CN112630246B - 一种沉积物中长线状微生物捕获与成像的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种沉积物中长线状微生物捕获与成像的方法。本发明包括以下步骤：将新鲜沉积物注入含有玻璃圆片‑玻璃环‑玻璃纤维滤膜‑玻璃环四层结构的阻断培养装置上的玻璃环的中心孔中，然后将该装置放入水体中，连续曝气培养；取出该装置中的玻璃纤维滤膜并在滤膜中心剪取适宜大小，进行固定、漂洗、脱水、置换，冷冻干燥，然后用扫描电子显微镜成像观察。本发明采用滤膜阻断的方式实现了对长线状微生物的捕获以及后续的扫描电镜成像，这大大地扩展了沉积物中长线状微生物形态结构观察的技术方法和手段。

Description

一种沉积物中长线状微生物捕获与成像的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种沉积物中长线状微生物捕获与成像的方法。
背景技术
除了以单细胞状态存在的微生物外，环境中还存在数目众多的呈现长线状的微生物，这些微生物或通过形成多细胞的菌丝及菌丝体、或首尾相接形成长线状的多细胞结构。事实上，沉积物中常见的微生物群落如酸杆菌门、放线菌门等中，很多属表现出多细胞的长线状形态。这些长线状微生物在沉积物中的物质转运及重分配过程中扮演重要角色，也可以通过直接或间接的作用影响生境中其他的微生物群落结构。不过目前对沉积物中的长线状微生物的研究仍较为缺乏，捕获长线状微生物有助于深入探究其特殊的结构及生态学作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种沉积物中长线状微生物捕获与成像的方法，以实现快速、简易、大量地捕获沉积物中长线状微生物，并对其进行扫描电镜成像观察与研究。
沉积物中长线状微生物由于其趋化性或者单纯基于分裂生长带来的空间距离上的延伸，是其最终可以密布沉积物空间的物理驱动力。因此，当长线状微生物的空间延伸方向被惰性的滤膜阻拦时，基于投影原理便会在膜上形成网状结构并进一步在膜上相互交织，膜则可以捕获这种网状结构并提供观察平面。得益于长线状微生物远高于普通单细胞短杆状或球形等非长线微生物的体积，扫描电镜可以很容易将长线状微生物与周围环境细节(主要包括沉积物颗粒和非长线状微生物)区分开。
本发明的沉积物中长线状微生物捕获与成像的方法，包括以下步骤：
a.将新鲜沉积物注入阻断培养装置：所述的阻断培养装置从下至上依次包括：玻璃圆片、玻璃环、玻璃纤维滤膜、玻璃环，所述的玻璃圆片、玻璃纤维滤膜的直径均大于所述的玻璃环的孔径；先在玻璃圆片上放置一个玻璃环，然后向该玻璃环的中心孔中注入新鲜沉积物并使其上表面与玻璃环上表面平齐，在上表面放置玻璃纤维滤膜，然后在玻璃纤维滤膜上面放置另一个玻璃环，向该玻璃环的中心孔中注入新鲜沉积物，通过紧固件将玻璃圆片-玻璃环-玻璃纤维滤膜-玻璃环四层结构固定住，构建得到沉积物阻断培养装置；
b.将沉积物阻断培养装置放入水体中，连续曝气培养；
c.取出沉积物阻断培养装置中的玻璃纤维滤膜并在玻璃纤维滤膜中心剪取适宜大小，进行固定、漂洗、脱水、置换，冷冻干燥，然后用扫描电子显微镜成像观察。
优选，所述的玻璃纤维滤膜的孔径为0.22μm。
优选，所述的连续曝气培养为曝气培养两周。
优选，所述的步骤c，具体为：取出沉积物阻断培养装置中的玻璃纤维滤膜，在玻璃纤维滤膜中心剪取8mm×8mm大小，用体积分数2.5％戊二醛水溶液固定3小时，用0.05mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液漂洗三次，然后依次用体积分数70％的乙醇水溶液、体积分数85％的乙醇水溶液、体积分数95％的乙醇水溶液、无水乙醇、无水乙醇各进行脱水一次，用叔丁醇置换两次，冷冻干燥，然后用扫描电子显微镜成像观察。
优选，所述的漂洗每次为15分钟。
优选，所述的脱水每次为30分钟。
本发明方法中，可以通过选择不同孔径的玻璃纤维滤膜从而实现对不同种类的长线状微生物的捕获。
本发明的有益效果为：
本发明采用滤膜阻断的方式实现了对长线状微生物的捕获以及后续的扫描电镜成像，这大大地扩展了沉积物中长线状微生物形态结构观察的技术方法和手段。
附图说明
图1为沉积物-膜结合面上的丝状物。
图2为滤膜表面扫描电镜成像图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下所用试剂或仪器，如无特别说明，均为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1
将新鲜沉积物注入阻断培养装置：取厚度为5mm的玻璃圆片(直径为60mm)，然后在该玻璃圆片上放置一个与玻璃圆片同样外径大小的厚度为5mm的玻璃环(中心有孔，孔径为40mm)，然后向该玻璃环的中心孔中注入新鲜沉积物并使其上表面与玻璃环上表面平齐，然后在上表面中间位置放置玻璃纤维滤膜(孔径为0.22μm，直径为47mm)，然后在玻璃纤维滤膜上面放置另一个与上述的玻璃环相同规格的玻璃环，再向该玻璃环的中心孔中注入新鲜沉积物，通过螺丝(或其他紧固件)将玻璃圆片-玻璃环-玻璃纤维滤膜-玻璃环四层结构固定住，构建得到沉积物阻断培养装置。该装置中，玻璃圆片和玻璃环配合用于固定和支持玻璃纤维滤膜，并且将注入的沉积物很好的保持在玻璃环中心孔内的玻璃纤维滤膜上下两侧。
将沉积物阻断培养装置放入水族箱，水族箱内放入适量的自来水(水深至少要淹没整个装置)，连续曝气以维持饱和氧孵育培养，利于电缆细菌等长线状微生物的生长；培养两周后，小心移去玻璃环及其上的沉积物，取出滤膜，然后小心剪取位于滤膜中心的8mm×8mm大小的滤膜，将其置于6孔板中，用体积分数2.5％戊二醛水溶液固定，时间为3小时；之后用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)漂洗滤膜三次，每次15分钟；然后使用浓度递增的梯度乙醇(70％，85％，95％，100％和100％)进行脱水，每次30分钟；接着用100％叔丁醇中置换两次，每次1小时；最后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，时间为4小时，以高真空和15kV加速电压模式进行扫描电子显微镜观察。
从图1可以看到，在从沉积物上轻轻揭取滤膜时，肉眼可见透明丝状物粘连在滤膜与沉积物之间。此外，在沉积物与滤膜的结合面上，也肉眼可见极多的白色丝状物密布于结合面上。对经上述处理后的滤膜进行扫描电镜成像(图2)，结果显示，可以在滤膜上发现大量的长线状微生物，且彼此纵横交错。这些长线状微生物，形态多样(如螺旋状，首尾相接的直线长线状等)，且长度多可达毫米级别。

Claims (4)

1.一种沉积物中长线状微生物捕获与成像的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将新鲜沉积物注入阻断培养装置：所述的阻断培养装置从下至上依次包括：玻璃圆片、玻璃环、玻璃纤维滤膜、玻璃环，所述的玻璃圆片、玻璃纤维滤膜的直径均大于所述的玻璃环的孔径；先在玻璃圆片上放置一个玻璃环，然后向该玻璃环的中心孔中注入新鲜沉积物并使其上表面与玻璃环上表面平齐，在上表面放置玻璃纤维滤膜，然后在玻璃纤维滤膜上面放置另一个玻璃环，向该玻璃环的中心孔中注入新鲜沉积物，通过紧固件将玻璃圆片-玻璃环-玻璃纤维滤膜-玻璃环四层结构固定住，构建得到沉积物阻断培养装置；
b.将沉积物阻断培养装置放入水体中，连续曝气培养；
c.取出沉积物阻断培养装置中的玻璃纤维滤膜并在玻璃纤维滤膜中心剪取适宜大小，进行固定、漂洗、脱水、置换，冷冻干燥，然后用扫描电子显微镜成像观察；
所述的玻璃纤维滤膜的孔径为0.22μm；
所述的连续曝气培养为曝气培养两周。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c，具体为：取出沉积物阻断培养装置中的玻璃纤维滤膜，在玻璃纤维滤膜中心剪取8mm×8mm大小，用体积分数2.5％戊二醛水溶液固定3小时，用0.05mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液漂洗三次，然后依次用体积分数70％的乙醇水溶液、体积分数85％的乙醇水溶液、体积分数95％的乙醇水溶液、无水乙醇、无水乙醇各进行脱水一次，用叔丁醇置换两次，冷冻干燥，然后用扫描电子显微镜成像观察。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的漂洗每次为15分钟。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脱水每次为30分钟。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN210620775U (zh) * 2019-08-29 2020-05-26 新疆大学 一种用于土壤环境微生物原位培养或放线菌捕获的装置

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3228812B2 (ja) * 1993-02-10 2001-11-12 日本マイクロリス株式会社 生菌数を測定する方法
JP4426777B2 (ja) * 2003-05-23 2010-03-03 パナソニックエコシステムズ株式会社 微生物計数方法
WO2009079232A2 (en) * 2007-12-05 2009-06-25 Pathogen Control Associates (Dba Pathcon Laboratories) Method and apparatus for micro-organism capture
JP6688561B2 (ja) * 2015-04-28 2020-04-28 デンカ生研株式会社 微生物抗原の回収法
CN106596608A (zh) * 2016-11-01 2017-04-26 河南科技大学 一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法
CN110511888A (zh) * 2019-08-14 2019-11-29 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种获取长线状微生物短杆状突变株的简易方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN210620775U (zh) * 2019-08-29 2020-05-26 新疆大学 一种用于土壤环境微生物原位培养或放线菌捕获的装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
液体培养微生物的扫描电镜样品制备方法——滤膜载体法;刘维达 等;《安徽医科大学学报》;19890430;第24卷(第4期);第319页 *
黑臭河道修复菌――沉积物中电缆细菌的培养与功能研究;何煦妍 等;《中国科技教育》;20200515(第05期);第22-23页 *

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