JPH11299476A - Ａｔｐ消去剤含有微生物培養寒天培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 メンブレン法寒天培養をなす系において、菌
由来のＡＴＰに基づく発光を輝点として遊離ＡＴＰに基
づく発光と峻別し、選択的に観測するために前記ＡＴＰ
消去剤を寒天培地に適用すること。 【解決手段】 アデノシンリン酸デアミナーゼをＡＴＰ
消去剤として含有する寒天培地、あるいはアピラーゼ、
アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソ
キナーゼ及びアデノシントリホスファターゼからなる群
から選ばれる少なくとも一種を更に含有する寒天培地、
並びにメンブレンフィルターを適用して濾過、捕集した
後の菌培養にその寒天培地を適用し、増殖した菌由来の
ＡＴＰに基づく発光を輝点として選択的に測定する生菌
数測定方法が開示される。本発明は、遊離のＡＴＰに基
づくノイズ発光を低減することができるので、より正確
かつ迅速な菌計数方法として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、菌由来のアデノシ
ン５’−三リン酸（以下「ＡＴＰ」と略記する）に基づ
く発光を利用した、菌に関する情報収集（例えば菌数の
測定、菌含有ＡＴＰ定量）を行う際に用いた場合、測定
や定量の環境からもたらされる挟雑物としての遊離ＡＴ
Ｐを消去もしくは低減（以下、単に「低減」と表現す
る）する効果を持つ寒天培地、並びにこの寒天培地を利
用した、ノイズ発光を低減した正確な菌数の測定方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】これまでも、菌由来のＡＴＰに基づく発
光を利用して迅速に菌数を測定・定量することは種々試
みられてきた。例えば、測定した総発光量を菌１個相当
の発光量で割って菌数を求めるバイオルミネッセンス法
（以下、「間接菌計数法」と呼称する）が特開平２−５
７１９７号、特開平２−１６３０９８号、「食品微生物
検査の簡易化、自動化、迅速化」（春田三佐夫他、第５
８頁、サイエンスフォーラム（１９８５）日本）等に開
示され、更に菌もしくはコロニー由来のＡＴＰに基づく
発光を濾過膜上で輝点として観測して輝点数を元の検体
中の菌数とする、より直接的な菌数測定方法（以下、
「直接菌計数法」と呼称する）が特開平４−３０７９８
号や特開平６−２３７７９３号等に開示されている。

【０００３】ここでいう「ＡＴＰに基づく発光」とは、
ルシフェラーゼとマグネシウムの存在下、ルシフェリン
が周囲に存在する酸素で酸化され、オキシルシフェリン
が生成する工程で光エネルギーを放出することに基づく
発光のことであり、感度の高い検出法を用いてＡＴＰに
基づく発光を検出することで、微量の菌に関する情報ま
で得られると理解されている。直接菌計数法において
は、正確な計数をなすためにノイズとしての発光を峻
別、排除することが必要である。そのためまず従来法に
よる菌計数と同一結果を得るべく試行錯誤を繰り返して
ノイズとして検出すべき発光レベルを設定し、画像処理
して排除する必要がある。菌由来の発光レベルとノイズ
としての発光レベルに大差が生じて初めて正確な計数が
得られる。

【０００４】この様な菌由来のＡＴＰに基づく発光を利
用して特に微量の菌に関する情報を得ようとする際に
は、感度の高い発光検出法を適用することが考えられ
る。しかし、通常測定系に混入する遊離のＡＴＰに基づ
く発光も相対的に有意となり併せて観測されてしまい、
正確に測定・定量すべき菌由来の発光だけを観測するこ
とは困難となる。特に微量の菌を対象とする前記直接菌
計数法においては、輝点数を計測する際に、混入する遊
離のＡＴＰに基づく発光輝点、いわゆるノイズ発光によ
る輝点も測定されてしまい、正確な菌数測定が妨げられ
てしまう。

【０００５】従って、菌由来の発光輝点を計数して菌数
を測定する方法において、これらのノイズ輝点を低減す
ることが望まれてきた。そのようなノイズ輝点が低減さ
れる菌数測定方法は効率が良いので、広く適用されるこ
とが期待されてきた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】かかる問題に対して本
願発明者は既に一つの解決策として特願平９−３１７７
９２号を提案している。すなわち、メンブレンフィルタ
ーに付着する測定対象の菌に由来しない遊離のＡＴＰに
基づく輝点を低減する方法を提案している。そして更に
研究を重ねたところ、測定系に混入する遊離のＡＴＰと
しては、メンブレンフィルターに付着するＡＴＰに限ら
ず、培養のための寒天培地成分中に混入した遊離のＡＴ
Ｐ、さらに検査対象の検体中に存在する測定すべき菌と
は別に濾液と共に流去されずにメンブレンフィルターに
付着した遊離のＡＴＰ、さらにまた周辺環境からも随時
混入して輝点として観測される遊離のＡＴＰなどがあ
り、正確な菌に関する情報を得るためには更に改善が必
要であることがわかった。

【０００７】もっとも、これらの遊離のＡＴＰを低減す
るＡＴＰ消去剤は既に特開平９−１８２６００号に開示
されており、溶液系（より厳密には固体である菌などが
存在するので固液混合系というべきだが外観上溶液を呈
している溶液系）における菌由来のＡＴＰに基づく総発
光量を測定する前記間接菌計数法に好適に適用されてい
る。一方、直接菌計数法は、溶液系ではなくメンブレン
法寒天培養をなす固相系であり、「微量の菌含有検体に
対して濾過操作を導入することにより容易に菌を濃縮、
捕捉する」ことを長所とする。直接菌計数法のこの長所
を生かしながら、菌由来のＡＴＰに基づく発光を輝点と
して選択的に観測するように、前記ＡＴＰ消去剤を直接
菌計数法に適切に応用適用することが求められてきた。

【０００８】しかし、固相系でＡＴＰを低減するにあた
っては、前記溶液系とは異なり、寒天培地及びその上の
メンブレンフィルター領域における分解酵素（アデノシ
ンリン酸デアミナーゼやアピラーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノ
シントリホスファターゼ）と遊離ＡＴＰの適切な移動、
並びにこれに続く適切な反応速度を確保することが欠か
せず、溶液系での反応生起が既知とされても濾過膜を寒
天培地に設置して培養する系で同様な現象、特に素早い
物質移動を予測することは著しく困難であり検討が必要
であった。

【０００９】本発明者は、このような背景の下に、固相
系でのＡＴＰ分解反応について更に鋭意検討した結果、
新規な微生物培養寒天培地と、これを用いた前記種々の
原因に由来する遊離のＡＴＰに基づく輝点を低減するよ
り正確な生菌数の測定方法を見出した。更に詳しくは、
菌数測定に至るまでの一連の操作中種々な原因に由来す
る遊離のＡＴＰに基づく輝点を低減し続け得る生菌数の
測定方法を見出し、本発明を完成した。

【００１０】従って本発明の一つの目的は、遊離のＡＴ
Ｐに基づく輝点を低減する寒天培地を提供することにあ
る。本発明の他の目的は、上記寒天培地を用いた、より
正確かつ迅速な菌数測定方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の一つの態様によ
れば、アデノシンリン酸デアミナーゼをＡＴＰの消去剤
として含有する微生物培養寒天培地が提供される。寒天
培地の作成については常法に従って行えばよい。ここで
いう寒天培地は、例えば寒天濃度０．６ｇ〜３０ｇ／ｌ
ｉｔｅｒの寒天培地であり、寒天濃度の上限は分解酵素
の通常の培養温度における物質移動速度の確保から決定
され、下限は固体培地形成から決定されるが、詳細は培
地構成成分に応じて決定される。アデノシンリン酸デア
ミナーゼは市販のものをそのまま必要量用い、添加の仕
方も通常の寒天培地の一成分とみなして取り扱えば良
い。重要なことはアデノシンリン酸デアミナーゼを十分
均一な溶液として加え混合することである。ただし、分
解酵素の必要量に関しては対象とする菌含有の検体中の
ＡＴＰ含量が一律に予測できないこと、測定環境中の遊
離ＡＴＰが状況により異なること、寒天培地の各成分に
混入している遊離ＡＴＰ含量を一律に論じがたいこと及
び培養時間などから、あらかじめ特定することは困難で
若干の試行錯誤は欠かせない。しかしながら、１日程度
の培養を行うに当たって調製すべき寒天培地中の分解酵
素濃度は概ね０．０５〜１Ｕ／（ｍｌ−寒天培地）に設
定するのが良い。

【００１２】本発明の他の一つの態様によれば、アデノ
シンリン酸デアミナーゼの他にＡＴＰ消去剤を更に含有
する微生物培養寒天培地が提供される。ここでいう更な
るＡＴＰ消去剤とは、例えばアピラーゼ、アルカリホス
ファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及び
アデノシントリホスファターゼからなる群から選ばれる
少なくとも一種である。これらの分解酵素についても市
販のものをそのまま必要量用いればよい。その他の条件
についても、アデノシンリン酸デアミナーゼを単独で用
いる場合と同様の注意が払われれば良い。

【００１３】本発明の更に他の一つの態様によれば、メ
ンブレンフィルターを適用して濾過、捕集、培養し、増
殖した菌に由来するＡＴＰに基づく発光を輝点として測
定する生菌数測定方法において、培養が上記寒天培地上
でなされることを特徴とする生菌数測定方法が提供され
る。この直接菌数計数法においては、寒天培地中の遊離
ＡＴＰが前述の分解酵素で分解される。さらに好都合な
ことには、濾過膜に存在する濾過膜由来のＡＴＰ、濾過
時試料に含まれ菌と共に濾過膜上に捕集された遊離のＡ
ＴＰ、並びに濾過時・更には培養中に環境からもたらさ
れる遊離のＡＴＰが、培養中に寒天培地から濾過膜を介
して供給される前述の分解酵素により分解され、培養終
了時に菌由来のＡＴＰを菌より抽出するときには、検出
されても極めて小さなノイズ発光を呈するだけとなる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、実施例を挙げて本発明を更
に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるも
のではない。

【００１５】

【実施例】（実施例１）表１に示した培地１ｍｌ当たり
ＡＴＰ分解酵素アデノシンリン酸デアミナーゼを０．２
Ｕ加えた各種寒天培地（寒天含有１５ｇ／培地−１．０
リットル）に、格子付き特殊濾過膜（ＲＭＨＶ、４７ｍ
ｍφ、日本ミリポア社製）を置き３５℃、６時間放置し
た後、濾過膜を取り出し標本ホルダーに載せ風乾した。
その上方を中空のプラスチック製カバーで覆い、抽出試
薬を２０秒間噴霧し、風乾し、次いで発光試薬を７秒間
噴霧した。発光を観測するため、標本を測定器のカメラ
上において２分間フォトンカウンティングし、画像処理
（area analysis ）で全フォトン数を測定した。また、
対照としてＡＴＰ分解酵素を含有しない各種寒天培地で
同様の操作を行った後全フォトン数を測定した。結果を
表１に示す。ＡＴＰ分解酵素による処理で各寒天培地お
よび濾過膜由来のノイズフォトン数が著しく減少するこ
とがわかった。

【００１６】

【表１】

【００１７】（実施例２）濾過膜（ＲＭＨＶ、４７ｍｍ
φ、日本ミリポア社製）を装着した濾過器に２０ｍｌの
無菌水と果実ジュース１ｍｌを加え吸引濾過した後、１
ｍｌあたりＡＴＰ分解酵素アピラーゼ及びアデノシンリ
ン酸デアミナーゼを各０．２Ｕ含むソイビーンカゼイン
ダイジェスト寒天培地（日本製薬製、寒天含有率２重量
パーセント／容積）上にこの濾過膜を３５℃で４時間放
置した。実施例１と同様に濾過膜を取り出し、標本ホル
ダーに載せ風乾し、抽出試薬を噴霧し、風乾し、発光試
薬を噴霧して発光させた。標本をカメラ上に置いてフォ
トンカウンティングした後、画像処理によりフォトン数
を測定した。ＡＴＰ分解酵素を含有しない寒天培地で同
様な処理をして発光を測定し、対照とした。比較結果を
表２に示す。分解酵素処理でサンプル由来のノイズを含
めたフォトン数が著しく減少しその効果が確認された。

【００１８】

【表２】

【００１９】（実施例３）培地１ｍｌあたりアピラーゼ
及びアデノシンリン酸デアミナーゼを各０．２Ｕ含むＡ
ＴＰ分解酵素液に３０℃で１時間浸漬した後、風乾した
特殊濾過膜（ＲＭＨＶ、４７ｍｍφ、日本ミリポア社
製）を寒天含有３ｗｔ％／ｖｏｌのＰＤ寒天培地（日水
製薬製）上に置き３０℃で4 時間培養した。別途、上記
ＡＴＰ分解酵素処理を行わない特殊濾過膜（ＲＭＨＶ、
４７ｍｍφ、日本ミリポア社製）を、培地１ｍｌあたり
アピラーゼ及びアデノシンリン酸デアミナーゼを各０．
２Ｕ含むＡＴＰ分解酵素液を含む寒天含有３ｗｔ％／ｖ
ｏｌのＰＤ寒天培地（日水製薬製）上に置き３０℃で４
時間培養した。操作後、実施例２と同様にして風乾、Ａ
ＴＰ抽出、風乾、発光させてフォトンカウンティング
し、画像処理により濾過膜上面の全フォトン数を測定し
た。また、ＡＴＰ分解酵素処理をしない濾過膜を、ＡＴ
Ｐ分解酵素を含有しない寒天含有３ｗｔ％／ｖｏｌのＰ
Ｄ寒天培地（日水製薬製）上で同様に培養して対照とし
た。比較結果を表３に示す。ＡＴＰ分解酵素に浸漬した
濾過膜でもかなりのノイズ低減効果がみられるが、ＡＴ
Ｐ分解酵素を寒天培地に加えて培養した濾過膜で測定さ
れる全フォトン数が最も少なくノイズの低減がより効果
的になされていることが判った。

【００２０】

【表３】

【００２１】（実施例４）ソイビーンカゼインダイジェ
スト培地（日本製薬製）５ｍｌを含む中試験管に１白金
耳のエシェリシェア コリ（Escherichia coli. ＩＦＯ
３３０１）を接種して３５℃で一夜培養した後、無菌水
で約１００ＣＦＵ／ｍｌになるように希釈し、得られた
希釈液の０．２ｍｌを検体液とした。格子付き濾過膜
（ＲＭＨＶ、４７ｍｍφ、日本ミリポア社製）を装着し
た濾過器に無菌水２０ｍｌ、果実ジュース１ｍｌ及び上
述の検体液０．２ｍｌを加えて吸引濾過した。以下に記
すように、異なる培養と観察の組み合わせからなる４つ
の方法を行い表４の結果を得た。

【００２２】第法：１ｍｌあたりアピラーゼ（シグマ
社製）及びアデノシンリン酸デアミナーゼ（キッコーマ
ン社製）を各０．２Ｕ含む寒天含有量１５．０ｇ／（ｌ
ｉｔｅｒ−培地）のソイビーンカゼインダイジェスト寒
天培地上に濾過膜を置いて３５℃で４時間培養した。培
養後、濾過膜を風乾、ＡＴＰ抽出、風乾、発光させフォ
トンカウンティングして輝点数を測定した。（本願の輝
点計数法） 第法：ＡＴＰ分解酵素を含まない通常の寒天含有量１
５．０ｇ／（ｌｉｔｅｒ−培地）のソイビーンカゼイン
ダイジェスト寒天培地上に濾過膜を置いて３５℃で４時
間培養した。培養後、濾過膜を風乾、ＡＴＰ抽出、風
乾、発光させフォトンカウンティングして輝点数を測定
した。（従来の輝点計数法） 第法：１ｍｌあたりアピラーゼ（シグマ社製）及びア
デノシンリン酸デアミナーゼ（キッコーマン社製）を各
０．２Ｕ含む寒天含有量１５．０ｇ／（ｌｉｔｅｒ−培
地）のソイビーンカゼインダイジェスト寒天培地上に濾
過膜を置いて３５℃で３日間培養した。次いで生成した
コロニー数を計測した。（本願培地ＭＦ法） 第法：ＡＴＰ分解酵素を含まない通常の寒天含有量１
５．０ｇ／（ｌｉｔｅｒ−培地）のソイビーンカゼイン
ダイジェスト寒天培地上に濾過膜を置いて３５℃で３日
間培養した。次いで生成したコロニー数を計測した。
（従来ＭＦ法）

【００２３】

【表４】

【００２４】表４より、３５℃で３日間培養した後のコ
ロニー計数値について、ＡＴＰ分解酵素を添加した際は
２８、無添加の際には２９であり、両者には差が無くＡ
ＴＰ分解酵素添加が培養へ与える影響が無いことが判
る。一方、３５℃で４時間培養した後の輝点計数値は本
願方法である第法においてはＭＦ法（即ち、第法な
いしは第法）とほぼ同様の結果を得ることが出来た
が、第法においては極めて少ない計数値しか得られな
かったことが判る。即ち、培地へＡＴＰ分解酵素が添加
されない場合はバックグランドのノイズ発光が多く、か
つバックグランドのノイズ発光と短時間培養に基づく菌
由来の小さな輝点との峻別が困難なことが上記計数誤り
の原因となったものと考えられる。

【００２５】

【発明の効果】ＡＴＰ分解酵素を含有する本発明の新規
な寒天培地を使用すると、寒天培地中の遊離ＡＴＰが分
解酵素で分解されるので、菌由来のＡＴＰに基づく発光
を観測する生菌数測定方法、即ち直接菌数計数法におい
て、ノイズ発光を低減した、正確かつ迅速な菌計数が可
能となり有用である。さらに、濾過膜に存在する濾過膜
由来のＡＴＰ、濾過時試料に含まれ菌と共に濾過膜上に
捕集された遊離のＡＴＰ、並びに濾過時・更には培養中
に環境からもたらされる遊離のＡＴＰが、培養中に寒天
培地から濾過膜を介して供給される前述の分解酵素によ
り分解され、培養終了時、菌由来のＡＴＰを菌より抽出
する際には、ノイズが低減されているので、より正確か
つ迅速な直接菌数計数が可能となり有用である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アデノシンリン酸デアミナーゼをアデノ
   シン５’−三リン酸の消去剤として含有する微生物培養
   寒天培地。
2. 【請求項２】 アデノシン５’−三リン酸の消去剤とし
   てアピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファ
   ターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファタ
   ーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種を更に含有
   する請求項１に記載の微生物培養寒天培地。
3. 【請求項３】 メンブレンフィルターを適用して濾過、
   捕集、培養し、増殖した菌に由来するアデノシン５’−
   三リン酸に基づく発光を輝点として捉え測定する生菌数
   測定方法において、請求項１又は２に記載の微生物培養
   寒天培地上で培養することを特徴とする生菌数測定方
   法。