JP2001136999A - 微生物ａｔｐの測定法において添加使用されるａｔｐ消去前処理剤および同処理剤を用いる微生物ａｔｐの高感度測定法 - Google Patents
微生物ａｔｐの測定法において添加使用されるａｔｐ消去前処理剤および同処理剤を用いる微生物ａｔｐの高感度測定法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】微生物を含有する試料、例えば微生物に汚染さ
れた魚介畜肉類やその加工食品を試料として用いる汚染
微生物ＡＴＰの高感度測定法の提供。 【解決手段】蛋白質分解活性を有する酵素を有効成分と
して含有する、微生物ＡＴＰの測定法において添加使用
されるＡＴＰ消去前処理剤、蛋白質分解活性を有する酵
素および界面活性剤をそれぞれ有効成分として含有す
る、微生物ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴ
Ｐ消去前処理剤、および微生物を含有する試料にＡＴＰ
消去剤を添加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去
する第一工程、これに微生物ＡＴＰ抽出剤を添加作用せ
しめて微生物由来のＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二
工程、ここで遊離したＡＴＰを測定する第三工程をこの
順序で行う微生物ＡＴＰの測定法において、第一工程と
同時または同工程に先立ち、前記ＡＴＰ消去前処理剤を
添加作用せしめ、微生物ＡＴＰを高感度で測定する。
れた魚介畜肉類やその加工食品を試料として用いる汚染
微生物ＡＴＰの高感度測定法の提供。 【解決手段】蛋白質分解活性を有する酵素を有効成分と
して含有する、微生物ＡＴＰの測定法において添加使用
されるＡＴＰ消去前処理剤、蛋白質分解活性を有する酵
素および界面活性剤をそれぞれ有効成分として含有す
る、微生物ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴ
Ｐ消去前処理剤、および微生物を含有する試料にＡＴＰ
消去剤を添加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去
する第一工程、これに微生物ＡＴＰ抽出剤を添加作用せ
しめて微生物由来のＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二
工程、ここで遊離したＡＴＰを測定する第三工程をこの
順序で行う微生物ＡＴＰの測定法において、第一工程と
同時または同工程に先立ち、前記ＡＴＰ消去前処理剤を
添加作用せしめ、微生物ＡＴＰを高感度で測定する。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は微生物ＡＴＰの測定
法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤およびそ
の処理剤を用いる微生物ＡＴＰの高感度測定法に関す
る。特に、微生物を含有する試料、例えば微生物に汚染
された魚介畜肉類やその加工食品を試料として用いる微
生物ＡＴＰの測定法において、体細胞ＡＴＰ抽出剤およ
びＡＴＰ消去剤によって処理できない、魚介畜肉類由来
のＡＴＰ結合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結
合した細胞片およびＡＴＰと結合した組織片など、ＡＴ
Ｐ結合体の該ＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめる
ための処理剤、（以下、「ＡＴＰ消去前処理剤」とい
う）およびその処理剤を用いる微生物ＡＴＰの高感度測
定法に関する。
法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤およびそ
の処理剤を用いる微生物ＡＴＰの高感度測定法に関す
る。特に、微生物を含有する試料、例えば微生物に汚染
された魚介畜肉類やその加工食品を試料として用いる微
生物ＡＴＰの測定法において、体細胞ＡＴＰ抽出剤およ
びＡＴＰ消去剤によって処理できない、魚介畜肉類由来
のＡＴＰ結合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結
合した細胞片およびＡＴＰと結合した組織片など、ＡＴ
Ｐ結合体の該ＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめる
ための処理剤、（以下、「ＡＴＰ消去前処理剤」とい
う）およびその処理剤を用いる微生物ＡＴＰの高感度測
定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】飲食品を問わず様々な分野で行われてい
る微生物検査法のひとつに、バイオルミネッセンス法が
ある。この方法は、ルシフェリンの酸化発光量とＡＴＰ
（アデノシン三リン酸）量が比例することから微生物の
ＡＴＰ量を指標として菌数を測定する方法である。しか
し、魚介畜肉類やその加工食品には、微生物以外の体細
胞や、遊離ＡＴＰが含まれており、試料中の生菌数を通
常のバイオルミネッセンス法で測定しようとしても、体
細胞由来のＡＴＰ、遊離ＡＴＰ、微生物由来のＡＴＰの
合計のＡＴＰ量を測定することとなり、微生物由来のＡ
ＴＰ量のみを測定して生菌数を求めることができない問
題を有していた。そこで、これら微生物以外の成分を低
減する以下のような前処理技術を組込んだ方法が提案さ
れた。即ち、試料に、微生物以外の細胞に含まれている
ＡＴＰを選択的に抽出する体細胞ＡＴＰ抽出試薬を添加
し、体細胞由来のＡＴＰを抽出し、フリー（遊離）ＡＴ
Ｐと共にＡＴＰ分解試薬で分解後、これに微生物ＡＴＰ
抽出試薬を加え微生物由来のＡＴＰを抽出し、これにル
シフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を加えて生じた発
光をルミノメータで測定することにより、前記微生物Ａ
ＴＰ量を求める方法（月刊フードケミカル「ＡＴＰバイ
オルミネッセンス法の微生物汚染対策への有効性」、１
９９５−５、第５５〜６３：特開平４−２２８０９７：
特表平６−５００４６２号：特開平９−７５０９８参
照）。
る微生物検査法のひとつに、バイオルミネッセンス法が
ある。この方法は、ルシフェリンの酸化発光量とＡＴＰ
（アデノシン三リン酸）量が比例することから微生物の
ＡＴＰ量を指標として菌数を測定する方法である。しか
し、魚介畜肉類やその加工食品には、微生物以外の体細
胞や、遊離ＡＴＰが含まれており、試料中の生菌数を通
常のバイオルミネッセンス法で測定しようとしても、体
細胞由来のＡＴＰ、遊離ＡＴＰ、微生物由来のＡＴＰの
合計のＡＴＰ量を測定することとなり、微生物由来のＡ
ＴＰ量のみを測定して生菌数を求めることができない問
題を有していた。そこで、これら微生物以外の成分を低
減する以下のような前処理技術を組込んだ方法が提案さ
れた。即ち、試料に、微生物以外の細胞に含まれている
ＡＴＰを選択的に抽出する体細胞ＡＴＰ抽出試薬を添加
し、体細胞由来のＡＴＰを抽出し、フリー（遊離）ＡＴ
Ｐと共にＡＴＰ分解試薬で分解後、これに微生物ＡＴＰ
抽出試薬を加え微生物由来のＡＴＰを抽出し、これにル
シフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を加えて生じた発
光をルミノメータで測定することにより、前記微生物Ａ
ＴＰ量を求める方法（月刊フードケミカル「ＡＴＰバイ
オルミネッセンス法の微生物汚染対策への有効性」、１
９９５−５、第５５〜６３：特開平４−２２８０９７：
特表平６−５００４６２号：特開平９−７５０９８参
照）。
【０００３】しかし、ここで用いられる体細胞ＡＴＰ抽
出試薬は、本発明者らの実験によれば、試料に含まれる
ＡＴＰ結合蛋白質や、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結
合した細胞片およびＡＴＰと結合した組織片などのＡＴ
Ｐ結合体には殆ど作用せず、したがって、該ＡＴＰ結合
体はその後に行われるＡＴＰ分解試薬による処理では分
解を受けることなく試料中にそのまま残存し、最後に行
われる微生物ＡＴＰ抽出試薬による処理により遊離ＡＴ
Ｐとして試料中に抽出されることが判明した。
出試薬は、本発明者らの実験によれば、試料に含まれる
ＡＴＰ結合蛋白質や、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結
合した細胞片およびＡＴＰと結合した組織片などのＡＴ
Ｐ結合体には殆ど作用せず、したがって、該ＡＴＰ結合
体はその後に行われるＡＴＰ分解試薬による処理では分
解を受けることなく試料中にそのまま残存し、最後に行
われる微生物ＡＴＰ抽出試薬による処理により遊離ＡＴ
Ｐとして試料中に抽出されることが判明した。
【０００４】従って、微生物以外の成分の影響を低減す
る上記前処理技術を用いて、体細胞ＡＴＰ抽出剤および
ＡＴＰ消去剤で処理しても、魚介畜肉類由来のＡＴＰ結
合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結合した細胞
片およびＡＴＰと結合した組織片など、ＡＴＰと結合し
た物質の該ＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめ、ま
た前記物質と結合したＡＴＰを消去することはできず、
最後にＡＴＰ結合体由来のＡＴＰと微生物由来のＡＴＰ
の合計のＡＴＰ量を測定することとなって、微生物ＡＴ
Ｐ量のみを測定して生菌数を求めることはできない場合
がある問題を有していた。
る上記前処理技術を用いて、体細胞ＡＴＰ抽出剤および
ＡＴＰ消去剤で処理しても、魚介畜肉類由来のＡＴＰ結
合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結合した細胞
片およびＡＴＰと結合した組織片など、ＡＴＰと結合し
た物質の該ＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめ、ま
た前記物質と結合したＡＴＰを消去することはできず、
最後にＡＴＰ結合体由来のＡＴＰと微生物由来のＡＴＰ
の合計のＡＴＰ量を測定することとなって、微生物ＡＴ
Ｐ量のみを測定して生菌数を求めることはできない場合
がある問題を有していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
のような問題点を解決するため、汚染された魚介畜肉
類、その加工食品などを試料として用い、その汚染微生
物ＡＴＰを測定する方法において、体細胞ＡＴＰ抽出剤
やＡＴＰ消去剤によって処理できない、肉組織由来のＡ
ＴＰ結合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結合し
た細胞片、ＡＴＰと結合した組織片などの該ＡＴＰを、
試料中に効率よく遊離せしめるための処理剤を提供す
る。また、同処理剤を用いる微生物ＡＴＰの高感度測定
法を提供する。
のような問題点を解決するため、汚染された魚介畜肉
類、その加工食品などを試料として用い、その汚染微生
物ＡＴＰを測定する方法において、体細胞ＡＴＰ抽出剤
やＡＴＰ消去剤によって処理できない、肉組織由来のＡ
ＴＰ結合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結合し
た細胞片、ＡＴＰと結合した組織片などの該ＡＴＰを、
試料中に効率よく遊離せしめるための処理剤を提供す
る。また、同処理剤を用いる微生物ＡＴＰの高感度測定
法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討を重ねた結果、汚染された魚介
畜肉類、その加工食品を試料として用い、これにプロテ
アーゼ活性を有する酵素を添加作用せしめるときは、体
細胞ＡＴＰ抽出剤や、ＡＴＰ消去剤によって処理できな
い、試料由来の、体細胞ＡＴＰを遊離すると共に、ＡＴ
Ｐ結合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結合した
細胞片およびＡＴＰと結合した組織片などの該ＡＴＰ
を、試料中に効率よく遊離できることを知った。また、
プロテアーゼ活性を有する酵素と共に界面活性剤を添加
作用せしめるときは、ＡＴＰを、さらに効率よく、しか
も殆ど完全に遊離できることを知った。
を解決するため鋭意検討を重ねた結果、汚染された魚介
畜肉類、その加工食品を試料として用い、これにプロテ
アーゼ活性を有する酵素を添加作用せしめるときは、体
細胞ＡＴＰ抽出剤や、ＡＴＰ消去剤によって処理できな
い、試料由来の、体細胞ＡＴＰを遊離すると共に、ＡＴ
Ｐ結合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと結合した
細胞片およびＡＴＰと結合した組織片などの該ＡＴＰ
を、試料中に効率よく遊離できることを知った。また、
プロテアーゼ活性を有する酵素と共に界面活性剤を添加
作用せしめるときは、ＡＴＰを、さらに効率よく、しか
も殆ど完全に遊離できることを知った。
【０００７】本発明は、これらの知見に基づいて完成し
たものであって、すなわち（１）本発明はプロテアーゼ
活性を有する酵素を有効成分として含有する、微生物Ａ
ＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理
剤である。また（２）本発明はプロテアーゼ活性を有す
る酵素と界面活性剤とをそれぞれ有効成分として含有す
る、微生物ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴ
Ｐ消去前処理剤である。また（３）本発明はプロテアー
ゼ活性を有する酵素が、ＡＴＰ結合蛋白質分解活性を有
する酵素である前記記載の微生物ＡＴＰの測定法におい
て添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤である。また
（４）本発明は微生物を含有する試料にＡＴＰ消去剤を
添加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去する第一
工程、これに微生物ＡＴＰ抽出剤を添加作用せしめて微
生物由来のＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二工程、こ
こで遊離したＡＴＰを測定する第三工程をこの順序で行
う微生物ＡＴＰの測定法において、第一工程と同時また
は同工程に先立ち、前記に記載されたＡＴＰ消去前処理
剤を該試料に添加作用せしめることを特徴とする微生物
ＡＴＰの高感度測定法である。
たものであって、すなわち（１）本発明はプロテアーゼ
活性を有する酵素を有効成分として含有する、微生物Ａ
ＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理
剤である。また（２）本発明はプロテアーゼ活性を有す
る酵素と界面活性剤とをそれぞれ有効成分として含有す
る、微生物ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴ
Ｐ消去前処理剤である。また（３）本発明はプロテアー
ゼ活性を有する酵素が、ＡＴＰ結合蛋白質分解活性を有
する酵素である前記記載の微生物ＡＴＰの測定法におい
て添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤である。また
（４）本発明は微生物を含有する試料にＡＴＰ消去剤を
添加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去する第一
工程、これに微生物ＡＴＰ抽出剤を添加作用せしめて微
生物由来のＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二工程、こ
こで遊離したＡＴＰを測定する第三工程をこの順序で行
う微生物ＡＴＰの測定法において、第一工程と同時また
は同工程に先立ち、前記に記載されたＡＴＰ消去前処理
剤を該試料に添加作用せしめることを特徴とする微生物
ＡＴＰの高感度測定法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。本
発明で用いる試料としては、微生物ＡＴＰを含むと思わ
れるものであれば特に限定されないが、例えば飲食品、
医薬品、化粧品等の各工業製品、その半製品、その原
料、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、
血液、喀痰、膿汁、細胞の培養液等が挙げられる。ま
た、細菌汚染検査、清浄度検査、拭き取り検査等の各種
検査における検体も、本発明の試料として挙げることが
できる。しかし、本発明の効果が顕著に現れる魚介畜肉
類またはその加工食品、処理物を含有する試料が好まし
い。試料は、適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩
水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液等）に懸濁した溶液として使用することが好ましい。
試料が固形分を含む場合には、磨砕、圧潰（ストマッカ
ー処理）またはミキサー処理などにより該試料の組織を
破壊したのち、上記溶媒に懸濁して使用する。
発明で用いる試料としては、微生物ＡＴＰを含むと思わ
れるものであれば特に限定されないが、例えば飲食品、
医薬品、化粧品等の各工業製品、その半製品、その原
料、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、
血液、喀痰、膿汁、細胞の培養液等が挙げられる。ま
た、細菌汚染検査、清浄度検査、拭き取り検査等の各種
検査における検体も、本発明の試料として挙げることが
できる。しかし、本発明の効果が顕著に現れる魚介畜肉
類またはその加工食品、処理物を含有する試料が好まし
い。試料は、適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理的食塩
水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝
液等）に懸濁した溶液として使用することが好ましい。
試料が固形分を含む場合には、磨砕、圧潰（ストマッカ
ー処理）またはミキサー処理などにより該試料の組織を
破壊したのち、上記溶媒に懸濁して使用する。
【０００９】拭き取り検査における検体を試料とする場
合は、綿棒のような拭き取りスティックを無菌水で湿ら
せ検査箇所を拭き取った後に、無菌水又は試薬液を入れ
た試験管の中ですすぎ、その液体部分を試料とする。
合は、綿棒のような拭き取りスティックを無菌水で湿ら
せ検査箇所を拭き取った後に、無菌水又は試薬液を入れ
た試験管の中ですすぎ、その液体部分を試料とする。
【００１０】測定対象のＡＴＰが、微生物ＡＴＰである
場合は、微生物を含むと思われる溶液あるいは微生物の
培養液等を試料として使用する。また、上記の溶液ある
いは培養液を、親水性または疎水性の濾過膜で濾過して
細胞を捕捉した後に該濾過膜を試料として使用してもよ
い。
場合は、微生物を含むと思われる溶液あるいは微生物の
培養液等を試料として使用する。また、上記の溶液ある
いは培養液を、親水性または疎水性の濾過膜で濾過して
細胞を捕捉した後に該濾過膜を試料として使用してもよ
い。
【００１１】本発明を実施するには、前記した微生物を
含有する試料にＡＴＰ消去剤を添加作用せしめて該試料
中の遊離ＡＴＰを消去する第一工程、これに微生物ＡＴ
Ｐ抽出剤を添加作用せしめて微生物由来のＡＴＰを試料
中に遊離せしめる第二工程、ここで遊離したＡＴＰを測
定する第三工程を従来公知の微生物ＡＴＰの測定法（従
来法）に行う。しかし、第一工程と同時または同工程に
先立ち、（１）プロテアーゼ活性を有する酵素を有効成
分として含有するＡＴＰ消去前処理剤、または（２）プ
ロテアーゼ活性を有する酵素と界面活性剤とをそれぞれ
有効成分として含有するＡＴＰ消去前処理剤、を添加作
用せしめ点は従来法と異なる。
含有する試料にＡＴＰ消去剤を添加作用せしめて該試料
中の遊離ＡＴＰを消去する第一工程、これに微生物ＡＴ
Ｐ抽出剤を添加作用せしめて微生物由来のＡＴＰを試料
中に遊離せしめる第二工程、ここで遊離したＡＴＰを測
定する第三工程を従来公知の微生物ＡＴＰの測定法（従
来法）に行う。しかし、第一工程と同時または同工程に
先立ち、（１）プロテアーゼ活性を有する酵素を有効成
分として含有するＡＴＰ消去前処理剤、または（２）プ
ロテアーゼ活性を有する酵素と界面活性剤とをそれぞれ
有効成分として含有するＡＴＰ消去前処理剤、を添加作
用せしめ点は従来法と異なる。
【００１２】プロテアーゼ活性を有する酵素は、例え
ば、試料、培地、各種試薬、容器、測定器具、測定装置
など（以下、「測定系」ということがある）に含有され
る蛋白質を分解する活性を有する酵素が挙げられるが、
特にＡＴＰ結合蛋白質を分解し、試料にＡＴＰを遊離す
る活性を有する酵素、具体的にはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｇ ｒｉｓｅｕｓ属微生物が生産するプロテアーゼ
および市販酵素プロナーゼ（商品名、ロッシュ社製）が
好ましい。また生物由来で精製した天然のプロテアーゼ
や、遺伝子工学的手法により調製した組み換えのプロテ
アーゼ、さらには天然のプロテアーゼのアミノ酸配列中
の１または複数のアミノ酸に付加、欠失、置換等の変異
を導入した変異プロテアーゼを用いてもよい。
ば、試料、培地、各種試薬、容器、測定器具、測定装置
など（以下、「測定系」ということがある）に含有され
る蛋白質を分解する活性を有する酵素が挙げられるが、
特にＡＴＰ結合蛋白質を分解し、試料にＡＴＰを遊離す
る活性を有する酵素、具体的にはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｇ ｒｉｓｅｕｓ属微生物が生産するプロテアーゼ
および市販酵素プロナーゼ（商品名、ロッシュ社製）が
好ましい。また生物由来で精製した天然のプロテアーゼ
や、遺伝子工学的手法により調製した組み換えのプロテ
アーゼ、さらには天然のプロテアーゼのアミノ酸配列中
の１または複数のアミノ酸に付加、欠失、置換等の変異
を導入した変異プロテアーゼを用いてもよい。
【００１３】本発明においてプロテアーゼ活性を有する
酵素を用いると、「肉片などをストマッカー処理し、滅
菌水に希釈した溶液を試料とした場合、試料中に含有さ
れるＡＴＰ結合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと
結合した細胞片およびＡＴＰと結合した組織片などに、
付着あるいは内蔵されるＡＴＰを溶液中に遊離させる作
用」を期待することが可能となる。
酵素を用いると、「肉片などをストマッカー処理し、滅
菌水に希釈した溶液を試料とした場合、試料中に含有さ
れるＡＴＰ結合蛋白質、ＡＴＰ結合ペプチド、ＡＴＰと
結合した細胞片およびＡＴＰと結合した組織片などに、
付着あるいは内蔵されるＡＴＰを溶液中に遊離させる作
用」を期待することが可能となる。
【００１４】なお、界面活性剤とプロテアーゼ活性を有
する酵素とを併用すると、プロテアーゼが効率よく作用
し、ＡＴＰが遊離し易くなるので好ましい。
する酵素とを併用すると、プロテアーゼが効率よく作用
し、ＡＴＰが遊離し易くなるので好ましい。
【００１５】プロテアーゼを添加作用せしめるときの条
件は、試料の種類、性状等に応じて適宜設定すること好
ましく、通常は以下の要領で行うことが好ましい。 （１）プロナーゼの終濃度：１〜７０Ｕ／ｍｌ（Ｕは国
際単位）（特に１０Ｕ〜３０Ｕ／ｍｌが好ましい） （２）ｐＨ条件：弱酸性〜弱アルカリ性（特にｐＨ６．
０〜８．５が好ましい） （３）反応温度：２０〜５０℃（特に３０〜４５℃が好
ましい） （４）反応時間：１０秒〜２時間（特に１５〜６０分が
好ましい）
件は、試料の種類、性状等に応じて適宜設定すること好
ましく、通常は以下の要領で行うことが好ましい。 （１）プロナーゼの終濃度：１〜７０Ｕ／ｍｌ（Ｕは国
際単位）（特に１０Ｕ〜３０Ｕ／ｍｌが好ましい） （２）ｐＨ条件：弱酸性〜弱アルカリ性（特にｐＨ６．
０〜８．５が好ましい） （３）反応温度：２０〜５０℃（特に３０〜４５℃が好
ましい） （４）反応時間：１０秒〜２時間（特に１５〜６０分が
好ましい）
【００１６】また、本発明のＡＴＰ消去前処理剤として
用いられる界面活性剤としては、ＡＴＰ結合体の該ＡＴ
Ｐを選択的に遊離または抽出できる界面活性剤が使用で
きるが、特に非イオン系界面活性剤（例えば、ドデシル
マルトシド、ジギトニン、Ｔｗｅｅｎ８０、オクチルグ
ルコシド）および陰イオン界面活性剤（例えばコール酸
ナトリウム）などが好ましい。
用いられる界面活性剤としては、ＡＴＰ結合体の該ＡＴ
Ｐを選択的に遊離または抽出できる界面活性剤が使用で
きるが、特に非イオン系界面活性剤（例えば、ドデシル
マルトシド、ジギトニン、Ｔｗｅｅｎ８０、オクチルグ
ルコシド）および陰イオン界面活性剤（例えばコール酸
ナトリウム）などが好ましい。
【００１７】界面活性剤の終濃度は、界面活性剤や試料
の種類などによっても異なるが、例えばドデシルマルト
シドを用い、魚介畜肉類の処理液を試料とした場合、濃
度は、０．００１〜５％が好ましく、特に０．０１〜１
％が好ましい。ｐＨ条件、反応温度、反応時間は、それ
ぞれプロテアーゼを添加作用せしめるときの条件と同一
とすることが好ましい。
の種類などによっても異なるが、例えばドデシルマルト
シドを用い、魚介畜肉類の処理液を試料とした場合、濃
度は、０．００１〜５％が好ましく、特に０．０１〜１
％が好ましい。ｐＨ条件、反応温度、反応時間は、それ
ぞれプロテアーゼを添加作用せしめるときの条件と同一
とすることが好ましい。
【００１８】本発明のＡＴＰ消去前処理剤は、固体状
（例えば、顆粒状、粉末状、錠剤状等）であっても、液
体状であってもよいが、操作の簡便性からすると、液体
状であることが好ましい。その場合、有効成分であるプ
ロテアーゼを、滅菌処理した水や適当な緩衝液（例え
ば、リン酸緩衝液、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、メス
（ＭＥＳ）緩衝液）に溶解すればよい。そして、上記の
成分以外に、他の成分、たとえば賦形剤、分散剤、乳化
剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ緩衝剤、吸湿剤等が使用可能
である。これらの成分の種類や、添加量は特に限定され
ず、試料の用途、操作性、測定系の種類、試料の形態等
に応じて適宜設定すれば良い。
（例えば、顆粒状、粉末状、錠剤状等）であっても、液
体状であってもよいが、操作の簡便性からすると、液体
状であることが好ましい。その場合、有効成分であるプ
ロテアーゼを、滅菌処理した水や適当な緩衝液（例え
ば、リン酸緩衝液、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、メス
（ＭＥＳ）緩衝液）に溶解すればよい。そして、上記の
成分以外に、他の成分、たとえば賦形剤、分散剤、乳化
剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ緩衝剤、吸湿剤等が使用可能
である。これらの成分の種類や、添加量は特に限定され
ず、試料の用途、操作性、測定系の種類、試料の形態等
に応じて適宜設定すれば良い。
【００１９】以下に、本発明の微生物ＡＴＰの測定法の
一具体例を以下に示す。 第一工程：細胞を含む試料に、本発明のＡＴＰ結合蛋白
質分解活性を有する酵素を有効成分として含有するＡＴ
Ｐ消去前処理剤を添加し、試料中に含まれる蛋白質ある
いはペプチドに付着あるいは内蔵されるＡＴＰを溶液中
に遊離させる。
一具体例を以下に示す。 第一工程：細胞を含む試料に、本発明のＡＴＰ結合蛋白
質分解活性を有する酵素を有効成分として含有するＡＴ
Ｐ消去前処理剤を添加し、試料中に含まれる蛋白質ある
いはペプチドに付着あるいは内蔵されるＡＴＰを溶液中
に遊離させる。
【００２０】第二工程：試料に遊離させたＡＴＰおよび
元来から存在する遊離ＡＴＰを測定系に影響がないよう
に処理する。すなわち、フィルターを用いる方法や遠心
分離による方法、さらには、溶液中にＡＴＰ分解活性を
有する酵素（以下「ＡＴＰ分解酵素」ということがあ
る）を添加作用せしめＡＴＰを分解する方法など任意の
方法により、遊離ＡＴＰの影響を取り除く。このうち、
簡便性や迅速性を考えた場合、ＡＴＰ分解酵素を用いる
方法がより好ましい。ＡＴＰ分解酵素としては、例え
ば、アデノシンリン酸デアミナーゼを単独で使用する
か、または、アピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸
性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリ
ホスファタ−ゼからなる群の少なくとも１種と、アデノ
シンリン酸デアミナーゼとを併用する。この工程におい
て、ＡＴＰ分解酵素がプロテアーゼにより分解されにく
い性質を有する場合は、プロテアーゼを併用することが
好ましい。なお、この第二工程で添加したＡＴＰ分解酵
素は、次の工程に入る前に失活させておくことが好まし
い。なぜなら、この後につづく微生物ＡＴＰ抽出時に、
先に添加したＡＴＰ消去剤（ＡＴＰ分解酵素試薬）が、
試料（検体）中に残存するため、抽出される微生物由来
のＡＴＰが分解され、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反
応の結果生じる発光量の減少がおこり、微生物細胞感度
が低下するからである。酵素活性を失活させる方法とし
ては、特に限定されないが、例えば、活性阻害剤を添加
することにより酵素を失活させる方法が挙げられる。酵
素の活性阻害剤としては、後述するＡＴＰ抽出試薬を添
加使用することができる。さらには、酸またはアルカリ
を添加することにより、試料のｐＨを、該酵素が失活す
る範囲に変化させる方法が使用できる。
元来から存在する遊離ＡＴＰを測定系に影響がないよう
に処理する。すなわち、フィルターを用いる方法や遠心
分離による方法、さらには、溶液中にＡＴＰ分解活性を
有する酵素（以下「ＡＴＰ分解酵素」ということがあ
る）を添加作用せしめＡＴＰを分解する方法など任意の
方法により、遊離ＡＴＰの影響を取り除く。このうち、
簡便性や迅速性を考えた場合、ＡＴＰ分解酵素を用いる
方法がより好ましい。ＡＴＰ分解酵素としては、例え
ば、アデノシンリン酸デアミナーゼを単独で使用する
か、または、アピラ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、酸
性ホスファタ−ゼ、ヘキソキナ−ゼ及びアデノシントリ
ホスファタ−ゼからなる群の少なくとも１種と、アデノ
シンリン酸デアミナーゼとを併用する。この工程におい
て、ＡＴＰ分解酵素がプロテアーゼにより分解されにく
い性質を有する場合は、プロテアーゼを併用することが
好ましい。なお、この第二工程で添加したＡＴＰ分解酵
素は、次の工程に入る前に失活させておくことが好まし
い。なぜなら、この後につづく微生物ＡＴＰ抽出時に、
先に添加したＡＴＰ消去剤（ＡＴＰ分解酵素試薬）が、
試料（検体）中に残存するため、抽出される微生物由来
のＡＴＰが分解され、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反
応の結果生じる発光量の減少がおこり、微生物細胞感度
が低下するからである。酵素活性を失活させる方法とし
ては、特に限定されないが、例えば、活性阻害剤を添加
することにより酵素を失活させる方法が挙げられる。酵
素の活性阻害剤としては、後述するＡＴＰ抽出試薬を添
加使用することができる。さらには、酸またはアルカリ
を添加することにより、試料のｐＨを、該酵素が失活す
る範囲に変化させる方法が使用できる。
【００２１】第三工程：微生物ＡＴＰ抽出剤を添加作用
せしめて微生物由来のＡＴＰを試料中に抽出する。微生
物細胞内ＡＴＰを抽出する方法としては、試料にＡＴＰ
抽出試薬を添加する方法が好適である。ＡＴＰ抽出試薬
としては、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニ
アの混合液、メタノール、エタノール、トリクロル酢
酸、過塩素酸等が使用できるが、このうち界面活性剤は
ＡＴＰの抽出効率が高いの好ましい。界面活性剤として
は、アニオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイル
リン酸ナトリウム、アルキルベン スルホン酸ナトリウ
ム）、カチオン界面活性剤（例えば、塩化ベンザルコニ
ウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZC）、塩化セチル
ピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩
化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム）、両性
（ツイッター）界面活性剤（例えばTwittergent Deterg
ent 3-08, 3-10,3-12, 3-14, 3-16、Tego）、非イオン
性界面活性剤（例えば、 Tween 20, 60, 80、Span 60,
80、 Triton X-45, X-100, ポリオキシエチレンエーテ
ル、ポリオキシエチレンラウリ ルエーテル）が使用で
きる。
せしめて微生物由来のＡＴＰを試料中に抽出する。微生
物細胞内ＡＴＰを抽出する方法としては、試料にＡＴＰ
抽出試薬を添加する方法が好適である。ＡＴＰ抽出試薬
としては、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニ
アの混合液、メタノール、エタノール、トリクロル酢
酸、過塩素酸等が使用できるが、このうち界面活性剤は
ＡＴＰの抽出効率が高いの好ましい。界面活性剤として
は、アニオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイル
リン酸ナトリウム、アルキルベン スルホン酸ナトリウ
ム）、カチオン界面活性剤（例えば、塩化ベンザルコニ
ウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZC）、塩化セチル
ピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩
化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム）、両性
（ツイッター）界面活性剤（例えばTwittergent Deterg
ent 3-08, 3-10,3-12, 3-14, 3-16、Tego）、非イオン
性界面活性剤（例えば、 Tween 20, 60, 80、Span 60,
80、 Triton X-45, X-100, ポリオキシエチレンエーテ
ル、ポリオキシエチレンラウリ ルエーテル）が使用で
きる。
【００２２】第四工程：抽出されたＡＴＰを測定する。
抽出された細胞内ＡＴＰの測定法は、従来公知のＡＴＰ
の測定法により実施することができる（特開平１０−１
４６１９９参照）。このうち特にルシフェリン−ルシフ
ェラーゼ発光試薬を用いる方法（生物発光法）が簡便、
迅速に測定可能で、かつ測定値の信頼性が高い結果が得
られるので好適である。この場合は、抽出されたＡＴＰ
を含む試料を、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬
と接触させ、生成した発光量を測定して微生物内ＡＴＰ
量を求める。生物発光試薬中のルシフェラーゼがホタル
ルシフェラーゼである場合、生物発光試薬は、ルシフェ
リン、ルシフェラーゼおよびマグネシウムイオンを含む
ことが好ましい。生成した発光量は、ルミノメーター、
例えばルミテスター Ｃ−１００、Ｋ−１００、Ｋ−２
００、Ｋ−２１０（いずれもキッコーマン社製）、ルミ
ネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１改良型（アロカ社
製）、Lumat LB9501（ベルトールド社製）により測定
することができる。また、微生物を捕捉した濾過膜を試
料とする場合、生物発光画像解析システム装置、例えば
ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ〔テーパーファイバー付：浜松
ホトニクス（株）社製〕を用いて濾過膜上の輝点を撮像
することにより、微生物数を測定することが可能であ
る。
抽出された細胞内ＡＴＰの測定法は、従来公知のＡＴＰ
の測定法により実施することができる（特開平１０−１
４６１９９参照）。このうち特にルシフェリン−ルシフ
ェラーゼ発光試薬を用いる方法（生物発光法）が簡便、
迅速に測定可能で、かつ測定値の信頼性が高い結果が得
られるので好適である。この場合は、抽出されたＡＴＰ
を含む試料を、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬
と接触させ、生成した発光量を測定して微生物内ＡＴＰ
量を求める。生物発光試薬中のルシフェラーゼがホタル
ルシフェラーゼである場合、生物発光試薬は、ルシフェ
リン、ルシフェラーゼおよびマグネシウムイオンを含む
ことが好ましい。生成した発光量は、ルミノメーター、
例えばルミテスター Ｃ−１００、Ｋ−１００、Ｋ−２
００、Ｋ−２１０（いずれもキッコーマン社製）、ルミ
ネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１改良型（アロカ社
製）、Lumat LB9501（ベルトールド社製）により測定
することができる。また、微生物を捕捉した濾過膜を試
料とする場合、生物発光画像解析システム装置、例えば
ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ〔テーパーファイバー付：浜松
ホトニクス（株）社製〕を用いて濾過膜上の輝点を撮像
することにより、微生物数を測定することが可能であ
る。
【００２３】
【実施例】以下実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】実施例１ （ＡＴＰ消去前処理剤の調製例）ＡＴＰ結合蛋白質分解
活性を有する酵素プロナーゼ（ロッシュ社製）を終濃度
３ｍｇ／ｍｌとなるように滅菌蒸留水に溶解調製して、
微生物ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消
去前処理剤を調製した。
活性を有する酵素プロナーゼ（ロッシュ社製）を終濃度
３ｍｇ／ｍｌとなるように滅菌蒸留水に溶解調製して、
微生物ＡＴＰの測定法において添加使用されるＡＴＰ消
去前処理剤を調製した。
【００２５】実施例２ （ＡＴＰ消去前処理剤の調製例）ＡＴＰ結合蛋白質分解
活性を有する酵素プロナーゼ（ロッシュ社製）および界
面活性剤ドデシルマルトシド（ロッシュ社製）を終濃度
がそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ、０．０５重量％となるように
滅菌蒸留水に溶解して、微生物ＡＴＰの測定法において
添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤を調製した。
活性を有する酵素プロナーゼ（ロッシュ社製）および界
面活性剤ドデシルマルトシド（ロッシュ社製）を終濃度
がそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ、０．０５重量％となるように
滅菌蒸留水に溶解して、微生物ＡＴＰの測定法において
添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤を調製した。
【００２６】実施例３ 微生物が含まれる鳥肉「ささみ」を低温室で保管し、経
時的に約１０ｇサンプリングしたものを試料とし、プロ
テアーゼおよび界面活性剤を有効成分とするＡＴＰ消去
前処理剤を用いて、該試料の前処理を行い、次に遊離Ａ
ＴＰを消去し、さらに微生物内ＡＴＰ由来の発光量を測
定し、微生物数と発光量の相関性を検討した。
時的に約１０ｇサンプリングしたものを試料とし、プロ
テアーゼおよび界面活性剤を有効成分とするＡＴＰ消去
前処理剤を用いて、該試料の前処理を行い、次に遊離Ａ
ＴＰを消去し、さらに微生物内ＡＴＰ由来の発光量を測
定し、微生物数と発光量の相関性を検討した。
【００２７】（１）試料の調製：低温室で保管しておい
たささみを約１０ｇ随時サンプリングし、重さを測定
し、９倍容の滅菌したペプトン加生理食塩水を試料とと
もにストマフィルターＰに移し、ストマッカー４００−
Ｔ（オルガノ社製）でＮＯＲＭ、６０ＳＥＣの条件で処
理を行い、フィルターをとおって出てきた溶液を試料液
とした。
たささみを約１０ｇ随時サンプリングし、重さを測定
し、９倍容の滅菌したペプトン加生理食塩水を試料とと
もにストマフィルターＰに移し、ストマッカー４００−
Ｔ（オルガノ社製）でＮＯＲＭ、６０ＳＥＣの条件で処
理を行い、フィルターをとおって出てきた溶液を試料液
とした。
【００２８】第一工程：試料のＡＴＰ消去前処理 試料０．１ｍｌに、実施例２で得られたＡＴＰ消去前処
理剤０．２ｍｌを添加した後、３７℃で３０分間処理
し、試料のＡＴＰ消去前処理を行った。
理剤０．２ｍｌを添加した後、３７℃で３０分間処理
し、試料のＡＴＰ消去前処理を行った。
【００２９】第二工程：試料中の遊離ＡＴＰの消去 反応処理液（試料）にルシフェールＭｉｌｋ希釈液（キ
ッコーマン社製）０．６ｍｌを添加し、そこに、ＡＴＰ
消去試薬（キッコーマン社製、付属の発光試薬溶解液で
溶解したもの）０．１ｍｌを添加して、攪拌後、室温で
３０分間反応することにより遊離ＡＴＰの消去を行っ
た。
ッコーマン社製）０．６ｍｌを添加し、そこに、ＡＴＰ
消去試薬（キッコーマン社製、付属の発光試薬溶解液で
溶解したもの）０．１ｍｌを添加して、攪拌後、室温で
３０分間反応することにより遊離ＡＴＰの消去を行っ
た。
【００３０】第三工程：微生物内ＡＴＰの抽出 遊離ＡＴＰを消去した試料を０．１ｍｌ採取し、そこ
に、ＡＴＰ抽出試薬（キッコーマン社製）０．１ｍｌを
添加して、攪拌後、２０秒間放置することにより微生物
内ＡＴＰの抽出を行った。
に、ＡＴＰ抽出試薬（キッコーマン社製）０．１ｍｌを
添加して、攪拌後、２０秒間放置することにより微生物
内ＡＴＰの抽出を行った。
【００３１】第四工程：発光量の測定 ＡＴＰ抽出を行った試料０．２ｍｌに、ルシフェール発
光試薬−ＨＳ（キッコーマン社製付属の発光試薬溶解液
で溶解したもの）０．１ｍｌを添加し、直ちに、キッコ
ーマン社製ルミテスター（Ｌｕｍｉｔｅｓｔｅｒ）Ｃ−
１００を用いて、その発光量を測定した。このときの発
光量を、消去されてない遊離ＡＴＰと微生物内ＡＴＰの
トータルの発光量（Ｔ）とした。
光試薬−ＨＳ（キッコーマン社製付属の発光試薬溶解液
で溶解したもの）０．１ｍｌを添加し、直ちに、キッコ
ーマン社製ルミテスター（Ｌｕｍｉｔｅｓｔｅｒ）Ｃ−
１００を用いて、その発光量を測定した。このときの発
光量を、消去されてない遊離ＡＴＰと微生物内ＡＴＰの
トータルの発光量（Ｔ）とした。
【００３２】試料のかわりに、滅菌ペプトン加生理食塩
水を用いて、ＡＴＰ消去の前処理、ＡＴＰの消去、ＡＴ
Ｐ抽出剤の添加、発光量の測定を行った。このときの発
光量を、消去できなかった遊離ＡＴＰ量（フリー値）Ｆ
とした。
水を用いて、ＡＴＰ消去の前処理、ＡＴＰの消去、ＡＴ
Ｐ抽出剤の添加、発光量の測定を行った。このときの発
光量を、消去できなかった遊離ＡＴＰ量（フリー値）Ｆ
とした。
【００３３】トータル値Ｔからフリー値Ｆを減すること
により、微生物内ＡＴＰの正確な発光量を求めることが
でき、これを補正発光量として求めた。
により、微生物内ＡＴＰの正確な発光量を求めることが
でき、これを補正発光量として求めた。
【００３４】（混釈培養法により試料の微生物数ＣＦＵ
／ｍｌの算出試験）通常の混釈培養法を用いて、試料中
に含まれる微生物数を求めた。得られた値を微生物数の
実測値とした。
／ｍｌの算出試験）通常の混釈培養法を用いて、試料中
に含まれる微生物数を求めた。得られた値を微生物数の
実測値とした。
【００３５】まず、試料と滅菌済みペプトン加生理食塩
水で希釈系列を作成し、滅菌シャーレに０．１ｍｌの上
記希釈試料を滅菌ピペットで無菌的に採取し、あらかじ
め、１２１℃２０分間で滅菌処理を行い、その後、約５
０℃に冷却した溶解済みの標準寒天培地（０．２５％酵
母エキス、０．５％トリプトン、０．１％ブドウ糖、ｐ
Ｈ７．１、２．０％寒天）を加え、均一に混和した後、
平板として固めた。次に、その平板を３０℃で４８時間
培養し、出現したコロニーの計測を行った。そのコロニ
ー数より微生物を求め、微生物ＣＦＵとした。
水で希釈系列を作成し、滅菌シャーレに０．１ｍｌの上
記希釈試料を滅菌ピペットで無菌的に採取し、あらかじ
め、１２１℃２０分間で滅菌処理を行い、その後、約５
０℃に冷却した溶解済みの標準寒天培地（０．２５％酵
母エキス、０．５％トリプトン、０．１％ブドウ糖、ｐ
Ｈ７．１、２．０％寒天）を加え、均一に混和した後、
平板として固めた。次に、その平板を３０℃で４８時間
培養し、出現したコロニーの計測を行った。そのコロニ
ー数より微生物を求め、微生物ＣＦＵとした。
【００３６】上記により求められた微生物数と補正発光
量（ＲＬＵ）との相関関係を、図１（本発明のＡＴＰ消
去前処理剤の結果）に示す。
量（ＲＬＵ）との相関関係を、図１（本発明のＡＴＰ消
去前処理剤の結果）に示す。
【００３７】
【比較例】（比較例１）上記実施例３の「微生物数と発
光量の相関性検討試験」において、「ＡＴＰ消去前処理
剤を用いない」以外は全く同様にして、微生物数と発光
量の相関性検討試験を行った。その結果を図２に示す。
光量の相関性検討試験」において、「ＡＴＰ消去前処理
剤を用いない」以外は全く同様にして、微生物数と発光
量の相関性検討試験を行った。その結果を図２に示す。
【００３８】図１および図２の結果から、先ず図１で
は、微生物数と補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係が高
く、傾きが１の直線関係になっているが、本発明のＡＴ
Ｐ消去前処理剤を使用していない図２では、微生物数と
補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係が低く、傾き１の直
線性になっていない。このことから、本発明のＡＴＰ消
去前処理剤を使用した場合は、発光量より試料中の微生
物数を類推することは容易であるが、比較例では、微生
物以外のＡＴＰすなわち標的外ＡＴＰも標的ＡＴＰと共
に測定していることから、発光量より試料中の微生物数
を類推することが困難になっている。この結果、本発明
のＡＴＰ消去前処理剤が、微生物内ＡＴＰの測定法にお
いて好適に使用できることが示された。
は、微生物数と補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係が高
く、傾きが１の直線関係になっているが、本発明のＡＴ
Ｐ消去前処理剤を使用していない図２では、微生物数と
補正発光量（ＲＬＵ）との相関関係が低く、傾き１の直
線性になっていない。このことから、本発明のＡＴＰ消
去前処理剤を使用した場合は、発光量より試料中の微生
物数を類推することは容易であるが、比較例では、微生
物以外のＡＴＰすなわち標的外ＡＴＰも標的ＡＴＰと共
に測定していることから、発光量より試料中の微生物数
を類推することが困難になっている。この結果、本発明
のＡＴＰ消去前処理剤が、微生物内ＡＴＰの測定法にお
いて好適に使用できることが示された。
【００３９】実施例４ 実施例３と同様にして、低温室で保管しておいたささみ
を約１０ｇサンプリングし、重さを測定し、９倍容の滅
菌したペプトン加生理食塩水を試料とともにストマフィ
ルターＰに移し、ストマッカー４００−Ｔ（オルガノ社
製）でＮＯＲＭ、６０ＳＥＣの条件で処理を行い、フィ
ルターをとおって出てきた溶液を試料液とした。次い
で、実施例３の「微生物数と発光量の相関性検討試験」
において、「実施例２のＡＴＰ消去前処理剤（プロナー
ゼと界面活性剤の併用）」を用いる代わりに「実施例１
のＡＴＰ消去前処理剤（プロナーゼ単独使用）」を用い
る以外は、全く同様にして微生物数と発光量の相関性検
討試験を行った。そして、微生物数と補正発光量（ＲＬ
Ｕ）の関係を調べた。結果をまとめて表１に示す。
を約１０ｇサンプリングし、重さを測定し、９倍容の滅
菌したペプトン加生理食塩水を試料とともにストマフィ
ルターＰに移し、ストマッカー４００−Ｔ（オルガノ社
製）でＮＯＲＭ、６０ＳＥＣの条件で処理を行い、フィ
ルターをとおって出てきた溶液を試料液とした。次い
で、実施例３の「微生物数と発光量の相関性検討試験」
において、「実施例２のＡＴＰ消去前処理剤（プロナー
ゼと界面活性剤の併用）」を用いる代わりに「実施例１
のＡＴＰ消去前処理剤（プロナーゼ単独使用）」を用い
る以外は、全く同様にして微生物数と発光量の相関性検
討試験を行った。そして、微生物数と補正発光量（ＲＬ
Ｕ）の関係を調べた。結果をまとめて表１に示す。
【００４０】 表１：本発明のＡＴＰ消去前処理剤を用いたときの補正発光量と微生物数の値 補正発光量 微生物数 （ＲＬＵ） （ＣＦＵ／ｍｌ） プロナーゼ単独使用 ９３２７ １．９×１０5 （実施例１のＡＴＰ消去前処理剤） プロナーゼと界面活性剤の併用 １２６８ １．９×１０5 （実施例２のＡＴＰ消去前処理剤）
【００４１】表１の結果から、ささみに含有される微生
物数が、混釈培養法で微生物数１．９×１０5／ｍｌで
あるとき、（１）ＡＴＰ消去前処理剤を用いないとき
は、図２に示す如く１０5〜１０6のＲＬＵを示すが、
（２）実施例１のＡＴＰ消去前処理剤（プロナーゼ単独
使用）を用いるときは、ＲＬＵを９３２７、即ち約１０
4のレベルまで低減することが可能となり、また（３）
実施例２のＡＴＰ消去前処理剤（プロナーゼと界面活性
剤の併用）を用いるときは、ＲＬＵを１２６８、即ち１
０3のレベルまで低減することが可能となることが判
る。このことから、ＡＴＰ消去前処理剤としてＡＴＰ結
合蛋白質分解活性を有する酵素プロナーゼを使用するこ
とにより、補正発光量と菌数の相関は改善されるが、さ
らにＡＴＰ消去前処理剤にプロナーゼと界面活性剤を併
用することにより、微生物以外のＡＴＰをより効果的に
消去できることが判る。
物数が、混釈培養法で微生物数１．９×１０5／ｍｌで
あるとき、（１）ＡＴＰ消去前処理剤を用いないとき
は、図２に示す如く１０5〜１０6のＲＬＵを示すが、
（２）実施例１のＡＴＰ消去前処理剤（プロナーゼ単独
使用）を用いるときは、ＲＬＵを９３２７、即ち約１０
4のレベルまで低減することが可能となり、また（３）
実施例２のＡＴＰ消去前処理剤（プロナーゼと界面活性
剤の併用）を用いるときは、ＲＬＵを１２６８、即ち１
０3のレベルまで低減することが可能となることが判
る。このことから、ＡＴＰ消去前処理剤としてＡＴＰ結
合蛋白質分解活性を有する酵素プロナーゼを使用するこ
とにより、補正発光量と菌数の相関は改善されるが、さ
らにＡＴＰ消去前処理剤にプロナーゼと界面活性剤を併
用することにより、微生物以外のＡＴＰをより効果的に
消去できることが判る。
【００４２】
【発明の効果】従来の微生物ＡＴＰの測定法において
は、体細胞ＡＴＰ抽出剤およびＡＴＰ消去剤によって処
理できない、試料由来のＡＴＰ結合蛋白質、ＡＴＰ結合
ペプチド、ＡＴＰと結合した細胞片、およびＡＴＰと結
合した組織片など、ＡＴＰ結合体を含有する試料中の該
ＡＴＰは、前述した理由によりバックグラウンドとして
検出されるため、試料の微生物数を正確に測定できない
という問題があったが、本発明によれば、上記ＡＴＰ結
合体の該ＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめるた
め、正確に微生物数を測定することが可能となる。ま
た、穀類、豆類、果実、野菜、それらの加工食品を試料
とする場合でも、同様に正確に微生物数を測定すること
が可能となる。そして特に、微生物に汚染された魚介畜
肉類加工食品（特に食肉、その加工食品）を試料として
用い、上記汚染微生物ＡＴＰを測定しようとするとき、
この試料中のバックグラウンドＡＴＰの消去（または低
減）は非常に困難で、微生物ＡＴＰの検出限界が低くな
り、このため微生物汚染度の低い試料中の該微生物数を
測定しようとする場合、微生物ＡＴＰの測定法を利用で
きない場合が多いという問題があったが、本発明によれ
ば、試料中のバックグラウンドＡＴＰの消去（または低
減）が容易となり、高感度に微生物数を測定することが
可能となる。本発明のＡＴＰ消去前処理剤を用いると、
測定系から生じる発光を測定することにより、ＡＴＰの
消去状況の確認を簡単に行なうことができる。本発明
は、遊離ＡＴＰの消去する方法として好適である。ま
た、本発明のＡＴＰ消去剤は特に、試料中の遊離ＡＴＰ
を消去して細胞内ＡＴＰを測定する方法において好適に
使用できる。本発明によれば、飲食物、医薬品、化粧品
等の各工業製品、その半製品、その原料、海水、河川
水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血液、喀痰、膿
汁、細胞の培養液および空気などに含まれる微生物ＡＴ
Ｐの測定法に利用され、また細菌汚染検査、清浄度検
査、拭き取り検査などにも利用され、高感度な微生物数
の測定が可能となる。また、測定系（例えば、試料、培
地、各種試薬、容器、測定器具、測定装置等）にＡＴＰ
やＡＴＰ結合体が混入することによる測定感度の低下が
問題となっていた試料の微生物ＡＴＰの高感度測定が可
能となる。
は、体細胞ＡＴＰ抽出剤およびＡＴＰ消去剤によって処
理できない、試料由来のＡＴＰ結合蛋白質、ＡＴＰ結合
ペプチド、ＡＴＰと結合した細胞片、およびＡＴＰと結
合した組織片など、ＡＴＰ結合体を含有する試料中の該
ＡＴＰは、前述した理由によりバックグラウンドとして
検出されるため、試料の微生物数を正確に測定できない
という問題があったが、本発明によれば、上記ＡＴＰ結
合体の該ＡＴＰを、試料中に効率よく遊離せしめるた
め、正確に微生物数を測定することが可能となる。ま
た、穀類、豆類、果実、野菜、それらの加工食品を試料
とする場合でも、同様に正確に微生物数を測定すること
が可能となる。そして特に、微生物に汚染された魚介畜
肉類加工食品（特に食肉、その加工食品）を試料として
用い、上記汚染微生物ＡＴＰを測定しようとするとき、
この試料中のバックグラウンドＡＴＰの消去（または低
減）は非常に困難で、微生物ＡＴＰの検出限界が低くな
り、このため微生物汚染度の低い試料中の該微生物数を
測定しようとする場合、微生物ＡＴＰの測定法を利用で
きない場合が多いという問題があったが、本発明によれ
ば、試料中のバックグラウンドＡＴＰの消去（または低
減）が容易となり、高感度に微生物数を測定することが
可能となる。本発明のＡＴＰ消去前処理剤を用いると、
測定系から生じる発光を測定することにより、ＡＴＰの
消去状況の確認を簡単に行なうことができる。本発明
は、遊離ＡＴＰの消去する方法として好適である。ま
た、本発明のＡＴＰ消去剤は特に、試料中の遊離ＡＴＰ
を消去して細胞内ＡＴＰを測定する方法において好適に
使用できる。本発明によれば、飲食物、医薬品、化粧品
等の各工業製品、その半製品、その原料、海水、河川
水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血液、喀痰、膿
汁、細胞の培養液および空気などに含まれる微生物ＡＴ
Ｐの測定法に利用され、また細菌汚染検査、清浄度検
査、拭き取り検査などにも利用され、高感度な微生物数
の測定が可能となる。また、測定系（例えば、試料、培
地、各種試薬、容器、測定器具、測定装置等）にＡＴＰ
やＡＴＰ結合体が混入することによる測定感度の低下が
問題となっていた試料の微生物ＡＴＰの高感度測定が可
能となる。
【図１】実施例３における微生物数と補正発光量との相
関性を示す図
関性を示す図
【図２】比較例１における微生物数と補正発光量との相
関性を示す図
関性を示す図
Claims (5)
- 【請求項１】プロテアーゼ活性を有する酵素を有効成分
として含有する、微生物ＡＴＰの測定法において添加使
用されるＡＴＰ消去前処理剤。 - 【請求項２】プロテアーゼ活性を有する酵素と界面活性
剤とをそれぞれ有効成分として含有する、微生物ＡＴＰ
の測定法において添加使用されるＡＴＰ消去前処理剤。 - 【請求項３】プロテアーゼ活性を有する酵素が、ＡＴＰ
結合蛋白質分解活性を有する酵素である請求項１または
請求項２に記載されたＡＴＰ消去前処理剤。 - 【請求項４】微生物を含有する試料にＡＴＰ消去剤を添
加作用せしめて該試料中の遊離ＡＴＰを消去する第一工
程、これに微生物ＡＴＰ抽出剤を添加作用せしめて微生
物由来のＡＴＰを試料中に遊離せしめる第二工程、ここ
で遊離したＡＴＰを測定する第三工程をこの順序で行う
微生物ＡＴＰの測定法において、第一工程と同時または
同工程に先立ち、請求項１〜請求項３のいずれかに記載
されたＡＴＰ消去前処理剤を該試料に添加作用せしめる
ことを特徴とする微生物ＡＴＰの高感度測定法。 - 【請求項５】遊離したＡＴＰを測定する手段として、ル
シフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬を使用することを
特徴とする請求項４に記載された微生物ＡＴＰの高感度
測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32195399A JP2001136999A (ja) | 1999-11-12 | 1999-11-12 | 微生物ａｔｐの測定法において添加使用されるａｔｐ消去前処理剤および同処理剤を用いる微生物ａｔｐの高感度測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32195399A JP2001136999A (ja) | 1999-11-12 | 1999-11-12 | 微生物ａｔｐの測定法において添加使用されるａｔｐ消去前処理剤および同処理剤を用いる微生物ａｔｐの高感度測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001136999A true JP2001136999A (ja) | 2001-05-22 |
Family
ID=18138281
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP32195399A Pending JP2001136999A (ja) | 1999-11-12 | 1999-11-12 | 微生物ａｔｐの測定法において添加使用されるａｔｐ消去前処理剤および同処理剤を用いる微生物ａｔｐの高感度測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001136999A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002092843A1 (fr) * | 2001-05-16 | 2002-11-21 | Kikkoman Corporation | Technique de comptage de cellules microbiennes |
| EP2505990A1 (en) | 2011-03-30 | 2012-10-03 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Luminescence measuring apparatus and microbe counting apparatus |
| JP2013005765A (ja) * | 2011-06-24 | 2013-01-10 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 液体中のａｔｐ測定方法 |
| WO2014061785A1 (ja) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | 株式会社日立製作所 | 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 |
| WO2014061787A1 (ja) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | 株式会社日立製作所 | 生体物質定量方法及び生体物質定量装置 |
-
1999
- 1999-11-12 JP JP32195399A patent/JP2001136999A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002092843A1 (fr) * | 2001-05-16 | 2002-11-21 | Kikkoman Corporation | Technique de comptage de cellules microbiennes |
| EP2505990A1 (en) | 2011-03-30 | 2012-10-03 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Luminescence measuring apparatus and microbe counting apparatus |
| JP2013005765A (ja) * | 2011-06-24 | 2013-01-10 | Hitachi Plant Technologies Ltd | 液体中のａｔｐ測定方法 |
| WO2014061785A1 (ja) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | 株式会社日立製作所 | 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 |
| WO2014061787A1 (ja) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | 株式会社日立製作所 | 生体物質定量方法及び生体物質定量装置 |
| JP2014082946A (ja) * | 2012-10-19 | 2014-05-12 | Hitachi Ltd | 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 |
| JP2014085130A (ja) * | 2012-10-19 | 2014-05-12 | Hitachi Ltd | 生体物質定量方法及び生体物質定量装置 |
| US9988663B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-06-05 | Hitachi, Ltd. | Method for collecting biological material and device for collecting biological material |
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