JP5177524B2

JP5177524B2 - 茶系飲料中微生物の測定方法

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Inventors: 洋平篠崎; 恵子谷地舘
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Description

本発明は、茶系飲料における微生物汚染の迅速測定法に関する。

従来、飲料中の微生物汚染を測定する方法としては、寒天培地を用いて試料を２〜３日間培養し、生じるコロニー数を計数する寒天平板法や、メンブランフィルターを用いて試料をろ過し、寒天培地に貼り付け、フィルター上で同様に培養するメンブランフィルター法が一般的に用いられている。しかし、これらの微生物測定法では測定結果を得るまでに長時間を要し、飲料中の微生物汚染の検出法・工程管理手法として迅速性を欠く。また、出荷判定までの所要時間が長くなることで、在庫の増加に伴う倉庫スペースの拡大が必要となり、金銭的・空間的な損失が生じる。

こうした問題を解決するため、広く採用されている微生物汚染の迅速測定法の一つとして生物発光法（以下、「ＡＴＰ法」という）が知られている。「ＡＴＰ法」は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびＡＴＰの存在下で、ルシフェリンの酸化によって生じる発光量がＡＴＰ量と比例することに基づき、発光量を基に微生物汚染を測定する方法である。「ＡＴＰ法」を用いれば短時間で微生物汚染を測定できるため、測定時間の大幅な短縮が可能となる。

一方で、飲料中には原料由来の遊離ＡＴＰや、体細胞、タンパク質、繊維質などに付着したＡＴＰ（以下、まとめて「原料由来ＡＴＰ」という）も含まれている。ＡＴＰ測定時においては、「原料由来ＡＴＰ」が発光することで、微生物量が正確に測定できないことがある。そのため、飲料中の微生物由来のＡＴＰ（以下、「微生物由来ＡＴＰ」という）を測定する場合、「原料由来ＡＴＰ」の影響を低減する前処理方法が必要となる。

従来まで報告されている「原料由来ＡＴＰ」の消去技術としては、
（１）体細胞由来のＡＴＰ（以下、「体細胞ＡＴＰ」という）を「体細胞ＡＴＰ」抽出剤により抽出し、「ＡＴＰ消去剤」でこれらＡＴＰを消去する方法（以下、「体細胞処理法」という）、
（２）植物飲料中の体細胞に対して「体細胞ＡＴＰ」抽出剤および「ＡＴＰ消去剤」を十分に反応させた後に遠心分離を行う方法（以下、「植物飲料法」という）
がある（例えば、特許文献１〜３参照）。

上記（１）の「体細胞処理法」は、「体細胞ＡＴＰ」抽出剤により、体細胞中からＡＴＰを抽出後、「ＡＴＰ消去剤」を添加作用させることにより、「原料由来ＡＴＰ」を消去する方法であるが、茶系飲料に関しては、「原料由来ＡＴＰ」消去の効果が不十分であり、正確な「微生物由来ＡＴＰ」の測定結果が得られない。

上記（２）の「植物飲料法」は、植物飲料由来の体細胞から、「体細胞ＡＴＰ」抽出剤によりＡＴＰを抽出後、「原料由来ＡＴＰ」を消去し、次いで、遠心分離によってこれら不要となった試薬や分解物を除去し、残った「微生物由来ＡＴＰ」のみを検出する。しかし、茶系飲料では、「植物飲料法」を用いても良い結果が得られない。また、「植物飲料法」は遠心分離など煩雑な工程や専用の機器を必要とする問題点もある。

さらに、茶系飲料中成分に含まれる没食子酸やポリフェノールなどの成分は、一般的にアルカリ条件のもと、活性酸素の存在下で化学発光を生じることが知られている（例えば、非特許文献１および特許文献４参照）。微生物からのＡＴＰの抽出や、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応は、ｐＨが中性付近〜アルカリ条件下で実施される（例えば、非特許文献２参照）。ｐＨがアルカリ条件下では前述の化学発光が生じ、非ＡＴＰ由来のノイズが発生していると考えられ、このことが「ＡＴＰ法」に基づく茶系飲料中の微生物の迅速測定を困難にしている。

特開２００２−１６８８５９号公報特許第２８６７１８１号明細書特許第２９０５７２７号明細書特開２００３−２３８４９５号公報「生化学辞典」，第３版，東京化学同人，１９９８年１０月，ｐ．２７４Ｈａｔｔｏｒｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３年）第３１９巻，２８７〜２９５頁

本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、簡便な操作で、従来困難であった「ＡＴＰ法」に基づく茶系飲料中の微生物の迅速測定法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、試料と特定の溶液を混合し処理することで、微生物を破壊することなく茶系飲料中の「原料由来ＡＴＰ」を抽出、遊離させ、後の「ＡＴＰ消去剤」との反応によるＡＴＰ消去工程の効率を高めるだけでなく、「原料由来ＡＴＰ」に由来しない化学発光を低減可能であり、「微生物由来ＡＴＰ」量を「ＡＴＰ法」により迅速に測定可能であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、
（１）以下の工程を含む、茶系飲料中の微生物の測定方法
１．微生物を破壊することなく茶系飲料中の「原料由来ＡＴＰ」を遊離させ、かつ、茶系飲料成分由来の化学発光を減少させるＡＴＰ消去前処理試薬を茶系飲料に添加し、一定時間反応させる第一工程
２．「ＡＴＰ消去剤」を添加し、反応させ、反応液中の「原料由来ＡＴＰ」を消去する第二工程
３．ＡＴＰ抽出剤を添加し、反応させ、微生物内ＡＴＰを反応液中に遊離させる第三工程
４．遊離した「微生物由来ＡＴＰ」をルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬によって測定する第四工程
（２）ＡＴＰ消去前処理試薬のｐＨが７．０〜９．０である、上記（１）に記載の微生物測定方法。
（３）ＡＴＰ消去前処理試薬中の緩衝剤がリン酸、ＴｒｉｃｉｎｅもしくはＨＥＰＥＳから選択される１または２以上の緩衝剤である、上記（１）〜（２）に記載の微生物測定方法。
（４）ＡＴＰ消去前処理試薬中の緩衝剤の濃度が４０〜１５０ｍＭである上記（１）〜（３）に記載の微生物測定方法。
（５）ＡＴＰ消去前処理試薬を茶系飲料に添加後の反応時間が１〜３０分である上記（１）〜（４）に記載の微生物測定方法。
である。

定義
本発明において、測定試料に用いられる「茶系飲料」とは、不発酵茶（緑茶）、半発酵茶（烏龍茶）、発酵茶（紅茶）である。詳しくは、不発酵茶として緑茶、せん茶、玉露、かぶせ茶、番茶、玉緑茶、てん茶、抹茶、ほうじ茶、玄米茶、半発酵茶として包種茶、烏龍茶、発酵茶として紅茶類（ストレートティ、ミルクティ、レモンティ、フレーバーティを含む）、その他の茶系飲料としてウコン茶、ソバ茶、麦茶、こんぶ茶、甘茶、杜仲茶、柿の葉茶、どくだみ茶、げんのしょうこ茶、ギムネム茶、ハーブティ、グアバ茶、ウィキョウ茶、くこ茶、ビワ茶、マテ茶、ルイボスティ、ハトムギ茶、けつめいし茶、コーンティである。
また、茶系飲料同士を混合したブレンド茶や、これらの乾燥物、抽出物、粉末物を含む飲料や、茶系飲料に牛乳、生乳、粉乳、クリーム、果汁または糖類を添加したものも含む。

中でも、緑茶、烏龍茶、紅茶、抹茶入り飲料（ミルクとの混合飲料や、抹茶を添加した茶系飲料）が茶系飲料の試料として特に好ましい。

広義に「化学発光」とは、ケミルミネッセンスともいい、原子ないし分子が化学反応によって生じるエネルギーによって励起され光を発する現象をいう（「生化学辞典」，第３版，東京化学同人，１９９８年１０月，ｐ．２７４参照）。本発明において化学発光とは、特に茶系飲料にも含まれる没食子酸やポリフェノールが発すると考えられる、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応以外に起因する発光をいう。

本発明において「原料由来ＡＴＰ」とは、茶系飲料中に含まれる遊離のＡＴＰや、茶葉由来の繊維、タンパク質またはその他不溶性粒子に物理化学的に付着したＡＴＰ、茶葉由来の体細胞に含まれるＡＴＰまたは茶葉由来の細胞成分（葉緑素など）など、該飲料の原料に由来するＡＴＰをいう。消去しきれずに測定に持ち込まれる「原料由来ＡＴＰ」が多いほど、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の際に生じるバックグランド発光が増加し、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比が低下するため、微生物の正確な測定が困難となる。

本発明において「バックグランド発光」とは、ノイズの発光をいう。ノイズとは、発光測定時に測定された発光のうち、「微生物由来ＡＴＰ」がルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によって生じる発光を差し引いたものである。これらノイズ（バックグランド）の発光は、茶系飲料中成分由来と考えられる化学発光と、茶系飲料中成分に含まれる「原料由来ＡＴＰ」がルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によって生じる発光とが挙げられる。

本発明において、本発明者等は、ＡＴＰ消去工程に先立ち、茶系飲料にアルカリ性のｐＨを有する緩衝液を反応させることで、効果的に「バックグランド発光」を低減できることを見出した。「バックグランド発光」低減効果については、以下の二つの事象が本効果の説明になりうる。

ＡＴＰは、リン酸基とアミノ基を持ち、それぞれのｐＫａ（解離定数）はリン酸基が６．５、アミノ基が４．５である。すなわち、ｐＨが中性付近では、ＡＴＰは、負に帯電している。また、ＡＴＰは、酸性の溶液中では非常に不安定で加水分解しやすいことが広く知られている。茶系飲料のｐＨは、一般的にｐＨ５．０〜７．０であり、弱い酸性条件ではあるが、ＡＴＰが安定的に存在するために適した条件ではないと考えられる。
例えば、本発明の実施例で用いているようなｐＨ６．５の緑茶飲料中では、ＡＴＰのアミノ基は、中性であり、リン酸基も中性に近い状態で存在しうる。そのため、このような茶系飲料中の「原料由来ＡＴＰ」は、茶葉由来繊維やタンパク質、その他の不溶性粒子または茶葉由来の体細胞などの茶系飲料中成分に非特異的または物理化学的に吸着し、あるいはこれら成分に内包され、加水分解を免れる形で存在していると考えられる。
アルカリ性のｐＨを有する緩衝液と茶系飲料を混合すると、これら茶系飲料中成分に吸着されたＡＴＰは負に帯電する。この負に帯電したＡＴＰと茶系飲料中成分との静電的な反発、あるいはこれら成分とＡＴＰ、ＯＨ⁻イオン、および緩衝剤の間で置換反応が生じ、茶系飲料中成分中のＡＴＰが効果的に遊離することが考えられる。

一方で、茶系飲料中成分にも含まれる没食子酸やポリフェノールは、一般的にアルカリ条件のもと、活性酸素の存在下で化学発光を発する。典型的な生物発光法による微生物の測定（Ｈａｔｔｏｒｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３年）第３１９巻，２８７〜２９５頁参照）においては、微生物からのＡＴＰの抽出はアルカリ条件で実施され、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応もｐＨ７．０以上のアルカリ条件下で実施されているため、化学発光が生じることがある。
アルカリ性の緩衝液であるＡＴＰ消去前処理試薬によって、一度茶系飲料をアルカリ性にして化学発光を生じさせることにより、後の工程で化学発光を生じにくくさせることができる。

ＡＴＰ消去前処理試薬の組成
本発明において「ＡＴＰ消去前処理試薬」とは、中性以上のｐＨであり、微生物を破壊することなく、「原料由来ＡＴＰ」を茶系飲料中のタンパク質や繊維質または不溶性粒子などの原料由来成分から遊離させ、かつ、化学発光を低減させる性質を有する。
すなわち、ＡＴＰ消去前処理試薬はｐＨ７．０〜１０．０に調節されていることを特徴とする。微生物を破壊することなく「原料由来ＡＴＰ」を該飲料中の原料由来成分から遊離させ、かつ、化学発光を低減するためには、特にｐＨ７．０〜９．０、さらに好ましくはｐＨ８．０〜９．０の範囲が好ましい。

緩衝液としては、リン酸緩衝液、またはグッド緩衝液の中でも特にｐＨ７．０〜９．０、さらに好ましくはｐＨ８．０〜９．０の範囲において最適な緩衝能を有するＨＥＰＥＳ緩衝液もしくはＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液を用い、その濃度は４０〜１５０ｍＭが好ましい。

ＡＴＰ消去前処理試薬は、１つ以上の界面活性剤を含んでも良い。界面活性剤としては、茶系飲料中の原料由来成分から「原料由来ＡＴＰ」を遊離させる働きを有するものが好ましく、特に非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が挙げられる。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ８０を用い、その濃度は約０．１〜２．０％である。

ＡＴＰ消去前処理試薬は、また、１つ以上のキレート剤を含んでも良い。キレート剤としては、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール４酢酸（ＥＧＴＡ）が挙げられる。好ましくは、キレート剤としてＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ用い、その濃度は１０〜４０ｍＭである。

ＡＴＰ消去前処理試薬の反応条件
本発明においては、第一工程として、上記のＡＴＰ消去前処理試薬と試料とを反応させることにより、茶系飲料中の原料由来成分からＡＴＰを抽出・遊離させ、かつ、化学発光を減少させる。
ＡＴＰ消去前処理試薬と試料の反応温度および反応時間は、茶系飲料中の原料由来成分からＡＴＰを抽出・遊離させ、かつ、化学発光を減少させるために十分であり、また、微生物を破壊することなく実施できることが必要である。これらの兼ね合いで反応温度および反応時間は定められるため、対象とする試料や微生物種によって影響を受けるが、反応温度は２０〜５５℃、好ましくは３０〜３７℃、反応時間は６０分以内、好ましくは１〜３０分の範囲で実施することが好ましい。

「ＡＴＰ消去剤」
本発明においては、第二工程として、上記のＡＴＰ消去前処理試薬による前処理後に、該試料にＡＴＰ分解酵素を含む試薬（「ＡＴＰ消去剤」という）を反応させ、第一工程で抽出・遊離させた「原料由来ＡＴＰ」を分解消去する。「ＡＴＰ消去剤」で処理することにより、「原料由来ＡＴＰ」が分解され、後工程のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応におけるバックグランド発光を低減させることができ、微生物の検出感度を向上させることが可能となる。

「ＡＴＰ消去剤」としては、アデノシンリン酸デアミナーゼ、アデノシンリン酸デアミナーゼと、その他の酵素（例えば、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシントリホスファターゼ）などの従来公知のＡＴＰ分解酵素を一種類若しくは複数種類を含む混合溶液が好ましい。「ＡＴＰ消去剤」中に含まれるＡＴＰ分解酵素は、次の工程に入る前に失活させておくことが好ましい。試料中にＡＴＰ分解酵素が残存していた場合、後の工程で「微生物由来ＡＴＰ」を抽出した際に、このＡＴＰも分解されてしまうため、発光量の減少がおこり、検出感度の低下を引き起こす。酵素活性を失活させる方法としては、特に限定されないが、例えば、活性阻害剤の添加や、酸やアルカリを添加し試料のｐＨを変化させ失活させる方法が挙げられる。

「ＡＴＰ消去剤」と試料の反応温度および反応時間は、「原料由来ＡＴＰ」を分解するために十分であり、また微生物を破壊することなく実施できることが必要である。対象とする試料や微生物種によって影響を受けるが、反応温度は２０〜５５℃、好ましくは３０〜３７℃、反応時間は６０分以内、好ましくは１〜３０分の範囲で実施することが好ましい。

第三工程として、ＡＴＰ分解消去の反応を終えた試料を適当なＡＴＰ抽出剤と反応させ、「微生物由来ＡＴＰ」を抽出する。ＡＴＰを抽出する方法としては、公知のＡＴＰ抽出剤を添加する方法が好適である。ＡＴＰ抽出剤としては、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、過塩素酸が使用できるが、このうち界面活性剤はＡＴＰの抽出効率が高いほうが好ましい。
界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＣ）、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウムが挙げられる。

第四工程として、上記抽出した「微生物由来ＡＴＰ」を測定する。「微生物由来ＡＴＰ」の測定方法としては、ルシフェリンとルシフェラーゼを生物発光試薬として用いる方法が用いられる。この場合、抽出されたＡＴＰを含む試料を、ルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光試薬と反応させ、生成した発光量を測定して「微生物由来ＡＴＰ」量を求める。生物発光試薬は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびマグネシウムイオンを含む。
生成した発光量は、ルミノメーター、例えば、ルミテスターＣ−１００、Ｃ−１００Ｎ、Ｃ−１１０、Ｋ−１００、Ｋ−２００、Ｋ−２１０（いずれもキッコーマン社製）、ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１改良型（アロカ社製）、ＬｕｍａｔＬＢ９５０１（ベルトールド社製）により測定することができる。
以下実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。

（ＡＴＰ消去前処理試薬の調製）
ＡＴＰ消去前処理試薬のｐＨを検討するため、ｐＨ６．０〜８．５の計８種類のＡＴＰ消去前処理試薬を調製した。緩衝剤として、ｐＨ６．０のＡＴＰ消去前処理試薬には８０ｍＭＭＥＳを、ｐＨ７．０〜８．０には８０ｍＭＨＥＰＥＳを、ｐＨ８．２〜８．５には８０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅをそれぞれ用い、超純水に溶解した。１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液などでｐＨを調製し、これをＡＴＰ消去前処理試薬とした。

（「原料由来ＡＴＰ」の消去工程）
試料として約ｐＨ６．５の市販緑茶を用意した。市販緑茶０．１ｍｌを、マイクロピペットを用いてルミチューブ（キッコーマン社製）に分取した。実施例１（ＡＴＰ消去前処理試薬の調製）で得られた各ｐＨのＡＴＰ消去前処理試薬０．１ｍｌを、試料が分取されているチューブ内に添加し、チューブミキサーなどで攪拌後、３５℃に設定された空調式恒温器（アズワン社製、ＩＣ−３００Ａ）内に３０分間静置することでＡＴＰ消去前処理反応を行った。反応後、各チューブにルシフェール処理液（キッコーマン社製、Ｔｗｅｅｎ８０、キレート剤を含む）０．１ｍＬを分注し攪拌した。ＡＴＰ消去試薬（キッコーマン社製、付属の溶解液で溶解したもの）０．１ｍｌ、ルシフェール希釈液（キッコーマン社製）０．７ｍｌを添加後、攪拌し、上記と同様に３５℃に設定された恒温器内に３０分間静置することで「原料由来ＡＴＰ」の消去反応を行った。
同時に、ＡＴＰ消去前処理試薬を使わない測定方法（「前処理なし」として表１に記載）も検討した。その場合、上記のＡＴＰ消去前処理試薬を添加せず、代わりにルシフェール希釈液を添加する際に０．７ｍｌから０．８ｍｌに添加量を増やして液量を揃えた。その他の反応は、ＡＴＰ消去前処理試薬を使用する場合と同様に行った。

（「微生物由来ＡＴＰ」の抽出工程）
「原料由来ＡＴＰ」を消去した試料０．１ｍｌを新しいルミチューブに分取した。そこにＡＴＰ抽出試薬（キッコーマン社製）０．１ｍｌを添加し、攪拌することでＡＴＰの抽出を行った。

（発光量の測定工程）
ＡＴＰの抽出された試料０．２ｍｌにルシフェール発光試薬−ＨＳ（キッコーマン社製、付属の溶解液で溶解したもの）０．１ｍｌを添加・攪拌後、直ちにルミテスターＣ−１００（キッコーマン社製）の中に投入し、発光量を測定した。上記で測定した試料の発光量を表１に示す。

表１より、ｐＨ６．０のＡＴＰ消去前処理試薬を用いた場合には、ＡＴＰ消去前処理試薬を不使用に比べ、バックグランド発光の低下は見られなかった。ｐＨ７．０〜８．５の範囲ではバックグランド発光の顕著な低下が見られ、特にｐＨ７．５以上では１／１０以下に低減されていることが示された。

（ＡＴＰ消去前処理試薬の調製）
ＡＴＰ消去前処理試薬の微生物への影響を調べるため、ｐＨ７．０〜９．０のＡＴＰ消去前処理試薬を調製した。緩衝剤として、ｐＨ７．０には２０〜２００ｍＭＨＥＰＥＳを、ｐＨ８．０〜９．０には２０〜２００ｍＭＴｒｉｃｉｎｅをそれぞれ用い、超純水に溶解した。１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液などでｐＨを調製し、これをＡＴＰ消去前処理試薬とした。

（「原料由来ＡＴＰ」の消去工程）
添加菌として、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）ＮＢＲＣ３３２０、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ６５３８を用意した。これらの添加菌は、茶系飲料において検出される汚染菌のひとつである。各菌は標準寒天培地上、３５℃で２４時間培養した。
培養後生じたコロニーをＰＢＳ中に懸濁し、同ＰＢＳを用いて適宜希釈し、マイクロピペットを用いてルミチューブ（キッコーマン社製）に０．１ｍＬを分取した。
実施例２で得られた各ｐＨのＡＴＰ消去前処理試薬０．１ｍｌを、菌液が分取されているチューブ内に添加し、チューブミキサーなどで攪拌後、３５℃に設定された空調式恒温器内に３０分間静置することでＡＴＰ消去前処理反応を行った。

反応後、各チューブにルシフェール処理液（キッコーマン社製、Ｔｗｅｅｎ８０、キレート剤を含む）０．１ｍＬを分注し攪拌した。
ＡＴＰ消去試薬（キッコーマン社製、付属の溶解液で溶解したもの）０．１ｍｌ、ルシフェール希釈液（キッコーマン社製）０．６ｍｌを添加後、攪拌し、上記と同様に３５℃に設定された恒温器内に３０分間静置することで「原料由来ＡＴＰ」の消去反応を行った。
同時に、ＡＴＰ消去前処理試薬を使わない測定方法（「前処理なし」として表２に記載）も検討した。その場合、上記のＡＴＰ消去前処理試薬を添加せず、代わりにルシフェール希釈液を添加する際に０．６ｍｌから０．７ｍｌに添加量を増やして液量を揃えた。その他の反応は、ＡＴＰ消去前処理試薬を使用する場合と同様に行った。

（発光量の測定工程）
ＡＴＰの抽出された試料０．２ｍｌにルシフェール発光試薬−ＨＳ０．１ｍｌを添加・攪拌後、直ちにルミテスターＣ−１００（キッコーマン社製）の中に投入し、発光量を測定した。

（「発光比」の算出）
以下の式に基づき、表２において「前処理なし」時の各種懸濁液の発光量に対する各ＡＴＰ消去前処理試薬と反応させた各菌懸濁液の発光量の比（以下、「発光比」という）を算出した。

式：「発光比」＝（各ＡＴＰ消去前処理試薬と反応させた各菌懸濁液の発光量）÷（「前処理なし」時の各種菌懸濁液の発光量）×１００

上記で測定した試料の「発光比」を表２に示す。

表２において「発光比」が８０％以上となった場合について、下線を付した。Ｅ．ｃｌｏａｃａｅの「発光比」は、２００ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０のＡＴＰ消去前処理試薬と反応させた場合を除いて１００％以上となり、また、全て８０％となった。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの「発光比」は、４０〜１５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．０〜９．０範囲で８０％以上となった。ｐＨ７．０では全て８０％未満であった。
以上より、ＡＴＰ消去前処理試薬使用時の微生物の発光量低下が８０％まで許容できると規定するならば、表１の結果と併せ、ｐＨ７．０〜９．０が望ましく、さらに好ましくはｐＨ８．０〜９．０であり、緩衝剤濃度は４０ｍＭ以上、１５０ｍＭ以下が望ましいと考えられた。

（ＡＴＰ消去前処理試薬の調製）
超純水を用い、８０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０となるようにそれぞれの試薬を溶解した。１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．２に調製し、これをＡＴＰ消去前処理試薬とした。

（試料の調整）
試料として上記と同じ市販の緑茶、レモンティ、烏龍茶を用意した。いずれもＰＥＴボトルに充填されたものを用いた。これらの市販茶系飲料を用いて、微生物非添加区の試料をブランクとして以下の発光測定に用いた。微生物添加区として、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）ＮＢＲＣ３３２０を各茶系飲料に約１０^６ｃｆｕ／ｍＬとなるように添加し、これを１０倍、１００倍、１，０００倍に希釈した試料を用意した。

（「原料由来ＡＴＰ」の消去工程）
微生物非添加区と微生物添加区の各市販茶系飲料０．１ｍｌを、マイクロピペットを用いてルミチューブに分取した。実施例３（ＡＴＰ消去前処理試薬の調製）で得られたＡＴＰ消去前処理試薬０．１ｍｌを、試料が分取されているチューブ内に添加し、攪拌後、３５℃に設定された空調式恒温器内に３０分間静置することでＡＴＰ消去前処理反応を行った。反応後、各チューブにルシフェール処理液（キッコーマン社製、Ｔｗｅｅｎ８０、キレート剤を含む）０．１ｍｌを分注し攪拌した。ＡＴＰ消去試薬０．１ｍｌ、ルシフェール希釈液０．６ｍｌを添加後、攪拌し、上記と同様に３５℃に設定された恒温器内に３０分間静置することで「原料由来ＡＴＰ」の消去反応を行った。

（「微生物由来ＡＴＰ」の抽出工程）
「原料由来ＡＴＰ」を消去した試料０．１ｍｌを新しいルミチューブに分取した。そこにＡＴＰ抽出試薬０．１ｍｌを添加し、攪拌することでＡＴＰの抽出を行った。

（発光量の測定工程）
ＡＴＰの抽出された試料０．２ｍｌにルシフェール発光試薬−ＨＳ０．１ｍｌを添加・攪拌後、直ちにルミテスターＣ−１００の中に投入し、発光量を測定した。

（試料中の菌数の確認）
微生物添加区試料について、微生物を添加していない各茶系飲料で適宜希釈し、０．１ｍｌを標準寒天培地に塗抹した。３５℃で４８時間以上培養した後、生じたコロニー数を計数し、各試料の含む菌濃度を算出した。緑茶、レモンティ、烏龍茶の試料から得られた菌濃度と発光量をそれぞれこの順番で図１〜３に示す。

（比較例１）
実施例３に記載の試料を用いた。また、実施例３に記載の測定方法のうち、「「原料由来ＡＴＰ」の消去工程」の中でＡＴＰ消去前処理試薬を使わずに、代わりにルシフェール希釈液を添加する際に０．６ｍｌから０．７ｍｌに添加量を増やして液量を揃えた点を除いて、その他の反応は全く同様にして実施した。緑茶、レモンティ、烏龍茶の試料から得られた菌濃度と発光量をそれぞれこの順番で図１〜３に示す。

（比較例２）
実施例３に記載の試料を用いて、いわゆる「植物飲料法」である特許第２９０５７２７号に準ずる方法で発光量の測定を実施した。
「植物飲料法」は、植物飲料由来の体細胞から、「体細胞ＡＴＰ」抽出剤によりＡＴＰを抽出後、「原料由来ＡＴＰ」を消去し、次いで、遠心分離によってこれら不要となった試薬や分解物を除去し、残った「微生物由来ＡＴＰ」のみを検出する方法である。

（遠心分離による「原料由来ＡＴＰ」の消去工程）
微生物非添加区と微生物添加区の各市販茶系飲料０．１ｍｌを、マイクロピペットを用いて１．５ｍｌ容のマイクロチューブに分取した。各チューブにルシフェール処理液（キッコーマン社製、Ｔｗｅｅｎ８０、キレート剤を含む）０．１ｍｌを分注し攪拌した。ＡＴＰ消去試薬０．１ｍｌを添加、攪拌後、３５℃に設定された恒温器内に３０分間静置した。これを、遠心分離機を用いて１５，０００×ｇ、５分間遠心分離を行い、得られた上澄み液をマイクロピペットで吸引除去した。ルシフェール希釈液１．０ｍｌを添加しマイクロチューブ底面に回収された沈殿物をチューブミキサーによる攪拌で再溶解し、懸濁液を得た。

（「微生物由来ＡＴＰ」の抽出工程）
上記記載の懸濁液０．１ｍｌを新しいルミチューブに分取した。そこにＡＴＰ抽出試薬０．１ｍｌを添加し、攪拌することでＡＴＰの抽出を行った。

（発光量の測定工程）
実施例３に記載の方法で発光量を測定し菌濃度を算出した。緑茶、レモンティ、烏龍茶の試料から得られた菌濃度と発光量をそれぞれこの順番で図１〜３に示す。

図１の結果から、緑茶の微生物非添加区（ブランク）と微生物添加区のうち菌濃度３．４×１０^３ｃｆｕ／ｍｌとなった試料の発光量は、ＡＴＰ消去前処理試薬を用いた実施例３の場合にそれぞれ７５ＲＬＵと１４８ＲＬＵであった。これに対して、ＡＴＰ消去前処理試薬を使用しない場合は、前記比較例１の場合、８４６ＲＬＵと、６３６ＲＬＵであった。また、前記比較例２の場合、４００ＲＬＵ、４１７ＲＬＵであった。実施例のシグナル：ノイズ比は１４８／７５＝約２倍であり、微生物の測定が可能であったが、比較例１および比較例２では、緑茶に含まれる１０^３ｃｆｕ／ｍｌオーダーの微生物の測定は困難であった。

図２の結果から、レモンティの微生物添加区のうち菌濃度５．２×１０^３ｃｆｕ／ｍｌとなった試料と菌濃度５．２×１０^４ｃｆｕ／ｍｌとなった試料の発光量は、ＡＴＰ消去前処理試薬を用いた実施例３の場合にそれぞれ４５６ＲＬＵと１，２２５ＲＬＵであった。これに対して、ＡＴＰ消去前処理試薬を使用しない場合は、比較例１の場合、９，０５３ＲＬＵと１０，５２２ＲＬＵであった。また比較例２の場合、１，４７４ＲＬＵと１，１８１ＲＬＵであった。実施例のシグナル：ノイズ比は１，２２５／４５６＝約２．７倍であり、微生物の測定が可能であったが、比較例１および比較例２では、レモンティに含まれる１０^４ｃｆｕ／ｍｌオーダーの微生物の測定は困難であった。

図３の結果から、烏龍茶のブランクと微生物添加区のうち菌濃度４．８×１０^３ｃｆｕ／ｍｌとなった試料の発光量は、ＡＴＰ消去前処理試薬を用いた実施例３の場合にそれぞれ６３ＲＬＵと１２２ＲＬＵであった。これに対して、ＡＴＰ消去前処理試薬を使用しない場合は、比較例１の場合、１，８５１ＲＬＵと、９６４ＲＬＵであった。また比較例２の場合、２３５ＲＬＵ、３３４ＲＬＵであった。実施例のシグナル：ノイズ比は１２２／６３＝約２倍であり、微生物の測定が可能であったが、比較例１および比較例２では、緑茶に含まれる１０^３ｃｆｕ／ｍｌオーダーの微生物の測定は困難であった。

また、図１〜３の結果から、従来法である比較例１〜２の方法で測定した場合に比べ、実施例３で測定した場合は、より低濃度の微生物添加区の試料から直線性を示していることは明らかである。
以上のように、本発明のＡＴＰ消去前処理試薬を用いることで、各種茶系飲料のバックグランド発光を低下せしめることが可能であり、従来法に比べて高感度に該飲料中の微生物を測定可能である。

実施例３および従来法である比較例に記載の方法で測定された緑茶の発光量と菌数の相関を示す実施例３および従来法である比較例に記載の方法で測定されたレモンティの発光量と菌数の相関を示す実施例３および従来法である比較例に記載の方法で測定された烏龍茶の発光量と菌数の相関を示す

Claims

以下の工程を含む、茶系飲料中の微生物の測定方法。
（１）微生物を破壊することなく茶系飲料中の原料由来ＡＴＰを遊離させ、かつ、茶系飲料成分由来の化学発光を減少させるＡＴＰ消去前処理試薬（緩衝剤を含み、ｐＨが中性以上に調整されている）を茶系飲料に添加し、一定時間反応させる第一工程
（２）ＡＴＰ消去剤を添加し、反応させ、反応液中の原料由来ＡＴＰを消去する第二工程
（３）ＡＴＰ抽出剤を添加し、反応させ、微生物内ＡＴＰを反応液中に遊離させる第三工程
（４）遊離した微生物由来ＡＴＰをルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬によって測定する第四工程
ＡＴＰ消去前処理試薬のｐＨが７．０〜９．０である、請求項１に記載の微生物測定方法。
ＡＴＰ消去前処理試薬中の緩衝剤がリン酸、ＴｒｉｃｉｎｅもしくはＨＥＰＥＳから選択される１または２以上の緩衝剤である、請求項１〜２に記載の微生物測定方法。
ＡＴＰ消去前処理試薬中の緩衝剤の濃度が４０〜１５０ｍＭである請求項１〜３に記載の微生物測定方法。
ＡＴＰ消去前処理試薬を茶系飲料に添加後の反応時間が１〜３０分である請求項１〜４に記載の微生物測定方法。