CN113832035B - 一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用线虫细胞外囊泡诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，包括如下步骤：(1)线虫的培养；(2)线虫细胞外囊泡的获得及线虫细胞外囊泡表征分析；(3)捕食线虫真菌寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora的培养；(4)利用线虫细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢捕食器官的产生。本发明通过提取秀丽隐杆线虫的细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)，并利用获得的EVs成功诱导寡孢节丛孢产生捕食器官，说明线虫分泌的EVs中包含有诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的物质。这对于理解线虫与捕食线虫真菌的互作机制具有重要的意义，同时在线虫生物防治领域具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子微生物学技术领域，具体涉及一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法。
背景技术
植物寄生线虫包括根结线虫、胞囊线虫和松材线虫等，在世界各地都有广泛分布。据统计，植物寄生线虫每年给全球的各种作物带来约1570亿美元的经济损失。在我国，此类线虫病害已成为农业生产中的第二大类病害，是农业生产中重要的限制因子之一。植物寄生线虫具有寄主多样化、容易传播、隐蔽、顽固、种群数量增长迅速等特点，加之土壤生态的特殊性，对其防治非常困难。长期以来，人们采用化学药物驱虫剂、轮作、引进抗性品种等措施来防治线虫危害，但每种方法各有利弊。使用化学药物驱虫剂虽然具有较好的杀虫效果，但是会给环境带来严重的污染，且很多化学药物是永久不能降解的；至于轮作，很多林木和经济作物是很难实施的；引进抗性品种在短时间内是一个有效防治线虫危害的方法，但是如果在同一地区连续种植某一抗性品种，随着时间的延长，原有的抗性品种就会逐渐丧失抗性，就不能防治线虫危害。而且，抗性基因的筛选及抗性品种的培育受农作物性状的限制，严重影响推广应用的速度。因此，采用线虫天敌进行生物防治已日益受到研究人员的关注（Siddiqui and Mahmood, 1996; 刘杏忠等, 2004）。
捕食线虫真菌（Nematode-trapping fungi）作为土壤生态系统中线虫的重要天敌，已经成为重要的生防真菌资源。这些真菌能够进化出复杂的捕食器官，如收缩环、非收缩环、粘性菌丝、粘性分枝、粘性网等来诱捕土壤中自由生活的线虫（张克勤等, 2006）。目前，食线虫真菌作为一种有效的生物防治资源已经广泛应用于植物寄生线虫的生物防治中，这些真菌开发的线虫生防制剂具有安全、无污染、无残留的优点。然而，由于人们对捕食线虫真菌与线虫互作的分子机制并不完全清楚，导致对线虫的生物防治防效不高、不稳等问题突出，从而限制了高效线虫生防制剂的研发和应用。寡孢节丛孢（Arthiobotrys oligospora, Ao）作为捕食线虫真菌中研究最为深入的一种真菌，其在普通环境中营腐生生活，但在周围环境存在线虫时，该真菌则通过营养菌丝体特化形成三维菌网的捕器捕捉线虫。
捕食器官不仅是食线虫真菌用来攻击线虫的武器，也是它们从腐生生活方式转变为捕食生活方式的重要指标。研究该类真菌捕器的特征对于理解捕食线虫性真菌的作用机理具有重要意义。目前所正式报道的能诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的诱导物质包括线虫提取液、尿素、氨基酸或多肽等。
近年来，一种由细胞主动分泌的具有膜结构的微小囊泡——细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs) 成为生命科学研究的热点。EVs的直径在30~1000 nm之间，具有脂质双分子层结构，里面包裹着多种生物活性物质，主要包括蛋白质、核酸（DNA、mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA等）、代谢物和脂质等。几乎所有细胞都能分泌EVs，它们可以通过内吞或膜融合的方式内化到受体细胞中，这些由EVs携载的生物活性物质在细胞间通信和机体调控中发挥着重要作用。
目前，尚未有利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡来诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法。
本发明提供了利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，为进一步研究食线虫真菌捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料，也为研究线虫与真菌的互作机制提供了新思路。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，包括如下步骤：
（1）秀丽隐杆线虫的培养：
step1秀丽隐杆线虫的培养基和缓冲液：NGM固体培养基和S完全培养基用于培养线虫；M9缓冲液用于清洗虫体及卵孵化；
Step2秀丽隐杆线虫的培养：将大肠杆菌OP50均匀涂布于NGM培养皿上后，接种线虫于20℃培养；也在S 完全培养基中加入浓缩过的大肠杆菌OP50，摇床培养；
step3秀丽隐杆线虫同步化：当镜检发现线虫母体中含大量虫卵时，用M9缓冲液将线虫洗脱，自然沉淀，去除上清，加入线虫裂解液进行裂解，镜下观察线虫虫体完全消失时，加入M9缓冲液去除裂解液，用M9缓冲液重悬虫卵转移至35mm培养皿中，于20℃恒温培养18h后让虫体孵化；
（2）秀丽隐杆线虫细胞外囊泡的获得及表征分析：
用M9缓冲液清洗并重悬同步化的成虫，于20℃，180 rpm摇床培养12h后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的上清梯度离心后用0.22μm滤头过滤，过滤完的上清超速离心后弃上清留沉淀，用PBS洗涤沉淀后再超速离心回收沉淀，随后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为线虫细胞外囊泡CEev；
使用透射电镜TEM观察囊泡形态；纳米颗粒跟踪分析NTA检测囊泡浓度和粒径；
（3）捕食线虫真菌寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora的培养：
PDA固体培养基用于培养寡孢节丛孢菌丝；CMY培养基用于培养寡孢节丛孢孢子；
（4）捕食线虫真菌捕食器官的诱导：
将寡孢节丛孢的孢子均匀涂布到WA培养基上，28°C恒温培养箱内倒置培养3-5天后，实验组：营养菌丝内加入线虫细胞外囊泡CEev，总蛋白浓度40-60mg；对照组：营养菌丝内加入等量PBS；空白组：营养菌丝加入等量无菌水；将培养皿静置于28°C恒温培养箱内孵育12-48 h，光学显微镜下观察捕食器官三维菌网产生。
进一步地，在步骤（1）的step1中，NGM固体培养基1L：称取细菌蛋白胨2.5g，氯化钠3g，琼脂粉20g，将除去琼脂粉的其余试剂溶于800mL去离子水中，待完全溶解后定容为1L，分装250mL到500mL锥形瓶中，每瓶按比例加入琼脂粉，121°C高压灭菌20分钟，待冷却至55℃左右时，加入过滤除菌的1mL 1M CaCl2，1mL 1M MgSO4，25mL 1M KPO4 缓冲液，1mL 溶于95%乙醇中的5mg/mL胆固醇，混匀后分装于平板中，吹干待用；
500mL pH 6.0的1M浓度的 KPO4缓冲液：54.15g KH2PO4，17.8g K2HPO4，去离子水定容至500mL，过滤除菌待用；1L的M9缓冲液：2.2mM KH2PO4，4.2 mM Na2HPO4，8.55 mM NaCl，去离子水定容至1L，121°C高压灭菌20分钟；
S 基础培养基500mL：2.975g NaCl，0.5g K2HPO4，3g KH2PO4，0.5mL溶于95%乙醇中的 5mg/mL的胆固醇，去离子水定容至500mL，121°C高压灭菌20分钟；
200mLpH 6.0的1M浓度的柠檬酸钾溶液：4g一水柠檬酸，58.7g柠檬酸三钾-水合物，去离子水定容至200mL，121°C高压灭菌20分钟；
1L pH 6.0的微量金属溶液：1.86g EDTA，0.69g FeSO4·7H2O，0.2g MnCl2·4H2O，0.29g ZnSO4·7H2O，0.025g CuSO4·5H2O，去离子水定容至1L，121°C高压灭菌20分钟，4℃避光保存；
S 完全培养基：在无菌条件下加入1L S基础培养基，10mL pH为6.0的 1M柠檬酸钾溶液, 10mL 微量金属溶液，3mL 1M CaCl2，3mL 1M MgSO4充分混匀。
进一步地，在步骤（1）的step2中，秀丽隐杆线虫的培养：接种大肠杆菌OP50单菌落于300 mL LB液体培养基中，于恒温摇床培养箱中，180rpm，37℃，24h；每个NGM培养皿中加入1mL 大肠杆菌OP50菌液，涂布均匀，超净工作台中吹干，如需培养的线虫数量较多，将大肠杆菌OP50菌液收集于离心管中，6000rpm，4℃，离心4min，除大量上清，留少许液体，移液器反复吹打使沉淀溶解后，1mL菌液均匀涂布培养皿并吹干，将线虫接种于涂布了大肠杆菌OP50的NGM板上，放置于20℃恒温培养箱中培养。
更进一步地，在步骤（1）的step3中，秀丽隐杆线虫同步化：将培养2-3天的线虫置于显微镜下观察，虫母体中卵呈直线排列，培养皿中幼虫较少，为同步化的最佳时期，使用M9缓冲液将线虫从固体培养基上冲洗下来，清洗过程中应避免反复剧烈冲洗导致培养基中的琼脂被冲下，而影响线虫在裂解过程中的效率。将冲洗下来的线虫装入15 mL离心管中，加入适量M9缓冲液至15 mL，自然沉淀3-5 min，去除上清，重新加入M9缓冲液至15 mL冲洗线虫；此步骤需重复4-6次，至上清变为清澈液体为止，尽量将细菌洗涤干净；将多余上清移除后，洗净的线虫中加入1-2 mL线虫裂解液（0.5mL 5M NaOH和1mL5%次氯酸钠溶液，避光，现配现用），剧烈振荡2-5 min（不应超过5分钟），振荡2分钟后，每30s肉眼观察一次，线虫出现断裂后，15s观察一次，直至线虫虫体完全消失，立即向裂解完成的离心管中加入M9缓冲液至15mL，4000rpm，20℃，离心2min，用移液器吸除上清，重新加入M9缓冲液至15mL，重复清洗5-6次直至无次氯酸钠气味为止；
将上清移除干净后，加入5mL M9缓冲液，用移液器轻柔吹打悬浮沉淀后，将液体转移至35mm培养皿中，使用显微镜进行镜检，此时虫卵形态应为完整椭圆形，内部结构清晰，无破裂，20℃恒温培养18h后达到95%以上的孵化率，如需大量培养的同步化幼虫，则在250mL的广口瓶中加入50mL S培养基，加入浓缩过的大肠杆菌OP50，20℃，180rpm摇床培养，中途需镜检观察线虫生长状态，适时补充大肠杆菌OP50。
进一步地，在步骤（2）中，秀丽隐杆线虫细胞外囊泡获得：
将同步化的L1加到50mL S 完全液体培养基中，以25mg /mL 大肠杆菌OP50喂养，每瓶15万条，20℃，180rpm培养至成虫；收集300000-400000条成虫，并用M9清洗去除多余的细菌后，将成虫在25mL M9中于20℃于180 rpm摇动培养12h，取出成虫后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的液体分别经4000g，15min，4℃、15000g，30min，4℃离心去沉淀，再经0.22μm滤头过滤，100000g，70min，4℃超速离心，收集沉淀，用灭菌后再经0.22μm滤头过滤的PBS洗涤一次，100000g，70min，4℃超速离心，最后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为线虫细胞外囊泡CEev，分装到1.5mL离心管后存于-80°C待用。
进一步地，在步骤（3）中，捕食线虫真菌寡孢节丛孢A. oligospora的培养
step1培养基的组成和配制方法如下：
PDA培养基1L：去皮马铃薯200 g，切块、煮沸后计时30min，6层纱布过滤收集上清液，加入葡萄糖20 g，加ddH2O补充体积到1L，分装250mL到500mL锥形瓶中，称取20g琼脂粉每瓶按比例加入，121°C高压灭菌20分钟；
WA培养基1L：1000mL ddH2O，加入20 g琼脂，121°C高压灭菌20分钟；
CMY培养基1L：玉米粒25g煮沸后计时30min，6层纱布过滤收集上清液，加入酵母提取物5 g，加ddH2O补充体积到1L后分装50mL到250mL广口三角瓶中，称取20g琼脂粉每瓶按比例加入，121°C高压灭菌20分钟。
更进一步地，在步骤（3）中，step2寡孢节丛孢的活化和孢子培养：在PDA固体培养基上接种寡孢节丛孢，28°C恒温培养箱内培养5天；在PDA培养基上取培养好的寡孢节丛孢菌块，接种到CMY培养基上，28℃培养15天以获得孢子；用无菌水和已灭菌玻璃珠将在CMY培养基上生长15天的寡孢节丛孢菌丝充分摇晃下来；将瓶中液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤，收集孢子；用血球计数板计数并计算孢子的浓度。
有益效果：本发明通过超速离心的方法提取了秀丽隐杆线虫所分泌的细胞外囊泡，并将获得的细胞外囊泡与捕食线虫真菌的模式物种寡孢节丛孢进行互作，成功诱导寡孢节丛孢产生捕食器官三维菌网。本发明证实秀丽隐干线虫分泌的细胞外囊泡中包含有能诱导捕食器官产生的信号物质。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：（1）利用线虫细胞外囊泡能够有效诱导捕食线虫真菌产生捕食器官；本发明通过提取秀丽隐杆线虫的细胞外囊泡，并利用获得的EVs成功诱导寡孢节丛孢产生捕食器官，说明线虫分泌的EVs中包含有诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的物质。这对于理解线虫与捕食线虫真菌的互作机制具有重要的意义。
（2）在添加了秀丽隐杆线虫细胞外囊泡的寡孢节丛孢对秀丽隐杆线虫的捕捉能力明显高于未添加的真菌。本发明为进一步研究捕食线虫真菌捕食器官形成的分子机制及线虫与真菌的互作机制提供了良好的实验材料，此外，在线虫生物防治领域具有重要的应用价值。附图说明
图1为本发明的线虫细胞外囊泡透射电镜的示意图；线虫细胞外囊泡呈典型的双层膜包裹的囊泡结构，似“杯状”。
图2为本发明的线虫细胞外囊泡粒径分布图；可见线虫细胞外囊泡大小主要分布于40-100 nm之间。
图3为本发明的线虫细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕器图；A： AO+水，B： AO+CEev；
图4为本发明的在线虫及线虫细胞外囊泡的双重诱导下寡孢节丛孢产生大量捕器的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例
本发明的一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，包括如下步骤：
（1）秀丽隐杆线虫的培养：
step1秀丽隐杆线虫的培养基和缓冲液：NGM固体培养基和S 完全液体培养基用于培养线虫；M9缓冲液用于清洗虫体及卵孵化；NGM固体培养基1L：称取细菌蛋白胨2.5g，氯化钠3g，琼脂粉20g，将除去琼脂粉的其余试剂溶于800mL去离子水中，待完全溶解后定容为1L，分装250mL到500mL锥形瓶中，每瓶按比例加入琼脂粉，121°C高压灭菌20分钟，待冷却至55℃左右时，加入过滤除菌的1mL 1M CaCl2，1mL 1M MgSO4，25mL 1M KPO4缓冲液，1mL 5mg/mL胆固醇，混匀后分装于平板中，吹干待用；
500mL pH 6.0的1M浓度的 KPO4缓冲液：54.15g KH2PO4，17.8g K2HPO4，去离子水定容至500mL，过滤除菌待用；
1L 的M9缓冲液：2.2mM KH2PO4，4.2 mM Na2HPO4，8.55 mM NaCl，去离子水定容至1L，121°C高压灭菌20分钟；
S 基础培养基500mL：2.975g NaCl，0.5g K2HPO4，3g KH2PO4，0.5mL溶于95%乙醇中的 5mg/mL的胆固醇，去离子水定容至500mL，121°C高压灭菌20分钟；
200mLpH 6.0的1M浓度的柠檬酸钾溶液：4g一水柠檬酸，58.7g柠檬酸三钾-水合物，去离子水定容至200mL，121°C高压灭菌20分钟；
1L pH 6.0的微量金属溶液：1.86g EDTA，0.69g FeSO4·7H2O，0.2g MnCl2·4H2O，0.29g ZnSO4·7H2O，0.025g CuSO4·5H2O，去离子水定容至1L，121°C高压灭菌20分钟，4℃避光保存；
S 完全培养基：在无菌条件下加入1L S基础培养基，10mL pH为6.0的 1M柠檬酸钾溶液, 10mL 微量金属溶液，3mL 1M CaCl2，3mL 1M MgSO4充分混匀。
Step2秀丽隐杆线虫的培养：将大肠杆菌OP50均匀涂布于NGM培养皿上后，接种线虫于20℃培养。也以在S完全培养基中加入浓缩过的大肠杆菌OP50，摇床培养；秀丽隐杆线虫的培养：接种大肠杆菌OP50单菌落于300 mL LB液体培养基中，于恒温摇床培养箱中，180rpm，37℃，24h；每个NGM培养皿中加入1mL大肠杆菌 大肠杆菌OP50菌液，涂布均匀，超净工作台中吹干，如需培养的线虫数量较多，将大肠杆菌OP50菌液收集于离心管中，6000rpm，4℃，离心4min，除大量上清，留少许液体，移液器反复吹打使沉淀溶解后，1mL菌液均匀涂布培养皿并吹干，将线虫接种于涂布了大肠杆菌OP50的NGM板上，直接接种线虫，可将原含有线虫的培养基切下一块面朝下置于新准备的NGM板上，放置于20℃恒温培养箱中培养。
step3秀丽隐杆线虫同步化：当镜检发现线虫母体中含大量虫卵时，用M9缓冲液将线虫洗脱，自然沉淀，去除上清，加入线虫裂解液进行裂解，镜下观察线虫虫体完全消失时，加入M9缓冲液去除裂解液，用M9缓冲液重悬虫卵转移至35mm培养皿中，于20℃恒温培养18h后让虫体孵化；
秀丽隐杆线虫同步化：将培养3天的线虫置于显微镜下观察，虫母体中卵呈直线排列，培养皿中幼虫较少，为同步化的最佳时期，使用M9缓冲液将线虫从固体培养基上冲洗下来，清洗过程中应避免反复剧烈冲洗导致培养基中的琼脂被冲下，而影响线虫在裂解过程中的效率。将冲洗下来的线虫装入15 mL离心管中，加入适量M9缓冲液至15 mL，自然沉淀3-5 min，去除上清，重新加入M9缓冲液至15 mL冲洗线虫；此步骤需重复4-6次，至上清变为清澈液体为止，尽量将细菌洗涤干净；将多余上清移除后，洗净的线虫中加入2 mL线虫裂解液（0.5mL 5M NaOH和1mL5%次氯酸钠溶液，避光，现配现用），剧烈振荡5 min，不应超过５分钟，振荡２分钟后，每30s肉眼观察一次，线虫出现断裂后，15s观察一次，直至线虫虫体完全消失，立即向裂解完成的离心管中加入M9缓冲液至15mL，4000rpm，20℃，离心2min，用移液器吸除上清，重新加入M9缓冲液至15mL，重复清洗5次直至无次氯酸钠气味为止；
尽量将上清移除干净后，加入5mL M9缓冲液，用移液器轻柔吹打悬浮沉淀后，将液体转移至35mm培养皿中，使用显微镜进行镜检，此时虫卵形态应为完整椭圆形，内部结构清晰，无破裂，20℃恒温培养18h后可达到95%以上的孵化率，如需大量培养的同步化幼虫，则在250mL的广口瓶中加入50mL S完全培养基，加入浓缩过的大肠杆菌OP50，20℃，180 rpm摇床培养，中途需镜检观察线虫生长状态，适时补充大肠杆菌OP50。
（2）线虫细胞外囊泡的获得及表征分析：
用M9缓冲液清洗并重悬同步化的成虫，于20℃，180 rpm摇床培养12h后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的上清梯度离心后用0.22μm滤头过滤，过滤完的上清超速离心后弃上清留沉淀，用PBS洗涤沉淀后再超速离心回收沉淀，随后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为线虫细胞外囊泡CEev；
使用透射电镜TEM观察囊泡形态；纳米颗粒跟踪分析NTA检测囊泡浓度和粒径；
秀丽隐杆线虫细胞外囊泡获得：
将同步化的L1加到50mL S 完全液体培养基中，以25mg /mL 大肠杆菌OP50喂养，每瓶15万条，20℃，180rpm培养至成虫；收集400000条成虫，并用M9清洗去除多余的细菌后，将成虫在25mL M9中于20℃于180 rpm摇动培养12h，取出成虫后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的液体分别经4000g，15min，4℃、15000g，30min，4℃离心去沉淀，再经0.22μm滤头过滤，100000g，70min，4℃超速离心，收集沉淀，用灭菌后再经0.22μm滤头过滤的PBS洗涤一次，100000g，70min，4℃超速离心，最后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为线虫细胞外囊泡CEev，分装到1.5mL离心管后存于-80°C待用。
（3）捕食线虫真菌寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora的培养：
PDA固体培养基用于培养寡孢节丛孢菌丝；CMY培养基用于培养寡孢节丛孢孢子；
捕食线虫真菌寡孢节丛孢A. oligospora的培养
step1培养基的组成和配制方法如下：
PDA培养基1L：去皮马铃薯200 g，切块、煮沸后计时30min，6层纱布过滤收集上清液，加入葡萄糖20 g，加ddH2O补充体积到1L，分装250mL到500mL锥形瓶中，称取20g琼脂粉每瓶按比例加入，121°C高压灭菌20分钟；
WA培养基1L：1000mL ddH2O，加入20 g琼脂，121°C高压灭菌20分钟；
CMY培养基1L：玉米粒25g煮沸后计时30min，6层纱布过滤收集上清液，加入酵母提取物5 g，加ddH2O补充体积到1L后分装50mL到250mL广口三角瓶中，称取20g琼脂粉每瓶按比例加入，121°C高压灭菌20分钟。
step2寡孢节丛孢的活化和孢子培养：在PDA固体培养基上接种寡孢节丛孢，28°C恒温培养箱内培养5天；在PDA培养基上取培养好的寡孢节丛孢菌块，接种到CMY培养基上，28℃培养15天以获得孢子；用无菌水和已灭菌玻璃珠将在CMY培养基上生长15天的寡孢节丛孢菌丝充分摇晃下来；将瓶中液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤，收集孢子；用血球计数板计数并计算孢子的浓度。
（4）捕食线虫真菌捕食器官的诱导：
将寡孢节丛孢的孢子均匀涂布到WA培养基上，28°C恒温培养箱内倒置培养5天后，实验组：营养菌丝内加入线虫细胞外囊泡CEev，总蛋白浓度60mg；对照组：营养菌丝内加入等量PBS；空白组：营养菌丝加入等量无菌水；将培养皿静置于28°C恒温培养箱内孵育16h，光学显微镜下观察捕食器官三维菌网产生。
实施例
在步骤（1）中，线虫同步化：将培养2天的线虫置于显微镜下观察，虫母体中卵呈直线排列，培养皿中幼虫较少，为同步化的最佳时期，使用M9缓冲液将线虫从固体培养基上冲洗下来，清洗过程中应避免反复剧烈冲洗导致培养基中的琼脂被冲下，而影响线虫在裂解过程中的效率。将冲洗下来的线虫装入15 mL离心管中，加入适量M9缓冲液至15 mL，自然沉淀3-5 min，去除上清，重新加入M9缓冲液至15 mL冲洗线虫；此步骤需重复4-6次，至上清变为清澈液体为止，尽量将细菌洗涤干净；将多余上清移除后，洗净的线虫中加入2 mL线虫裂解液（0.5mL 5M NaOH和1mL5%次氯酸钠溶液，避光，现配现用），剧烈振荡2 min，不应超过５分钟，振荡２分钟后，每30s肉眼观察一次，线虫出现断裂后，15s观察一次，直至线虫虫体完全消失，立即向裂解完成的离心管中加入M9缓冲液至15mL，4000rpm，20℃,离心2min，用移液器吸除上清，重新加入M9缓冲液至15mL，重复清洗5.5次直至无次氯酸钠气味为止；
在步骤（2）中，将同步化的L1加到50mL S完全液体培养基中，以25mg /mL的大肠杆菌OP50喂养，每瓶15万条，20℃，180rpm培养至成虫；收集300000条成虫，并用M9清洗去除多余的细菌后，将YA在25mL M9中于20℃于180 rpm摇动培养12h，取出成虫后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的液体分别经4000g，15min，4℃、15000g，30min，4℃离心去沉淀，再经0.22μm滤头过滤，100000g，70min，4℃超速离心，收集沉淀，用灭菌后再经0.22μm滤头过滤的PBS洗涤一次，100000g，70min，4℃超速离心，最后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为线虫细胞外囊泡CEev，分装到1.5mL离心管后存于-80°C待用。
在步骤（4）中，捕食线虫真菌捕食器官的诱导：
将寡孢节丛孢的孢子均匀涂布到WA培养基上，28°C恒温培养箱内倒置培养3天后，实验组：营养菌丝内加入线虫细胞外囊泡CEev，总蛋白浓度50mg；对照组：营养菌丝内加入等量PBS；空白组：营养菌丝加入等量无菌水；将培养皿静置于28°C恒温培养箱内孵育12h，光学显微镜下观察捕食器官三维菌网产生。
实施例
在步骤（1）中，线虫同步化：将培养2.5天的线虫置于显微镜下观察，虫母体中卵呈直线排列，培养皿中幼虫较少，为同步化的最佳时期，使用M9缓冲液将线虫从固体培养基上冲洗下来，清洗过程中应避免反复剧烈冲洗导致培养基中的琼脂被冲下，而影响线虫在裂解过程中的效率。将冲洗下来的线虫装入15 mL离心管中，加入适量M9缓冲液至15 mL，自然沉淀3-5 min，去除上清，重新加入M9缓冲液至15 mL冲洗线虫；此步骤需重复4-6次，至上清变为清澈液体为止，尽量将细菌洗涤干净；将多余上清移除后，洗净的线虫中加入1.6 mL线虫裂解液（0.5mL 5M NaOH和1mL5%次氯酸钠溶液，避光，现配现用），剧烈振荡3 min（不应超过5分钟），振荡２分钟后，每30s肉眼观察一次，线虫出现断裂后，15s观察一次，直至线虫虫体完全消失，立即向裂解完成的离心管中加入M9缓冲液至15mL，4000rpm，20℃,离心2min，用移液器吸除上清，重新加入M9缓冲液至15mL，重复清洗6次直至无次氯酸钠气味为止；
在步骤（2）中，将同步化的L1加到50mL S Medium液体培养基中，以25mg /mL 大肠杆菌OP50喂养，每瓶15万条，20℃，180rpm培养至成虫；收集350000条成虫，并用M9清洗去除多余的细菌后，将YA在25mL M9中于20℃于180 rpm摇动培养12h，取出成虫后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的液体分别经4000g，15min，4℃、15000g，30min，4℃离心去沉淀，再经0.22μm滤头过滤，100000g，70min，4℃超速离心，收集沉淀，用灭菌后再经0.22μm滤头过滤的PBS洗涤一次，100000g，70min，4℃超速离心，最后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为线虫细胞外囊泡CEev，分装到1.5mL离心管后存于-80°C待用。
在步骤（4）中，捕食线虫真菌捕食器官的诱导：
将寡孢节丛孢的孢子均匀涂布到WA培养基上，28°C恒温培养箱内倒置培养4天后，实验组：营养菌丝内加入线虫细胞外囊泡CEev，总蛋白浓度40mg；对照组：营养菌丝内加入等量PBS；空白组：营养菌丝加入等量无菌水；将培养皿静置于28°C恒温培养箱内孵育12 h，光学显微镜下观察捕食器官三维菌网产生。
实施例
本发明为进一步研究食线虫真菌捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料，也为研究线虫与真菌的互作机制提供了新思路。
本发明涉及的秀丽隐杆线虫及寡孢节丛孢为实验室常规实验用线虫及真菌，能从国内外的线虫和或真菌保藏机构购买得到。
捕食线虫真菌寡孢节丛孢菌丝捕食器官的诱导。
按照上面所描述的方法制备线虫细胞外囊泡，寡孢节丛孢接种到CMY培养基上，28℃培养15天以获得孢子。用无菌水和已灭菌玻璃珠将在CMY培养基上生长15天的寡孢节丛孢菌丝充分摇晃下来；将瓶中液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤，收集孢子；用血球计数板计数并计算孢子的浓度。
取104均匀涂布到WA培养基上，28°C恒温培养箱内倒置培养3天后，实验组：营养菌丝内加入总蛋白浓度40-60mg的线虫细胞外囊泡；对照组：营养菌丝内加入等量PBS；空白组：营养菌丝加入等量无菌水。将培养皿静置于28°C恒温培养箱内孵育12-48 h，光学显微镜下观察可见捕食器官产生。
用1%的次氯酸钠对秀丽隐杆线虫进行消毒处理后，用无菌去离子水反复冲洗虫体3-4次。分别在上述WA板中加入100-200条/皿消毒后的秀丽隐杆线虫。用光学显微镜观察线虫细胞外囊泡诱导产生的三维菌网的形态和捕捉线虫的情况并计数。
实施例
捕食线虫真菌对秀丽隐杆线虫的捕捉观察（以捕食线虫真菌的模式菌株寡孢节丛孢A. oligospora为例）
1）用1%的次氯酸钠对秀丽隐杆线虫进行消毒处理后，用无菌去离子水反复冲洗虫体3-4次。分别在上述WA板中加入100条/皿消毒后的秀丽隐杆线虫。
2）用光学显微镜观察线虫细胞外囊泡诱导产生的三维菌网的形态和捕捉线虫的情况并计数（图4）。
线虫细胞外囊泡表征
采用BCA法测定细胞外囊泡的总蛋白浓度为0.5mg/mL，将获得的细胞外囊泡用高分辨率透射电镜观察形态（如图1所示），用粒径分析仪检测粒径大小（如图2所示）。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）秀丽隐杆线虫的培养：
step1秀丽隐杆线虫的培养基和缓冲液：NGM固体培养基和S 完全培养基用于培养线虫；M9缓冲液用于清洗虫体及卵孵化；
Step2秀丽隐杆线虫的培养：将大肠杆菌OP50均匀涂布于NGM培养皿上后，接种线虫于20℃培养；在S 完全培养基中加入浓缩过的大肠杆菌OP50，摇床培养；
step3秀丽隐杆线虫同步化：当镜检发现线虫母体中含大量虫卵时，用M9缓冲液将线虫洗脱，自然沉淀，去除上清，加入线虫裂解液进行裂解，镜下观察线虫虫体完全消失时，加入M9缓冲液去除裂解液，用M9缓冲液重悬虫卵转移至35mm培养皿中，于20℃恒温培养18h后让虫体孵化；
（2）秀丽隐杆线虫细胞外囊泡的获得及表征分析：
用M9缓冲液清洗并重悬同步化的成虫，于20℃，180 rpm摇床培养12h后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的上清梯度离心后用0.22μm滤头过滤，过滤完的上清超速离心后弃上清留沉淀，用PBS洗涤沉淀后再超速离心回收沉淀，随后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为线虫细胞外囊泡CEev；
使用透射电镜TEM观察囊泡形态；纳米颗粒跟踪分析NTA检测囊泡浓度和粒径；
（3）捕食线虫真菌寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora的培养：
PDA固体培养基用于培养寡孢节丛孢菌丝；CMY培养基用于培养寡孢节丛孢孢子；
（4）捕食线虫真菌捕食器官的诱导：
将寡孢节丛孢的孢子均匀涂布到WA培养基上，28°C恒温培养箱内倒置培养3-5天后，实验组：营养菌丝内加入线虫细胞外囊泡CEev，总蛋白浓度40-60mg；对照组：营养菌丝内加入等量PBS；空白组：营养菌丝加入等量无菌水；将培养皿静置于28°C恒温培养箱内孵育12-48h，光学显微镜下观察捕食器官三维菌网产生。
2.根据权利要求1所述的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于：在步骤（1）的step1中，NGM固体培养基1L：称取细菌蛋白胨2.5g，氯化钠3g，琼脂粉20g，将除去琼脂粉的其余试剂溶于800mL去离子水中，待完全溶解后定容为1L，分装250mL到500mL锥形瓶中，每瓶按比例加入琼脂粉，121°C高压灭菌20分钟，待冷却至55℃左右时，加入过滤除菌的1mL 1M CaCl2，1mL 1M MgSO4，25mL 1M KPO4 缓冲液，1mL 浓度为5mg/mL的胆固醇，胆固醇溶于95%乙醇中，混匀后分装于平板中，吹干待用；
500mL pH 6.0的1M浓度的 KPO4缓冲液：54.15g KH2PO4，17.8g K2HPO4，去离子水定容至500mL，过滤除菌待用；
1L 的M9缓冲液：2.2mM KH2PO4，4.2 mM Na2HPO4，8.55 mM NaCl，去离子水定容至1L，121°C高压灭菌20分钟；
500mLS基础培养基：2.975g NaCl，0.5g K2HPO4，3g KH2PO4，0.5mL 5mg/mL溶于95%乙醇中的胆固醇，去离子水定容至500mL，121°C高压灭菌20分钟；
200mLpH 6.0的1M浓度的柠檬酸钾溶液：4g一水柠檬酸，58.7g柠檬酸三钾-水合物，去离子水定容至200mL，121°C高压灭菌20分钟；
1L pH 6.0的微量金属溶液：1.86g EDTA，0.69g FeSO4·7H2O，0.2g MnCl2·4H2O，0.29gZnSO4·7H2O，0.025g CuSO4·5H2O，去离子水定容至1L，121°C高压灭菌20分钟，4℃避光保存；
S完全培养基：在无菌条件下加入1L S基础培养基，10mL 1M柠檬酸钾溶液, 柠檬酸钾溶液的pH为6.0，10mL 微量金属溶液，3mL 1M CaCl2，3mL 1M MgSO4充分混匀。
3.根据权利要求1所述的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于：在步骤（1）的step2中，线虫的培养：接种大肠杆菌OP50单菌落于300 mL LB液体培养基中，于恒温摇床培养箱中，180rpm，37℃，24h；每个NGM培养皿中加入1mL 大肠杆菌OP50菌液，涂布均匀，超净工作台中吹干，如需培养的线虫数量较多，将大肠杆菌OP50菌液收集于离心管中，6000rpm，4℃，离心4min，除大量上清，留少许液体，移液器反复吹打使沉淀溶解后，1mL菌液均匀涂布培养皿并吹干，将线虫接种于涂布了大肠杆菌OP50的NGM板上，直接接种线虫，将原含有线虫的培养基切下一块面朝下置于新准备的NGM板上，放置于20℃恒温培养箱中培养。
4.根据权利要求1所述的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于：在步骤（1）的step3中，线虫同步化：将培养2-3天的线虫置于显微镜下观察，虫母体中卵呈直线排列，培养皿中幼虫较少，为同步化的最佳时期，使用M9缓冲液将线虫从固体培养基上冲洗下来，清洗过程中应避免反复剧烈冲洗导致培养基中的琼脂被冲下，而影响线虫在裂解过程中的效率，将冲洗下来的线虫装入15 mL离心管中，加入适量M9缓冲液至15 mL，自然沉淀3-5 min，去除上清，重新加入M9缓冲液至15 mL冲洗线虫；此步骤需重复4-6次，至上清变为清澈液体为止，将细菌洗涤干净；将多余上清移除后，洗净的线虫中加入1-2 mL线虫裂解液，所述裂解液为0.5mL 5M NaOH和1mL5%次氯酸钠溶液，避光现配现用，剧烈振荡2-5 min，不应超过5分钟，振荡２分钟后，每30s肉眼观察一次，线虫出现断裂后，15s观察一次，直至线虫虫体完全消失，立即向裂解完成的离心管中加入M9缓冲液至15mL，4000rpm，20℃,离心2min，用移液器吸除上清，重新加入M9缓冲液至15mL，重复清洗5-6次直至无次氯酸钠气味为止；
将上清移除干净后，加入5mL M9缓冲液，用移液器轻柔吹打悬浮沉淀后，将液体转移至35mm培养皿中，使用显微镜进行镜检，此时虫卵形态应为完整椭圆形，内部结构清晰，无破裂，20℃恒温培养18h后达到95%以上的孵化率，如需大量培养的同步化幼虫，则在250mL的广口瓶中加入50mL S完全培养基，加入浓缩过的大肠杆菌OP50，20℃，180rpm摇床培养，中途需镜检观察线虫生长状态，适时补充大肠杆菌OP50。
5.根据权利要求1所述的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于：在步骤（2）中，线虫细胞外囊泡获得：
将同步化的L1加到50mL S完全培养基中，以25mg /mL 的大肠杆菌OP50喂养，每瓶15万条，20℃，180rpm培养至成虫；收集300000-400000条成虫，并用M9清洗去除多余的细菌后，将成虫在25mL M9中于20℃于180rpm摇动培养12h，取出成虫后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的液体分别经4000g，15min，4℃、15000g，30min，4℃离心去沉淀，再经0.22μm滤头过滤，100000g，70min，4℃超速离心，收集沉淀，用灭菌后再经0.22μm滤头过滤的PBS洗涤一次，100000g，70min，4℃超速离心，最后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为秀丽隐杆线虫细胞外囊泡CEev，分装到1.5mL离心管后存于-80°C待用。
6.根据权利要求1所述的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于：在步骤（3）中，捕食线虫真菌寡孢节丛孢的培养
step1培养基的组成和配制方法如下：
PDA培养基1L：去皮马铃薯200 g，切块、煮沸后计时30min，6层纱布过滤收集上清液，加入葡萄糖20 g，加ddH2O补充体积到1L，分装250mL到500mL锥形瓶中，称取20g琼脂粉每瓶按比例加入，121°C高压灭菌20分钟；
WA培养基1L：1000mL ddH2O，加入20 g琼脂，121°C高压灭菌20分钟；
CMY培养基1L：玉米粒25g煮沸后计时30min，6层纱布过滤收集上清液，加入酵母提取物5 g，加ddH2O补充体积到1L后分装50mL到250mL广口三角瓶中，称取20g琼脂粉每瓶按比例加入，121°C高压灭菌20分钟。
7.根据权利要求1所述的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于：在步骤（3）中，step2寡孢节丛孢的活化和孢子培养：在PDA固体培养基上接种寡孢节丛孢，28°C恒温培养箱内培养5天；在PDA培养基上取培养好的寡孢节丛孢菌块，接种到CMY培养基上，28℃培养15天以获得孢子；用无菌水和已灭菌玻璃珠将在CMY培养基上生长15天的寡孢节丛孢菌丝充分摇晃下来；将瓶中液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤，收集孢子；用血球计数板计数并计算孢子的浓度。
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| Guillermo Vidal-Diez de Ulzurrun 等.《Predator-prey interactions of nematode-trapping fungi and nematodes:both sides of the coin》.Applied Microbiology and Biotechnology.2018,第102卷全文. * |
| 王瑞 . 《少孢节丛孢菌捕食器表面聚合物的诱导与提取方法研究》.畜牧与兽医.2010,第42卷(第10期),全文. * |
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