JPH06237793A - 生菌数を測定する方法 - Google Patents
生菌数を測定する方法Info
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- JPH06237793A JPH06237793A JP5044397A JP4439793A JPH06237793A JP H06237793 A JPH06237793 A JP H06237793A JP 5044397 A JP5044397 A JP 5044397A JP 4439793 A JP4439793 A JP 4439793A JP H06237793 A JPH06237793 A JP H06237793A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 検出感度を増大させた生菌数測定方法を提供
する。 【構成】 疎水性の濾過膜で生菌を含む検体液を濾過
し、その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉
し、その上から生菌中の発光成分を抽出するための液体
抽出試薬を霧状に噴霧し、次いで該発光成分を発光させ
る液体発光試薬を霧状に噴霧して発光させ、その発光量
を発光量測定装置を用いて測定する。
する。 【構成】 疎水性の濾過膜で生菌を含む検体液を濾過
し、その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉
し、その上から生菌中の発光成分を抽出するための液体
抽出試薬を霧状に噴霧し、次いで該発光成分を発光させ
る液体発光試薬を霧状に噴霧して発光させ、その発光量
を発光量測定装置を用いて測定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は食品、製薬、化粧品、電
子工業等の分野で使用する水、原料、中間体或いは製品
等の中に存在する生菌の菌数を迅速、簡便且つ高感度で
測定する方法に関する。
子工業等の分野で使用する水、原料、中間体或いは製品
等の中に存在する生菌の菌数を迅速、簡便且つ高感度で
測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食品、製薬、化粧品等の分野では周知の
ように使用する水、原料、中間体或いは製品中の生菌の
管理が極めて重要である。又、電子工業でも使用する水
の水質管理は重要であって、その中の細菌数は常に把握
しておく必要がある。そのため、それらの工業分野にお
いては生菌の菌数測定が必須となっている。
ように使用する水、原料、中間体或いは製品中の生菌の
管理が極めて重要である。又、電子工業でも使用する水
の水質管理は重要であって、その中の細菌数は常に把握
しておく必要がある。そのため、それらの工業分野にお
いては生菌の菌数測定が必須となっている。
【０００３】これらの生菌数の測定には、従来より検体
中に存在する生菌を寒天平板培地上で培養しコロニーを
生成せしめて検出する、食品衛生検査指針に基く、いわ
ゆる標準寒天平板法が一般的に用いられているが、この
方法は手間がかかる上に判定までに長時間を要し、微生
物の有無の判定あるいは微生物数などの検査結果の判定
が遅れるため、特に製造あるいは製品出荷の段階で判定
待ち時間を要し、時間的空間的に大きなロスとなってい
る。したがって、より簡便な方法の開発が望まれてい
た。
中に存在する生菌を寒天平板培地上で培養しコロニーを
生成せしめて検出する、食品衛生検査指針に基く、いわ
ゆる標準寒天平板法が一般的に用いられているが、この
方法は手間がかかる上に判定までに長時間を要し、微生
物の有無の判定あるいは微生物数などの検査結果の判定
が遅れるため、特に製造あるいは製品出荷の段階で判定
待ち時間を要し、時間的空間的に大きなロスとなってい
る。したがって、より簡便な方法の開発が望まれてい
た。
【０００４】この要望に応えて種々の迅速検出方法の提
案がなされており、例えば、検体液中の生菌数が充分に
多い場合は、少量を小試験管に採取したり、又、生菌数
がやや少ない場合はフィルターを用いて濾過捕捉して濃
縮した後濾過膜を取り外し、極く少量の無菌水等にフィ
ルターを浸漬し生菌を懸濁した後、その一部を小試験管
に採取し、これに抽出試薬および発光試薬を加えて菌体
中のアデノシン三リン酸（以下ＡＴＰと略す）の量をル
ミノメーターを用いて測定し、これから生菌数を算出す
るバイオミルネッセンス法が知られている（特開平２−
５７１９７号、特開平２−１６３０９８号等、春田三佐
夫他「食品微生物検査の簡易化、自動化、迅速化」第５
８頁、サイエンスフォーラム（１９８５）日本）。
案がなされており、例えば、検体液中の生菌数が充分に
多い場合は、少量を小試験管に採取したり、又、生菌数
がやや少ない場合はフィルターを用いて濾過捕捉して濃
縮した後濾過膜を取り外し、極く少量の無菌水等にフィ
ルターを浸漬し生菌を懸濁した後、その一部を小試験管
に採取し、これに抽出試薬および発光試薬を加えて菌体
中のアデノシン三リン酸（以下ＡＴＰと略す）の量をル
ミノメーターを用いて測定し、これから生菌数を算出す
るバイオミルネッセンス法が知られている（特開平２−
５７１９７号、特開平２−１６３０９８号等、春田三佐
夫他「食品微生物検査の簡易化、自動化、迅速化」第５
８頁、サイエンスフォーラム（１９８５）日本）。
【０００５】しかしながら、これらの方法は、生菌数が
少ない検体液の場合（例えば１０3 〜１０4 個／ｍｌ以
下）ではＡＴＰ量がルミノメーターの測定限界以下のた
め検出が不可能であり、かかる場合には例えば検体液の
生菌を濾過捕捉した濾過膜要素をその生菌の増殖に適し
た栄養成分を含む培地で培養を行い、生菌数を検出限界
以上に増加させてから菌数測定を行わなければならない
という高度な技術を必要とする等問題点があり、より一
層の改善が求められていた。
少ない検体液の場合（例えば１０3 〜１０4 個／ｍｌ以
下）ではＡＴＰ量がルミノメーターの測定限界以下のた
め検出が不可能であり、かかる場合には例えば検体液の
生菌を濾過捕捉した濾過膜要素をその生菌の増殖に適し
た栄養成分を含む培地で培養を行い、生菌数を検出限界
以上に増加させてから菌数測定を行わなければならない
という高度な技術を必要とする等問題点があり、より一
層の改善が求められていた。
【０００６】一方、濾過膜に非湿潤性の炭化水素系ワッ
クス、ワセリン、シリコンワックス又はオイル、或いは
エポキシ樹脂、ポリテトラフルオロエチレン又はポリス
チレン樹脂の溶液で正方形、長方形、円形等の格子状に
プリントされたものを用いて微生物を格子区画内に濾過
捕捉し、これを例えば３０℃、２４時間培養して該区画
に重複と合流を避ける方法によりコロニーを形成させて
のちコロニーと濾過膜の表面の間に高い光学コントラス
トを作らせ、コロニーのみを自動計測する方法がある
（米国特許第３，９２９，５８３号）。
クス、ワセリン、シリコンワックス又はオイル、或いは
エポキシ樹脂、ポリテトラフルオロエチレン又はポリス
チレン樹脂の溶液で正方形、長方形、円形等の格子状に
プリントされたものを用いて微生物を格子区画内に濾過
捕捉し、これを例えば３０℃、２４時間培養して該区画
に重複と合流を避ける方法によりコロニーを形成させて
のちコロニーと濾過膜の表面の間に高い光学コントラス
トを作らせ、コロニーのみを自動計測する方法がある
（米国特許第３，９２９，５８３号）。
【０００７】しかし、同方法は生菌をコロニー形成のレ
ベルまで長時間培養する目的には適しているものの、本
発明が目的とする生菌の迅速測定に対しては、例えば抽
出された発光成分が隣接する区画へオーバーフローや拡
散を生じて稀釈するために検出限界以下に低下し、計数
効率を減じる問題がある。
ベルまで長時間培養する目的には適しているものの、本
発明が目的とする生菌の迅速測定に対しては、例えば抽
出された発光成分が隣接する区画へオーバーフローや拡
散を生じて稀釈するために検出限界以下に低下し、計数
効率を減じる問題がある。
【０００８】この問題を解決するために、本発明者等は
ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１４８３８号において、親水性の
濾過膜（親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポ
リビニリデンジフルオライド、親水性ポリカーボネー
ト、親水性ポリスルフォン、親水性ポリアミド等のプラ
スチック系材料やアセチルセルローズ、ニトロセルロー
ズ又はそれらの混合物等のセルローズ系材料等、孔径は
例えば約０．１〜１μｍ）を格子状の疎水性区画壁（ポ
リフルオルエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、
ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン等、
区画壁の濾過膜面からの高さは例えば約０．０１〜０．
０５ｍｍ、巾は例えば約０．１〜２ｍｍ）で区画して区
画壁により完全または実質的に隔離された多数の出来る
だけ小面積（例えば２ｍｍ2 以下）の親水性区画を形成
してなる、濾過膜要素を作製し、検体液を濾過した後該
検体液中に含まれている生菌を上記区画内に捕捉し、乾
燥を行った後、各区画の濾過膜を湿らせる程度の抽出試
薬、発光試薬を必要最小限度の量、すなわち、捕捉され
た生菌からの抽出成分および発光成分が他区画へ拡散流
出を防止するのみならず、区画内で希釈拡散を最小限に
する程度の量で、微粒子状のスプレーを行い、得られた
標本を高感度の生物発光画像解析システムを適用して処
理することにより、生菌数由来の輝点のみを撮像し、当
該課題を解決する方法を見出したことを特徴とする検体
中の生菌数測定方法を提供した。
ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１４８３８号において、親水性の
濾過膜（親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポ
リビニリデンジフルオライド、親水性ポリカーボネー
ト、親水性ポリスルフォン、親水性ポリアミド等のプラ
スチック系材料やアセチルセルローズ、ニトロセルロー
ズ又はそれらの混合物等のセルローズ系材料等、孔径は
例えば約０．１〜１μｍ）を格子状の疎水性区画壁（ポ
リフルオルエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、
ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン等、
区画壁の濾過膜面からの高さは例えば約０．０１〜０．
０５ｍｍ、巾は例えば約０．１〜２ｍｍ）で区画して区
画壁により完全または実質的に隔離された多数の出来る
だけ小面積（例えば２ｍｍ2 以下）の親水性区画を形成
してなる、濾過膜要素を作製し、検体液を濾過した後該
検体液中に含まれている生菌を上記区画内に捕捉し、乾
燥を行った後、各区画の濾過膜を湿らせる程度の抽出試
薬、発光試薬を必要最小限度の量、すなわち、捕捉され
た生菌からの抽出成分および発光成分が他区画へ拡散流
出を防止するのみならず、区画内で希釈拡散を最小限に
する程度の量で、微粒子状のスプレーを行い、得られた
標本を高感度の生物発光画像解析システムを適用して処
理することにより、生菌数由来の輝点のみを撮像し、当
該課題を解決する方法を見出したことを特徴とする検体
中の生菌数測定方法を提供した。
【０００９】この微粒子状のスプレーの方法によれば、
菌体から抽出されたＡＴＰ成分（発光成分）のオーバー
フローが防止される結果、輝点の発光レベルが高くな
り、検出効率が高められ、その結果、菌体の培養をまっ
たく必要としないで、あるいは短時間の培養しか必要と
しないで、迅速な生菌数の計数が可能となった。
菌体から抽出されたＡＴＰ成分（発光成分）のオーバー
フローが防止される結果、輝点の発光レベルが高くな
り、検出効率が高められ、その結果、菌体の培養をまっ
たく必要としないで、あるいは短時間の培養しか必要と
しないで、迅速な生菌数の計数が可能となった。
【００１０】更に、検体液中に存在する生菌数が少ない
場合により簡便に且つ正確に生菌数を検出乃至計数する
ためには、発光成分を更に局在化する必要がある。そこ
で本発明者等は先願発明（特願平４−１０５２９９号、
平成４年４月１日出願）において、上記ＷＯ９２／１４
８３８号に記載された濾過膜要素を用いて、生菌数が１
０2 個以下／濾過膜要素、好ましくは５０個以下／濾過
膜要素を含む検体液の濾過を行った後、濾過膜上に分散
捕捉された生菌に対して特にＡＴＰの良抽出剤として沸
点が１２０℃以下の揮発性抽出剤を微粒子状に噴霧した
後、抽出剤を速やかに揮散させ、次いでルシフェリン−
ルシフェラーゼ系の発光試薬を高濃度で且つ微粒子状に
噴霧する方法により発光反応速度を増加させ結果的に発
光量を増加させることができた。
場合により簡便に且つ正確に生菌数を検出乃至計数する
ためには、発光成分を更に局在化する必要がある。そこ
で本発明者等は先願発明（特願平４−１０５２９９号、
平成４年４月１日出願）において、上記ＷＯ９２／１４
８３８号に記載された濾過膜要素を用いて、生菌数が１
０2 個以下／濾過膜要素、好ましくは５０個以下／濾過
膜要素を含む検体液の濾過を行った後、濾過膜上に分散
捕捉された生菌に対して特にＡＴＰの良抽出剤として沸
点が１２０℃以下の揮発性抽出剤を微粒子状に噴霧した
後、抽出剤を速やかに揮散させ、次いでルシフェリン−
ルシフェラーゼ系の発光試薬を高濃度で且つ微粒子状に
噴霧する方法により発光反応速度を増加させ結果的に発
光量を増加させることができた。
【００１１】かかる方法を実施することにより、濾過膜
上に捕捉された生菌に対し、極めて少量の抽出剤および
発光試薬と生菌が所在する局所付近でＡＴＰ抽出および
発光反応が起るため、生菌の存在局所の極近傍で発光す
るので前述した生物発光画像解析システム装置を用いる
輝点の撮像、画像処理、解析がより効果的に行なわれる
ようになった。
上に捕捉された生菌に対し、極めて少量の抽出剤および
発光試薬と生菌が所在する局所付近でＡＴＰ抽出および
発光反応が起るため、生菌の存在局所の極近傍で発光す
るので前述した生物発光画像解析システム装置を用いる
輝点の撮像、画像処理、解析がより効果的に行なわれる
ようになった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
ように親水性区画と疎水性隔壁とを有する濾過膜要素を
用い、ＡＴＰ抽出液と発光液とを順に霧状に噴霧（スプ
レー）する方法、あるいは更に抽出液を揮発性のものに
した方法を、食品、製薬、化粧品あるいは電子工業にお
いて実際に使用されている純水、原料、中間品あるいは
製品から採取された検体液（実液）中に存在する少数個
の生菌を検出・計数する場合には、未だ若干の問題が残
されている。
ように親水性区画と疎水性隔壁とを有する濾過膜要素を
用い、ＡＴＰ抽出液と発光液とを順に霧状に噴霧（スプ
レー）する方法、あるいは更に抽出液を揮発性のものに
した方法を、食品、製薬、化粧品あるいは電子工業にお
いて実際に使用されている純水、原料、中間品あるいは
製品から採取された検体液（実液）中に存在する少数個
の生菌を検出・計数する場合には、未だ若干の問題が残
されている。
【００１３】例えば食品工業において、中間品あるいは
製品であるビールあるいは酒中に含まれる生菌の内、１
個当りＡＴＰ含量の大きい酵母の場合は問題は少ない
が、酵母に対してＡＴＰ含量が１／１０〜１／１００程
度である細菌類を検出乃至計数する場合には問題が少な
くない。その理由は細菌が濾過捕捉されている分離膜自
身からのノイズや、実液中に含まれるノイズ発光成分の
ため、生菌（細菌）からのみ由来する輝点をバックグラ
ウンド（ノイズ発光）と明確に識別できない場合があ
り、その場合は実液を濾過した後の抽出剤の選択と、噴
霧条件（装置、噴霧微粒子の径、時間、温度）などの
他、抽出剤の揮散条件、発光試薬の調整、濃度及び噴
霧、乾燥などの条件、更に画像処理を行う場合の操作時
のノイズ発生の低減とノイズ消去、閾値処理などを行っ
たり、更に効果的には、細菌の付着保持されている濾過
膜を好ましくは細菌の種類に適した寒天培地あるいは別
の培地を滲み込ませたバット上に置き、２５−３７℃で
４−１５時間培養を行って同じ区画内で生菌を増殖させ
た後濾過膜で捕捉された細菌の捕捉極近傍内でＡＴＰ抽
出発光を行い、発光画像解析システムを用いて細菌数の
検出・計数を行う必要がある。本発明者等は、かかる実
液中に存在する生菌、特に細菌類をより確実に且つ簡便
に検出乃至計数する方法を見出すに至った。
製品であるビールあるいは酒中に含まれる生菌の内、１
個当りＡＴＰ含量の大きい酵母の場合は問題は少ない
が、酵母に対してＡＴＰ含量が１／１０〜１／１００程
度である細菌類を検出乃至計数する場合には問題が少な
くない。その理由は細菌が濾過捕捉されている分離膜自
身からのノイズや、実液中に含まれるノイズ発光成分の
ため、生菌（細菌）からのみ由来する輝点をバックグラ
ウンド（ノイズ発光）と明確に識別できない場合があ
り、その場合は実液を濾過した後の抽出剤の選択と、噴
霧条件（装置、噴霧微粒子の径、時間、温度）などの
他、抽出剤の揮散条件、発光試薬の調整、濃度及び噴
霧、乾燥などの条件、更に画像処理を行う場合の操作時
のノイズ発生の低減とノイズ消去、閾値処理などを行っ
たり、更に効果的には、細菌の付着保持されている濾過
膜を好ましくは細菌の種類に適した寒天培地あるいは別
の培地を滲み込ませたバット上に置き、２５−３７℃で
４−１５時間培養を行って同じ区画内で生菌を増殖させ
た後濾過膜で捕捉された細菌の捕捉極近傍内でＡＴＰ抽
出発光を行い、発光画像解析システムを用いて細菌数の
検出・計数を行う必要がある。本発明者等は、かかる実
液中に存在する生菌、特に細菌類をより確実に且つ簡便
に検出乃至計数する方法を見出すに至った。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明等は、上記の出願
に開示している親水性区画を有する濾過膜要素の代り
に、疎水性濾過膜を特定条件下で使用する方法が、予想
に反して極めて優れていることを見い出した。すなわ
ち、本発明は、疎水性濾過膜または撥水性の強い親水性
濾過膜を用いて生菌を含む液体を濾過して菌体を濾過膜
に捕捉し、液状抽出試薬、次いで液状発光試薬を、細い
霧状に噴霧して菌体に接触させることにより、検出感度
を著しく高め、細菌を濾過捕捉後培養することなしに明
瞭な輝点として直ちに検出する方法あるいは従来法に比
べて短時間の培養で検出する方法を考案したものであ
る。本発明はまた、使用する発光試薬の濃度を常用の標
準濃度の２〜１０倍の濃度で使用することにより発光速
度を上げ、それにより発光の輝度を上げて更に効果を上
げることができる。
に開示している親水性区画を有する濾過膜要素の代り
に、疎水性濾過膜を特定条件下で使用する方法が、予想
に反して極めて優れていることを見い出した。すなわ
ち、本発明は、疎水性濾過膜または撥水性の強い親水性
濾過膜を用いて生菌を含む液体を濾過して菌体を濾過膜
に捕捉し、液状抽出試薬、次いで液状発光試薬を、細い
霧状に噴霧して菌体に接触させることにより、検出感度
を著しく高め、細菌を濾過捕捉後培養することなしに明
瞭な輝点として直ちに検出する方法あるいは従来法に比
べて短時間の培養で検出する方法を考案したものであ
る。本発明はまた、使用する発光試薬の濃度を常用の標
準濃度の２〜１０倍の濃度で使用することにより発光速
度を上げ、それにより発光の輝度を上げて更に効果を上
げることができる。
【００１５】本発明の原理は、疎水性濾過膜に液状抽出
試薬及び液状発光試薬を霧状にスプレーした時、表面張
力によりそれらの試薬が超微粒状のまま生菌の付着点に
付着し、更に抽出された発光成分が拡散しないで超微粒
子状で保持されて発光する、という点にある。検体中の
生菌を疎水性濾過膜に付着させるには、疎水性濾過膜を
予めアルコールのような親水性の溶媒で湿らせてから水
で洗浄し、検体を疎水性濾過膜に対して例えば吸引濾過
などにより付着させ、乾燥させる。親水性の溶媒は乾燥
により蒸発するため濾過膜は疎水性に戻る。或いは、ポ
リビニルアルコールとかポリビニルピロリドンのような
親水性のポリマーの溶液で疎水性濾過膜を処理し、検体
を濾過すると、生菌の濾過捕捉が可能となるが、濾過時
に処理剤は流されて濾過膜は疎水性に戻る。次いで抽出
試薬により発光成分特にＡＴＰを抽出するとき、抽出試
薬は濾過膜が疎水性であるために表面張力により微粒径
を保持し、移動、拡散、稀釈を生じることなく生菌から
発光成分を抽出する。抽出試薬は例えばメタノールある
いはエタノールのような揮発性のものでも良いし、そう
でなくてもよい。更に、発光試薬は濾過膜が疎水性であ
るために表面張力により微粒径を保持し、移動、拡散、
稀釈を生じることなく生菌から抽出された発光成分を発
光させる。発光試薬の濃度を高めると発光速度が高ま
り、そのため輝度がさらに増大し、ノイズ発光に対して
検出効率が高まる。更に、高精密の発光画像解析システ
ムを用いて細菌数の検出・計数を行うことにより、微量
な発光成分を検出計数することができる。
試薬及び液状発光試薬を霧状にスプレーした時、表面張
力によりそれらの試薬が超微粒状のまま生菌の付着点に
付着し、更に抽出された発光成分が拡散しないで超微粒
子状で保持されて発光する、という点にある。検体中の
生菌を疎水性濾過膜に付着させるには、疎水性濾過膜を
予めアルコールのような親水性の溶媒で湿らせてから水
で洗浄し、検体を疎水性濾過膜に対して例えば吸引濾過
などにより付着させ、乾燥させる。親水性の溶媒は乾燥
により蒸発するため濾過膜は疎水性に戻る。或いは、ポ
リビニルアルコールとかポリビニルピロリドンのような
親水性のポリマーの溶液で疎水性濾過膜を処理し、検体
を濾過すると、生菌の濾過捕捉が可能となるが、濾過時
に処理剤は流されて濾過膜は疎水性に戻る。次いで抽出
試薬により発光成分特にＡＴＰを抽出するとき、抽出試
薬は濾過膜が疎水性であるために表面張力により微粒径
を保持し、移動、拡散、稀釈を生じることなく生菌から
発光成分を抽出する。抽出試薬は例えばメタノールある
いはエタノールのような揮発性のものでも良いし、そう
でなくてもよい。更に、発光試薬は濾過膜が疎水性であ
るために表面張力により微粒径を保持し、移動、拡散、
稀釈を生じることなく生菌から抽出された発光成分を発
光させる。発光試薬の濃度を高めると発光速度が高ま
り、そのため輝度がさらに増大し、ノイズ発光に対して
検出効率が高まる。更に、高精密の発光画像解析システ
ムを用いて細菌数の検出・計数を行うことにより、微量
な発光成分を検出計数することができる。
【００１６】本発明を採用することによって発光ノイズ
の高い実液中の細菌の検出に当っても従来培養のために
要した手間や時間が省ける上に、結果が即座に知ること
ができるため細菌の汚染を早期に感知して対処できるな
ど、その経済的な効果は極めて大きいものがある。
の高い実液中の細菌の検出に当っても従来培養のために
要した手間や時間が省ける上に、結果が即座に知ること
ができるため細菌の汚染を早期に感知して対処できるな
ど、その経済的な効果は極めて大きいものがある。
【００１７】以下に本発明をより詳細に説明する。本発
明では、親水性区画を格子状の疎水性格壁で取り囲んで
形成した特殊な濾過膜を必要とせず、単に普通の良く知
られた疎水性濾過膜、例えばＰＶＤＦ（ポリビニリデン
フルオライド）、ＰＴＦＥ（ポリトラフルオロエチレ
ン）、ＰＥ（ポリエチレン）等や、疎水性の比較的大き
い親水性濾過膜、例えばＰＣ（ポリカーボネート）、Ｐ
Ｐ（ポリプロピレン）、ＰＡ（ポリアミド）、ＰＳ（ポ
リスルフォン）等を使用することができる。これらはバ
ックグラウンド発光の少ないものが好ましい。この明細
書では疎水性の比較的大きい親水性濾過膜も含めて疎水
性濾過膜と称する。要するに、霧状に噴霧した試薬を粒
状を保って保持し、実質的に吸収しないような濾過膜を
指す。
明では、親水性区画を格子状の疎水性格壁で取り囲んで
形成した特殊な濾過膜を必要とせず、単に普通の良く知
られた疎水性濾過膜、例えばＰＶＤＦ（ポリビニリデン
フルオライド）、ＰＴＦＥ（ポリトラフルオロエチレ
ン）、ＰＥ（ポリエチレン）等や、疎水性の比較的大き
い親水性濾過膜、例えばＰＣ（ポリカーボネート）、Ｐ
Ｐ（ポリプロピレン）、ＰＡ（ポリアミド）、ＰＳ（ポ
リスルフォン）等を使用することができる。これらはバ
ックグラウンド発光の少ないものが好ましい。この明細
書では疎水性の比較的大きい親水性濾過膜も含めて疎水
性濾過膜と称する。要するに、霧状に噴霧した試薬を粒
状を保って保持し、実質的に吸収しないような濾過膜を
指す。
【００１８】次に、疎水性濾過膜に捕捉される検体液中
の生菌数は１０2 個／膜以下、更には５０個／膜以下、
更に少なくは２０個以下でも検出が可能である。検体中
の生菌を疎水性濾過膜に捕捉するには、濾過膜を一時的
に親水化した後、吸引濾過し、乾燥して疎水性に戻すな
どの任意の方法が使用できる。ただし付着した生菌自体
は親水性にとどまる。本発明で効果的に検出できる生菌
は微生物一般、特に細菌類、カビ類である。カビ類は比
較的検出し易く、また細菌類でもほとんどはそのまま本
発明の方法により検出できるが、場合により培養なしで
は検出できないことがある。しかし、このような場合で
も上記のＷＯ／１４８９８号に記載の方法に比し、培養
時間は少なくて済む。生菌から抽出できる発光成分はア
デノシン三燐酸（ＡＴＰ）である。
の生菌数は１０2 個／膜以下、更には５０個／膜以下、
更に少なくは２０個以下でも検出が可能である。検体中
の生菌を疎水性濾過膜に捕捉するには、濾過膜を一時的
に親水化した後、吸引濾過し、乾燥して疎水性に戻すな
どの任意の方法が使用できる。ただし付着した生菌自体
は親水性にとどまる。本発明で効果的に検出できる生菌
は微生物一般、特に細菌類、カビ類である。カビ類は比
較的検出し易く、また細菌類でもほとんどはそのまま本
発明の方法により検出できるが、場合により培養なしで
は検出できないことがある。しかし、このような場合で
も上記のＷＯ／１４８９８号に記載の方法に比し、培養
時間は少なくて済む。生菌から抽出できる発光成分はア
デノシン三燐酸（ＡＴＰ）である。
【００１９】次に、発光成分であるＡＴＰの液状抽出試
薬としては、アルコール類、エーテル類、エステル類、
またはメタン、エタン、メチレンもしくはエチレン等の
ハロゲン誘導体、アセトニトリル、トリエチルアミン等
が使用できる。沸点１２０℃以下の抽出剤で噴霧後、揮
散しやすいものは特に好適である。もし残留すれば発光
酵素の阻害が生じる。
薬としては、アルコール類、エーテル類、エステル類、
またはメタン、エタン、メチレンもしくはエチレン等の
ハロゲン誘導体、アセトニトリル、トリエチルアミン等
が使用できる。沸点１２０℃以下の抽出剤で噴霧後、揮
散しやすいものは特に好適である。もし残留すれば発光
酵素の阻害が生じる。
【００２０】一方、発光試薬はルシフェリン−ルシフェ
ラーゼであり、試薬濃度を標準濃度の２〜１０倍、特に
３〜６倍に濃度を高めた発光試薬を用いることが好まし
い。このようにすると発光速度が増大して輝点の発光レ
ベルが上り、また検出速度も上がる。ここに標準濃度と
は従来常用の発光試薬（例えばキッコウマン（株）より
市販のルシフェリン−ルシフェラーゼであるルシフェー
ルＬＵ）の濃度に対する濃度倍率を表すものと定義す
る。
ラーゼであり、試薬濃度を標準濃度の２〜１０倍、特に
３〜６倍に濃度を高めた発光試薬を用いることが好まし
い。このようにすると発光速度が増大して輝点の発光レ
ベルが上り、また検出速度も上がる。ここに標準濃度と
は従来常用の発光試薬（例えばキッコウマン（株）より
市販のルシフェリン−ルシフェラーゼであるルシフェー
ルＬＵ）の濃度に対する濃度倍率を表すものと定義す
る。
【００２１】これらの液状試薬は直径２０μｍ以下、好
ましくは５〜１０μｍの微粒子のミスト状に噴霧する。
噴霧手段としては、超音波微粒子噴霧器、特に自動式超
音波微粒子噴霧器を使用するとよい。本発明の手法によ
ると、１ｆｇ（１フェントグラム）程度のＡＴＰが検出
できる。
ましくは５〜１０μｍの微粒子のミスト状に噴霧する。
噴霧手段としては、超音波微粒子噴霧器、特に自動式超
音波微粒子噴霧器を使用するとよい。本発明の手法によ
ると、１ｆｇ（１フェントグラム）程度のＡＴＰが検出
できる。
【００２２】実際の工程では、まず、カップ状濾過容器
等例えば日本ミリポアリミテッド製の「ミリフレックス
フィルターユニット、ステリフィル（商品名）」等に前
記の濾過膜を装着して検体液を濾過し、生菌を濾過膜上
に捕捉する。次に濾過器から濾過膜を取り外し、乾燥
後、標本ホルダーにのせ、上からルーマック社製ＡＴＰ
抽出試薬（ＮＢＲ−商品名）を、超音波式噴霧器（松下
電工製）を用いて１０秒間濾過膜上に静かに噴霧（スプ
レー）する。更に、２０秒後にルシフェリン−ルシフェ
ラーゼ発光試薬（ルーマック社製Lumit −ＰＭ、商品
名）を上記噴霧器により１０秒間静かに噴霧添加し、発
光せしめる。続いて、発光した濾過膜（以下標本と略
す）は標本ホルダーにセットし全反射板を装着した後、
生物発光画像解析システム装置（例えば浜松ホトニクス
（株）製ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ（商品名）のテーパー
ファイバー入力式のものを用いて、例えば２分間の発光
を累積させた後画像処理を行いノイズと見なされる発光
を消去する画像処理を行い残る輝点を計測して、生菌数
を測定している。
等例えば日本ミリポアリミテッド製の「ミリフレックス
フィルターユニット、ステリフィル（商品名）」等に前
記の濾過膜を装着して検体液を濾過し、生菌を濾過膜上
に捕捉する。次に濾過器から濾過膜を取り外し、乾燥
後、標本ホルダーにのせ、上からルーマック社製ＡＴＰ
抽出試薬（ＮＢＲ−商品名）を、超音波式噴霧器（松下
電工製）を用いて１０秒間濾過膜上に静かに噴霧（スプ
レー）する。更に、２０秒後にルシフェリン−ルシフェ
ラーゼ発光試薬（ルーマック社製Lumit −ＰＭ、商品
名）を上記噴霧器により１０秒間静かに噴霧添加し、発
光せしめる。続いて、発光した濾過膜（以下標本と略
す）は標本ホルダーにセットし全反射板を装着した後、
生物発光画像解析システム装置（例えば浜松ホトニクス
（株）製ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ（商品名）のテーパー
ファイバー入力式のものを用いて、例えば２分間の発光
を累積させた後画像処理を行いノイズと見なされる発光
を消去する画像処理を行い残る輝点を計測して、生菌数
を測定している。
【００２３】ここで用いる生物発光画像解析システム
は、従来の測定装置に比べ、微弱な発光であっても高感
度に検知し且つ光を著しく強めて処理することができ、
しかもデータの処理及び解析も早く簡便であり、さらに
本発明の特殊な濾過膜及び試薬の噴霧器を用いるスプレ
ー効果とが相乗して、１個の生菌細胞をも検出できる新
規で画期的なもので、極めて優れた生菌測定法を実現す
るのに寄与している。
は、従来の測定装置に比べ、微弱な発光であっても高感
度に検知し且つ光を著しく強めて処理することができ、
しかもデータの処理及び解析も早く簡便であり、さらに
本発明の特殊な濾過膜及び試薬の噴霧器を用いるスプレ
ー効果とが相乗して、１個の生菌細胞をも検出できる新
規で画期的なもので、極めて優れた生菌測定法を実現す
るのに寄与している。
【００２４】そのシステムの概要は図１〜２に示す通り
であり、図１は全体図であり、図Ｂはその部分拡大図で
ある。このシステムは上記の抽出試薬及び発光試薬で処
理した後の濾過膜（標本）５を支持するための標本ホル
ダー９、全反射板６、遮光ハウジング８、濾過膜に出来
るだけ接近させて配置され発光を２次元的に検出するテ
ーパーファイバー７、光増幅部及び撮像管からなる超高
感度テレビカメラ１０、カメラコントローラー１１、イ
メージプロセッサ１２、データー解析装置１３、テレビ
モニター１４から構成されており、特に浜松ホトニクス
（株）社製ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ（商品名）のテーパ
ーファイバー入力式あるいは同様の測定機能を有するも
のが好ましい。超高感度テレビカメラとしては冷却型固
体撮像素子（ＣＣＤ）を用い、約−３０〜−１２０℃に
冷却することにより、カメラ自身からのノイズを抑制し
て微弱発光を蓄積できるテレビカメラを用いることがで
きる。例えば浜松ホトニクス社製の冷却ＣＣＤデジタル
イメージイングシステムがある。別法として、撮像部の
テーパーファイバー７及び超高感度テレビカメラ１０を
反転させ、その上に標本をセットした標本ホルダーを配
置して操作することもできる。標本５とテーパーファイ
バー７はなるべく接近させてセットするのが望ましい。
それによって測定感度が著しく向上され、また従来必要
であった走査が不要となる。なお、必要に応じて測定を
自動化するため抽出試薬及び発光試薬の噴霧器や標本の
搬送装置などを組み合わせてセットすることも出来る。
であり、図１は全体図であり、図Ｂはその部分拡大図で
ある。このシステムは上記の抽出試薬及び発光試薬で処
理した後の濾過膜（標本）５を支持するための標本ホル
ダー９、全反射板６、遮光ハウジング８、濾過膜に出来
るだけ接近させて配置され発光を２次元的に検出するテ
ーパーファイバー７、光増幅部及び撮像管からなる超高
感度テレビカメラ１０、カメラコントローラー１１、イ
メージプロセッサ１２、データー解析装置１３、テレビ
モニター１４から構成されており、特に浜松ホトニクス
（株）社製ＡＲＧＵＳ−５０／ＣＬ（商品名）のテーパ
ーファイバー入力式あるいは同様の測定機能を有するも
のが好ましい。超高感度テレビカメラとしては冷却型固
体撮像素子（ＣＣＤ）を用い、約−３０〜−１２０℃に
冷却することにより、カメラ自身からのノイズを抑制し
て微弱発光を蓄積できるテレビカメラを用いることがで
きる。例えば浜松ホトニクス社製の冷却ＣＣＤデジタル
イメージイングシステムがある。別法として、撮像部の
テーパーファイバー７及び超高感度テレビカメラ１０を
反転させ、その上に標本をセットした標本ホルダーを配
置して操作することもできる。標本５とテーパーファイ
バー７はなるべく接近させてセットするのが望ましい。
それによって測定感度が著しく向上され、また従来必要
であった走査が不要となる。なお、必要に応じて測定を
自動化するため抽出試薬及び発光試薬の噴霧器や標本の
搬送装置などを組み合わせてセットすることも出来る。
【００２５】測定は、発光処理した前記標本（生菌を保
持した濾過膜）を保持した標本ホルダー９をテーパーフ
ァイバー面に密着させて置き、超高感度テレビカメラ、
カメラコントローラー及びイメージプロセッサーを用い
て２次元的に光子を３０〜１８０秒間、例えば１２０秒
間蓄積し、菌体からの発光を撮像し、データー解析装置
により画像処理を行い発光ノイズを消去して生菌由来の
強い発光のみを残してテレビモニターに表示する。この
処理によって菌体由来以外の発光がノイズとして消去さ
れるので測定された輝点数は生菌数と略一致する。
持した濾過膜）を保持した標本ホルダー９をテーパーフ
ァイバー面に密着させて置き、超高感度テレビカメラ、
カメラコントローラー及びイメージプロセッサーを用い
て２次元的に光子を３０〜１８０秒間、例えば１２０秒
間蓄積し、菌体からの発光を撮像し、データー解析装置
により画像処理を行い発光ノイズを消去して生菌由来の
強い発光のみを残してテレビモニターに表示する。この
処理によって菌体由来以外の発光がノイズとして消去さ
れるので測定された輝点数は生菌数と略一致する。
【００２６】本発明の最も好ましい態様は、生菌体中の
抽出される成分がＡＴＰの場合である。この場合の抽出
試薬はＡＴＰ抽出試薬（例えばルーマック社製のＮＲＢ
（商品名））であり、これを噴霧器（例えば松下電工
製、超音波式吸入器（商品名））を用いて微粒子状に噴
霧し、濾過膜内に捕捉されている生菌のＡＴＰを抽出
し、次いで同様にして発光試薬（例えばルーマック社製
Lumit-ＰＭ）を上記噴霧器を用いてスプレーし、発光せ
しめる。次に、上記したように、その標本を前記の生物
発光画像解析システムを用い、３０〜１８０秒間の発光
を累積させた後、バックグラウンドの発光より強く発光
している輝点のみをテレビモニターに残して表示する。
すなわち、同一の検体液を無菌処理したものを同量濾過
した濾過膜を上記同様の処理を行って発光させた場合に
最高輝度（以後閾値とする）をテレビモニター画面から
完全に消去する操作を行うことによってテレビモニター
に表示される輝点数が直接生菌数を示すことになる。
抽出される成分がＡＴＰの場合である。この場合の抽出
試薬はＡＴＰ抽出試薬（例えばルーマック社製のＮＲＢ
（商品名））であり、これを噴霧器（例えば松下電工
製、超音波式吸入器（商品名））を用いて微粒子状に噴
霧し、濾過膜内に捕捉されている生菌のＡＴＰを抽出
し、次いで同様にして発光試薬（例えばルーマック社製
Lumit-ＰＭ）を上記噴霧器を用いてスプレーし、発光せ
しめる。次に、上記したように、その標本を前記の生物
発光画像解析システムを用い、３０〜１８０秒間の発光
を累積させた後、バックグラウンドの発光より強く発光
している輝点のみをテレビモニターに残して表示する。
すなわち、同一の検体液を無菌処理したものを同量濾過
した濾過膜を上記同様の処理を行って発光させた場合に
最高輝度（以後閾値とする）をテレビモニター画面から
完全に消去する操作を行うことによってテレビモニター
に表示される輝点数が直接生菌数を示すことになる。
【００２７】
【作用】本発明では、疎水性濾過膜を用いて生菌を捕捉
する。引継いで抽出液（特にＡＴＰ抽出液）及び発光試
薬液（特にルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬）を適当
量微粒子の状態で噴霧添加するので、噴霧添加された微
粒子は自身の表面張力により粒状に留まり、拡散、移
動、或いは希釈されたりすることがない。それによって
発光した菌体成分も高濃度のままで保持されるので、極
めて微量の菌体成分をも容易に測定することが可能とな
った。
する。引継いで抽出液（特にＡＴＰ抽出液）及び発光試
薬液（特にルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬）を適当
量微粒子の状態で噴霧添加するので、噴霧添加された微
粒子は自身の表面張力により粒状に留まり、拡散、移
動、或いは希釈されたりすることがない。それによって
発光した菌体成分も高濃度のままで保持されるので、極
めて微量の菌体成分をも容易に測定することが可能とな
った。
【００２８】さらに、このようにして発光せしめた標本
（濾過膜）を生物発光画像解析システムにかけることに
より、１個の検体からの微弱発光を２次元検出出来るよ
うになったため、生菌数の極めて少ない場合においても
自動的に、高感度でしかも迅速・簡便に生菌数を測定す
ることができるようになったのである。すなわち、テー
パーファイバー、光増幅部、撮像管からなるテレビカメ
ラヘッドの採用により生菌由来の発光を非常に強い輝点
として捉えること（認識）ができるようになったため、
生菌以外からの発光ノイズを閾値として定めることによ
り消去することが容易に行なわれ、生菌数の極めて少な
い場合（例えば数個／１００ｍｌ検体液以下の場合）
も、自動的にしかも迅速・簡便に測定可能となったので
ある。又、食品や清涼飲料水等の大腸菌検査のように検
体液中に存在する１個の生菌の有無を検出することが重
要な場合がある。本発明はその様な場合でも適用が可能
であるが、細菌の場合には好ましくは、検体液を濾過し
生菌を捕捉した濾過膜を該生菌の増殖に最も適した栄養
を含ませたパッドあるいは栄養寒天平板上に置いて短時
間（例えば３時間以内）培養を行ない、同一区画内で生
菌を増殖させた後測定に供することにより、極めて強い
輝点が得られるのでより正確な判定法が提供されること
になる。なお、この程度の培養条件では勿論１個の細胞
からコロニーの形成に達することはない。
（濾過膜）を生物発光画像解析システムにかけることに
より、１個の検体からの微弱発光を２次元検出出来るよ
うになったため、生菌数の極めて少ない場合においても
自動的に、高感度でしかも迅速・簡便に生菌数を測定す
ることができるようになったのである。すなわち、テー
パーファイバー、光増幅部、撮像管からなるテレビカメ
ラヘッドの採用により生菌由来の発光を非常に強い輝点
として捉えること（認識）ができるようになったため、
生菌以外からの発光ノイズを閾値として定めることによ
り消去することが容易に行なわれ、生菌数の極めて少な
い場合（例えば数個／１００ｍｌ検体液以下の場合）
も、自動的にしかも迅速・簡便に測定可能となったので
ある。又、食品や清涼飲料水等の大腸菌検査のように検
体液中に存在する１個の生菌の有無を検出することが重
要な場合がある。本発明はその様な場合でも適用が可能
であるが、細菌の場合には好ましくは、検体液を濾過し
生菌を捕捉した濾過膜を該生菌の増殖に最も適した栄養
を含ませたパッドあるいは栄養寒天平板上に置いて短時
間（例えば３時間以内）培養を行ない、同一区画内で生
菌を増殖させた後測定に供することにより、極めて強い
輝点が得られるのでより正確な判定法が提供されること
になる。なお、この程度の培養条件では勿論１個の細胞
からコロニーの形成に達することはない。
【００２９】実施例１ ＡＴＰ水溶液０．５μｌを１０-12 、５×１０-13 、１
０-13 、５×１０-14ｇＡＴＰになるように疎水性濾過
膜（ＨＶＨＰ、日本ミリポア・リミテッド製）にスポッ
トした後、５分間風乾し、それに発光試薬（ルシフェー
ルＬＵ、キッコーマン社製）を加圧式噴霧器（新鋭工業
製）を用いて噴霧して発光させ、直ちに生物発光画像解
析システム（ＲＭＤＳ、日本ミリポア・リミテッド製）
にセットして輝点を測定し表１の結果を得た。又比較と
して格子付き親水性濾過膜（ＨＶＷＰ、日本ミリポア・
リミテッド製）を用いて同様な処理により発光させた結
果も表１に示す。
０-13 、５×１０-14ｇＡＴＰになるように疎水性濾過
膜（ＨＶＨＰ、日本ミリポア・リミテッド製）にスポッ
トした後、５分間風乾し、それに発光試薬（ルシフェー
ルＬＵ、キッコーマン社製）を加圧式噴霧器（新鋭工業
製）を用いて噴霧して発光させ、直ちに生物発光画像解
析システム（ＲＭＤＳ、日本ミリポア・リミテッド製）
にセットして輝点を測定し表１の結果を得た。又比較と
して格子付き親水性濾過膜（ＨＶＷＰ、日本ミリポア・
リミテッド製）を用いて同様な処理により発光させた結
果も表１に示す。
【００３０】
【表１】 ────────────────────────────────── 疎水性膜（ＨＶＨＰ） 格子付親水性膜 ────────────────────────────────── １０-12 ｇＡＴＰ ２８８６０* ２０９４０* ５×１０-13 〃 ２１９３０ １７２７０ １０-13 〃 ６０２０ ３５３０ ５×１０-14 〃 ２４１０ ６２０ ────────────────────────────────── ＊モニター上の２５×２５画素の面積からの発光量
【００３１】実施例２ ＡＴＰ水溶液０．５μｌを５×１０-13 、５×１０
-14 、２×１０-14 ｇＡＴＰになるように疎水性濾過膜
（ＨＶＨＰ）にスポットした後、５分間風乾し、それに
発光試薬（ルシフェールＬＵ）を通常の１／５、１ｍｌ
の試薬溶解液で溶解した５倍濃縮試薬を調整し実施例１
と同様の方法で処理して発光させて測定した。又比較と
して通常の発光試薬を用いて同様な処理により発光させ
た結果をも表２に示す。
-14 、２×１０-14 ｇＡＴＰになるように疎水性濾過膜
（ＨＶＨＰ）にスポットした後、５分間風乾し、それに
発光試薬（ルシフェールＬＵ）を通常の１／５、１ｍｌ
の試薬溶解液で溶解した５倍濃縮試薬を調整し実施例１
と同様の方法で処理して発光させて測定した。又比較と
して通常の発光試薬を用いて同様な処理により発光させ
た結果をも表２に示す。
【００３２】
【表２】 ────────────────────────────── 発 光 試 薬 ────────────────────────────── ５倍 常用 ────────────────────────────── ５×１０-13 ｇＡＴＰ ２２０５０* １７３７５* ５×１０-14 〃 ２３２０ ７１０ ２×１０-14 〃 １９７０ ５０ ────────────────────────────── ＊モニター上の２５×２５画素の面積からの発光量
【００３３】実施例３ ＳＣＤ培地（日本製薬製）５ｍｌを含む試験管に１白金
耳の大腸菌（Escherichia coli ＩＦＯ １３８９８）
を接種し、３７℃、１夜培養した後、hepes 緩衝液（ｐ
Ｈ７．７５）で約１００ＣＦｕ／ｍｌになるように希釈
し、その０．２ｍｌを検体液とした。疎水性のＰＶＤＦ
膜（ＨＶＨＰ、４７ｍｍφ、日本ミリポア・リミテッド
製）を濾過器に装着した後、少量のメタノールで浸漬し
て親水化し、さらに水で十分洗浄してから、この上に１
０ｍｌのhepes 緩衝液（シグマ社製）を加え、さらに上
記検体液０．２ｍｌを加えてから吸引濾過した。同緩衝
液１５ｍｌで３回洗浄した後濾過器から濾過膜を取り外
し、風乾して標本ホールダーに載せる。加圧式噴霧器
（新鋭工業製）を用いてエタノールを霧状に３０秒間ス
プレーする。５分間放置してアルコールを揮散させてか
ら、その上に実施例２と同様の５倍濃度の発光試薬を同
様に霧状に５秒間スプレーして発光させる。直ちに同様
の生物発光画像解析システムを用いて光子の蓄積を２分
間行った後、ノイズを消去してテレビモニター上に撮像
される輝点を測定して、表３の結果を得た。又、比較と
して同じ検体液０．２ｍｌをＳＣＤ寒天平板（日本製薬
製）に塗抹して３７℃、４８時間培養して生成するコロ
ニーを測定した結果も示す。
耳の大腸菌（Escherichia coli ＩＦＯ １３８９８）
を接種し、３７℃、１夜培養した後、hepes 緩衝液（ｐ
Ｈ７．７５）で約１００ＣＦｕ／ｍｌになるように希釈
し、その０．２ｍｌを検体液とした。疎水性のＰＶＤＦ
膜（ＨＶＨＰ、４７ｍｍφ、日本ミリポア・リミテッド
製）を濾過器に装着した後、少量のメタノールで浸漬し
て親水化し、さらに水で十分洗浄してから、この上に１
０ｍｌのhepes 緩衝液（シグマ社製）を加え、さらに上
記検体液０．２ｍｌを加えてから吸引濾過した。同緩衝
液１５ｍｌで３回洗浄した後濾過器から濾過膜を取り外
し、風乾して標本ホールダーに載せる。加圧式噴霧器
（新鋭工業製）を用いてエタノールを霧状に３０秒間ス
プレーする。５分間放置してアルコールを揮散させてか
ら、その上に実施例２と同様の５倍濃度の発光試薬を同
様に霧状に５秒間スプレーして発光させる。直ちに同様
の生物発光画像解析システムを用いて光子の蓄積を２分
間行った後、ノイズを消去してテレビモニター上に撮像
される輝点を測定して、表３の結果を得た。又、比較と
して同じ検体液０．２ｍｌをＳＣＤ寒天平板（日本製薬
製）に塗抹して３７℃、４８時間培養して生成するコロ
ニーを測定した結果も示す。
【００３４】
【表３】 ──────────────────────── 本発明法 寒天平板法 実験番号 （輝点／膜） （CFu /0.2ml） ──────────────────────── １ ２２ １８ ２ １９ ２３ ３ １６ １９ ────────────────────────
【００３５】実施例４ 市販缶ビール（Ａ社製）３００ｍｌを無菌濾過したもの
に実施例３と同様に培養した大腸菌（Escherichia coli
ＩＦＯ １３８９８）をhepes 緩衝液（ｐＨ７．７
５）で約１００ＣＦｕ／ｍｌになるように希釈し、その
０．２ｍｌを少量のメタノールに浸漬後、水で十分洗浄
した疎水性ＰＶＤＦ膜（ＨＶＨＰ、４７ｍｍφ、日本ミ
リポア・リミテッド製）を装着した濾過器に加え吸引濾
過した。同様に洗浄濾過後、風乾、ＡＴＰ抽出、発光を
行ってから生物発光画像解析システムを用いて輝点を測
定し、表４の結果を得た。又、比較として同じ検体液
０．２ｍｌをＷＯ９２／１４８３８号のＰＶＤＦの格子
付き膜を用いて同様の方法で測定した結果および０．２
ｍｌをＳＣＤ寒天平板に塗抹して３７℃、４８時間培養
した結果をも表に示す。
に実施例３と同様に培養した大腸菌（Escherichia coli
ＩＦＯ １３８９８）をhepes 緩衝液（ｐＨ７．７
５）で約１００ＣＦｕ／ｍｌになるように希釈し、その
０．２ｍｌを少量のメタノールに浸漬後、水で十分洗浄
した疎水性ＰＶＤＦ膜（ＨＶＨＰ、４７ｍｍφ、日本ミ
リポア・リミテッド製）を装着した濾過器に加え吸引濾
過した。同様に洗浄濾過後、風乾、ＡＴＰ抽出、発光を
行ってから生物発光画像解析システムを用いて輝点を測
定し、表４の結果を得た。又、比較として同じ検体液
０．２ｍｌをＷＯ９２／１４８３８号のＰＶＤＦの格子
付き膜を用いて同様の方法で測定した結果および０．２
ｍｌをＳＣＤ寒天平板に塗抹して３７℃、４８時間培養
した結果をも表に示す。
【００３６】
【表４】 ──────────────────────────── 本発明法 従来膜 寒天平板法 実験番号 （輝点／膜） （輝点／膜） （CFu /0.2ml） ──────────────────────────── １ １７ ０ ２０ ２ １５ ０ １５ ３ １１ ０ １２ ────────────────────────────
【００３７】実施例５ 市販缶ビール（Ｂ社製）３００ｍｌを無菌濾過したもの
に実施例３と同様に１夜培養した乳酸菌（Lactobacillu
s brevis ＩＦＯ ３３４５）をhepes 緩衝液を用いて
約１００ＣＦｕ／ｍｌになるように希釈し、その０．２
ｍｌをポリカーボネート膜（商品名アイソポア０．４μ
ｍ、４７ｍｍφ、日本ミリポア・リミテッド製）を用い
て濾過した後、ＳＣＤ寒天平板上に置き、３０℃、８時
間培養する。濾過膜を風乾、ＡＴＰ抽出、発光を行って
から生物発光画像解析システムを用いて輝点を測定し表
５の結果を得た。又、比較として同じ検体液０．２ｍｌ
をＳＣＤ寒天平板に塗抹して３０℃、５日間培養した結
果およびＰＣＴ／９２／１４８３８（ＰＶＤＦ）の格子
付き膜を用いて同様な方法で測定したものを表に示す。
に実施例３と同様に１夜培養した乳酸菌（Lactobacillu
s brevis ＩＦＯ ３３４５）をhepes 緩衝液を用いて
約１００ＣＦｕ／ｍｌになるように希釈し、その０．２
ｍｌをポリカーボネート膜（商品名アイソポア０．４μ
ｍ、４７ｍｍφ、日本ミリポア・リミテッド製）を用い
て濾過した後、ＳＣＤ寒天平板上に置き、３０℃、８時
間培養する。濾過膜を風乾、ＡＴＰ抽出、発光を行って
から生物発光画像解析システムを用いて輝点を測定し表
５の結果を得た。又、比較として同じ検体液０．２ｍｌ
をＳＣＤ寒天平板に塗抹して３０℃、５日間培養した結
果およびＰＣＴ／９２／１４８３８（ＰＶＤＦ）の格子
付き膜を用いて同様な方法で測定したものを表に示す。
【００３８】
【表５】 注：全体の輝点の強さを合計して平均化（１／２２）し
たものである。 ＊は生菌由来の全輝点の強さを平均化した輝度を示す。
たものである。 ＊は生菌由来の全輝点の強さを平均化した輝度を示す。
【００３９】
【効果】本発明によれば次の効果が得られる。 （１）本発明の方法は親水性区画を疎水性隔壁で囲った
濾過膜を使用する場合よりも発光量が大きくなり、検出
し易い（実施例１）。 （２）本発明の方法では発光試薬の濃度を高くすること
により発光量が増大し、従来法での検出限界を超える輝
度が得られるので検出し易くなる（実施例２）。 （３）本発明の方法では培養の必要がないか短時間の培
養ですみ、測定が即時または迅速に行える（実施例３、
４、５）。 （４）本発明の方法は親水性区画を疎水性隔壁で囲った
濾過膜を使用する場合よりも輝度が高くなり、微少量の
生菌も本発明では検出できる（実施例４、５）。
濾過膜を使用する場合よりも発光量が大きくなり、検出
し易い（実施例１）。 （２）本発明の方法では発光試薬の濃度を高くすること
により発光量が増大し、従来法での検出限界を超える輝
度が得られるので検出し易くなる（実施例２）。 （３）本発明の方法では培養の必要がないか短時間の培
養ですみ、測定が即時または迅速に行える（実施例３、
４、５）。 （４）本発明の方法は親水性区画を疎水性隔壁で囲った
濾過膜を使用する場合よりも輝度が高くなり、微少量の
生菌も本発明では検出できる（実施例４、５）。
【図１】本発明を実施するのに使用する測定装置の概要
をしめす。
をしめす。
【図２】図１の部分拡大図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年４月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】すなわち、発光試薬濃度を標準濃度の２〜
１０倍、特に３〜６倍に濃度を高めた発光試薬を用いる
ことが好ましい。このようにすると発光速度が増大して
輝点の発光レベルが上り、また検出速度も上がる。ここ
に標準濃度とは従来常用の発光試薬（例えばキッコウマ
ン（株）より市販のルシフェリン−ルシフェラーゼであ
るルシフェールＬＵ）の濃度のことをいう。具体的に
は、、一例を挙げれば、キッコウマン（株）社製発光試
薬（商品名ルシフェールＬＵ）を通常はその凍結乾燥物
７０ｍｇに対し５ｍｌの水を加えて稀釈して使用してい
るが、これを上記の通り常用濃度の約３〜６倍の高濃度
にして使用すると、その発光試薬の噴霧後の発光時間が
短縮でき、かつ発光量をその濃度に比例してほぼ直線的
に上昇させることができる。
１０倍、特に３〜６倍に濃度を高めた発光試薬を用いる
ことが好ましい。このようにすると発光速度が増大して
輝点の発光レベルが上り、また検出速度も上がる。ここ
に標準濃度とは従来常用の発光試薬（例えばキッコウマ
ン（株）より市販のルシフェリン−ルシフェラーゼであ
るルシフェールＬＵ）の濃度のことをいう。具体的に
は、、一例を挙げれば、キッコウマン（株）社製発光試
薬（商品名ルシフェールＬＵ）を通常はその凍結乾燥物
７０ｍｇに対し５ｍｌの水を加えて稀釈して使用してい
るが、これを上記の通り常用濃度の約３〜６倍の高濃度
にして使用すると、その発光試薬の噴霧後の発光時間が
短縮でき、かつ発光量をその濃度に比例してほぼ直線的
に上昇させることができる。
Claims (8)
- 【請求項１】 疎水性の濾過膜で生菌を含む検体液を濾
過し、その検体中に含まれている生菌を濾過膜上に捕捉
し、その上から生菌中の発光成分を抽出するための液体
抽出試薬を霧状に噴霧し、次いで該発光成分を発光させ
る液体発光試薬を霧状に噴霧して発光させ、その発光量
を発光量測定装置を用いて測定することを特徴とする生
菌数を測定する方法。 - 【請求項２】 前記発光試薬の濃度が標準濃度の３〜６
倍である請求項１項記載の生菌数を測定する方法。 - 【請求項３】 前記発光試薬がルシフェリン−ルシフェ
ラーゼである、請求項１ないし２のいずれかに記載の生
菌数を測定する方法。 - 【請求項４】 前記発光成分がアデノシン三燐酸である
請求項１項ないし３項のいずれかに記載の生菌数を測定
する方法。 - 【請求項５】 前記抽出試薬が１２０℃以下の沸点を有
するアルコール類、エーテル類、エステル類、またはメ
タン、エタン、メチレンもしくはエチレン等のハロゲン
誘導体、アセトニトリル、トリエチルアミンより選択さ
れる一種である、請求項１ないし４項のいずれかに記載
の生菌数を測定する方法。 - 【請求項６】 前記疎水性の濾過膜が、疎水性であるポ
リビニリデンフルオライド、ポリテトラフルオロエチレ
ン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレ
ン、ポリアミド、ポリスルフォンより選択される請求項
１ないし５のいずれかに記載の生菌数を測定する方法。 - 【請求項７】 前記疎水性の濾過膜は、濾過時または濾
過後に容易に除去される親水化処理剤で処理されたもの
である、請求項１ないし６項のいずれかに記載の生菌数
を測定する方法。 - 【請求項８】 発光量測定装置は、検出部に、遮光ハウ
ジングと、該ハウジング内で前記濾過膜を保持する標本
ホルダと、該ハウジング内で該濾過膜に接近して配置さ
れ２次元的に配列した検出端を有するテーパーファイバ
ーと、該ファイバーからの光を増幅し撮像する超高感度
テレビカメラとを具備しているテーパファイバー入力式
生物発光画像解析システム装置である請求項１ないし７
項のいずれかに記載の生菌数を測定する方法。
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| DE69419948T DE69419948T2 (de) | 1993-02-10 | 1994-02-10 | Verfahren zur Bestimmung der Zahl lebender Mikroorganismen unter Benutzung eines hydrophoben Membranfilters |
| US08/443,654 US5766868A (en) | 1993-02-10 | 1995-05-18 | Method of determining a viable count using a hydrophobic membrane |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP04439793A JP3228812B2 (ja) | 1993-02-10 | 1993-02-10 | 生菌数を測定する方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06237793A true JPH06237793A (ja) | 1994-08-30 |
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ID=12690383
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP3228812B2 (ja) |
| DE (1) | DE69419948T2 (ja) |
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| JP2007225611A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-09-06 | Millipore Corp | 高速微生物学解析方法 |
| JP2007222166A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-09-06 | Millipore Corp | 高速微生物学的解析方法 |
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| US8642321B2 (en) | 2007-04-26 | 2014-02-04 | Emd Millipore Corporation | Microbiological analysis assembly and method |
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1994
- 1994-02-10 EP EP94102084A patent/EP0612850B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-10 DE DE69419948T patent/DE69419948T2/de not_active Expired - Lifetime
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1995
- 1995-05-18 US US08/443,654 patent/US5766868A/en not_active Expired - Lifetime
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