降，裂解泡腾片和去蛋白泡腾片均未发生明显的吸潮、氧化或碎裂；裂解泡腾片和去蛋白泡腾片均可在60摄氏度下密闭放置28天，即4周内性能无明显下降，裂解泡腾片和去蛋白泡腾片均未发生明显的吸潮、氧化或碎裂。
实施例7：利用纯铝袋对泡腾片进行独立密封包装
按实施例2所述配方与流程压制泡腾片，将压制好的泡腾片装入一端开口的无酶处理的纯铝袋，使用加热封口机进行独立密封包装。结果如图4所示。
本发明利用纯铝袋对泡腾片进行独立密封包装，方便物流运输，可避免使用不当、运输破损等造成交叉污染的可能性。
对比例1：比较不同条件提取新冠2019-nCov假病毒RNA
按照表5的不同条件，提取新冠2019-nCov假病毒RNA。取洗脱液加入荧光定量PCR试剂中，进行定量扩增。
按磁珠法新冠核酸提取流程参照市售产品： MAGBETTER® 磁珠法病毒核酸提取试剂盒——MNAPure Virus RNA kit中说明书所述提取流程。
表5中，原试剂（40%IPA）的具体组分为MAGBETTER® 磁珠法病毒核酸提取试剂盒——MNAPure Virus RNA kit中的对应试剂，包括裂解结合液、磁珠分散液、去蛋白液（洗涤A液）、洗涤液（洗涤B液）、洗脱液。原试剂指的是使用MAGBETTER® 磁珠法病毒核酸提取试剂盒中的相应试剂；阴性对照是ddH2O。
表5中，裂解&磁珠泡腾片的组分及其制备方法为：将1 mg硅羟基磁珠、34.5 mg异硫氰酸胍、1 mg乙二胺四乙酸二钠、3 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、0.5mg NaCl、20.5 mg NaHCO3和29.5 mg NaH2PO4用玛瑙研钵研磨粉碎，混合后以0.5 MPa压力压制10 s形成直径6 mm的泡腾片。
表5 不同条件提取新冠假病毒RNA的结果
Figure 218193DEST_PATH_IMAGE005
小结：核酸提取效果显示，仅将磁珠、裂解试剂主要成分与崩解剂压制成片的提取效果差。
对比例2：泡腾片放置后稳定性
按照对比例1中裂解&磁珠泡腾片所述配方与流程压制裂解&磁珠泡腾片。将将91.7 mg异硫氰酸胍、1 mg十二烷基硫酸钠、1 mg三羟甲基氨基甲烷盐酸、60 mg聚乙二醇8000、20.5 mg NaHCO3和29.5 mg NaH2PO4用玛瑙研钵研磨粉碎，混合后以0.5 MPa压力压制10 s形成直径6 mm的去蛋白泡腾片。
将上述裂解&磁珠和去蛋白泡腾片在室温密闭放置，结果图5所示，室温密闭放置仅一天后即发生吸潮、氧化和破碎，投入ddH2O中无法崩解分散。
小结：不含保护剂和防腐剂的泡腾片易吸潮、氧化，泡腾片破碎，导致性能下降。
结论：
崩解速度：由实施例1(图1)的崩解速度，可知本发明磁珠法核酸提取试剂泡腾片在包含多种非崩解剂组分后，泡腾片崩解速度仍然较快，分散性能良好，可满足应用过程中快速、均匀的需求。
提取性能：比较实施例2 (表1)与对比例(表5)中的新冠假病毒RNA提取效果，可知本发明磁珠法核酸提取试剂泡腾片通过增加保护剂等以及组分比例的调整，使泡腾片的核酸提取性能得到了显著提升，与溶剂型的原试剂的提取性能相当、甚至更好。实施例3-5(表2-4)进一步显示，本发明磁珠法核酸提取试剂泡腾片可以应用于多种不同试剂盒，且提取性能良好，与溶剂型的原试剂的提取性能相当、甚至更好。
稳定性：对比例2(图5)中泡腾片仅存放一天即发生吸潮、氧化和破碎，影响正常崩解和分散，无法满足市场有关需求，而实施例6(图2-3)和7(图4)中所示，本发明磁珠法核酸提取试剂泡腾片引入防腐剂和铝袋密封后，泡腾片的稳定性显著提升，存储有效期可满足相关市场中对于产品运输、存储的有关需求。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种磁珠法核酸提取试剂的泡腾片，其特征在于，包括裂解泡腾片或者裂解泡腾片与去蛋白泡腾片的组合；
裂解泡腾片包括以下组分：核酸提取磁珠、蛋白洗涤剂、金属离子洗涤剂、表面活性剂、pH调节剂、促进剂、无机盐、崩解剂和保护剂；
去蛋白泡腾片包括以下组分：蛋白洗涤剂、表面活性剂、pH调节剂、促进剂、崩解剂和保护剂；
崩解剂的用量比例为10-50%；
崩解剂包括酸剂和碱剂，崩解剂中的碱剂选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的一种或多种，崩解剂中的酸剂选自磷酸二氢钠、柠檬酸、苹果酸和酒石酸中的一种或多种，崩解剂中的碱剂与酸剂的质量比为15-30:20-35；
核酸提取磁珠选自硅羟基磁珠、羧基磁珠和氨基磁珠中的至少一种，核酸提取磁珠的用量比例为0.1-5%；
蛋白洗涤剂选自异硫氰酸胍或盐酸胍，蛋白洗涤剂的用量比例为10-50%；
金属离子洗涤剂选自乙二胺四乙酸二钠或乙二胺四乙酸四钠，金属离子洗涤剂用量的比例为0.1-1%；
表面活性剂选自十二烷基酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温-20、吐温-40、吐温-60和吐温-80中的一种或几种，表面活性剂的用量比例为0.1-5%；
促进剂选自甘露醇、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种，裂解泡腾片中促进剂的用量比例为20%-45%，去蛋白泡腾片中促进剂的用量比例为20%-30%；
保护剂选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚乙烯醇中的一种或多种，保护剂用量的比例为0.1-5%；
pH调节剂选自三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、吗啉乙酸钠、乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、柠檬酸钠和氢氧化钠中的一种或几种，pH调节剂的用量比例为0.1-1%；
无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸钠、氟化钠、氟化氢钾、氟化铯和溴化钠中的至少一种，无机盐的用量比例为0.1-1%。
2.根据权利要求1所述的磁珠法核酸提取试剂的泡腾片，其特征在于，
裂解泡腾片中崩解剂的用量比例为50%；
和/或，去蛋白泡腾片中崩解剂的用量比例为30%。
3.根据权利要求1或2所述的磁珠法核酸提取试剂的泡腾片，其特征在于，
核酸提取磁珠粒径范围为100-1200 nm；
和/或，核酸提取磁珠的表面材料为二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸、多巴胺、聚羧甲基甘油醛、聚氨酯、聚甲基丙烯酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯和聚丙烯中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的磁珠法核酸提取试剂的泡腾片，其特征在于，
裂解泡腾片中蛋白质洗涤剂的用量比例为20%；
和/或，去蛋白泡腾片中蛋白质洗涤剂的用量比例为45%。
5.根据权利要求1或2所述的磁珠法核酸提取试剂的泡腾片，其特征在于，
裂解泡腾片中表面活性剂的用量比例为1.2%；
和/或，去蛋白泡腾片中表面活性剂的用量比例为0.6%。
6.根据权利要求1或2所述的磁珠法核酸提取试剂的泡腾片，其特征在于，
裂解泡腾片中pH调节剂的用量比例为0.4%；
和/或，去蛋白泡腾片中pH调节剂的用量比例为0.2%。
7.根据权利要求1或2所述的磁珠法核酸提取试剂的泡腾片，其特征在于，
裂解泡腾片和/或去蛋白泡腾片中还包括防腐剂，防腐剂选自叠氮化钠、山梨醇、山梨酸钾、苯氧乙醇、多菌清和百菌灵中的一种或几种，
和/或，防腐剂的用量比例为0-3%。
8.根据权利要求1或2所述的磁珠法核酸提取试剂的泡腾片，其特征在于，
泡腾片直径大小范围为1-15 mm；
和/或，泡腾片厚度为3-5 mm；
和/或，泡腾片的紧实程度以硬度表征，范围为10-200N；
和/或，泡腾片压制时压力范围为0.1-5 MPa；
和/或，泡腾片压制时间范围为5-20s。
9.权利要求1-8任一项中所述的磁珠法核酸提取试剂的泡腾片在核酸提取中的应用，所述应用用于非疾病的诊断和治疗，核酸提取的样本选自拭子、全血、血浆、血清、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液、土壤、粪便、细菌、脑脊液、耳槽和精液中的至少一种。
10.一种核酸提取的试剂盒，包括裂解结合液、洗涤A液、洗涤B液和洗脱液，
其中，裂解结合液为权利要求1-8任一项中所述的裂解泡腾片，
洗涤A液为权利要求1-8任一项中所述的去蛋白泡腾片，
洗涤B液为核酸沉淀剂，
洗脱液为水。
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