CN106591153A - 一株对苹果蠹蛾高致病力的绿僵菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株对蛴螬幼虫具有高致病力的球孢白僵菌及其应用。本发明所提供的球孢白僵菌菌株命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BbQLU1，已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏编号：CGMCC NO.11618。通过对该菌株进行形态学以及DNA‑ITS序列的测定鉴定出该菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。该菌株生长速度较快，产孢能力强，同时能较好的防治蛴螬幼虫，具有良好的开发潜力和生产价值。

Description

一株对苹果蠹蛾高致病力的绿僵菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于害虫生物防治领域，涉及一株绿僵菌及其应用，具体涉及一株对苹果蠹蛾具有高致病力的金龟子绿僵菌及其应用。
背景技术
苹果蠹蛾(Cydia pomonella)，属鳞翅目卷蛾科，杂食性钻蛀害虫，有很强的适应性、抗逆性和繁殖能力，是世界性仁果类水果的重要检疫性害虫。该虫自上世纪80年代中期传入新疆、甘肃等地区后，已在河西走廊西段造成严重的危害，并且持续向东蔓延。苹果蠹蛾蛀果率普遍在50％以上，严重的可达70％–100％，严重影响了国内外水果的生产和销售。
目前针对苹果蠹蛾的防治措施主要有以下几方面：①在人工防控方面，主要采用刮老翘皮、清除虫源，果实套袋、阻止产卵，休园、诱集幼虫等措施，起到了一定的作用，但是这些方法浪费劳动力资源，生产成本较高；②在化学防控方面，翟小伟(苹果蠹蛾发生规律和化学生态调控技术[D].泰安：山东农业大学，2009)尝试用性信息素诱捕、迷向技术和化学制剂三种方法防治苹果蠹蛾，其中对于性信息素的释放量、诱捕器的类型等进行了优化对比，选择出较优的方案，结果核心示范区蛀果率仍有2.88％，不能及时有效地减少对苹果产品的危害，另一方面使用化学制剂(3％高渗苯氧威)把果实受损率控制在2％左右，具有一定的效果，但长期频繁使用会使苹果蠹蛾产生严重的抗药性；③在生物防控方面，Konecka E等人(Scientific World Journal[J],2012,doi 10.1100/2012/710501)研究证实苏云金芽胞杆菌Bt(Bacillus thuringiensis)对苹果蠹蛾幼虫有防治作用，其对施药工人、农产品以及害虫天敌都是相对安全的，但是这种防治是以胃毒方式来发挥作用,而真正能够被苹果蠹蛾幼虫取食的Bt剂量达不到致死效果，导致防治效果并不理想，使该种病原微生物的实际生产应用受到限制。
目前在中国北部地区苹果蠹虫的危害性极大，大多都是采用物理和化学防治的措施，实施效果有限。昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，具有安全可靠、持续控制和昆虫不易产生抗药性的优点。昆虫病毒杀虫剂的特异性强，只能在活的宿主细胞内增殖，目前多采用野外感染、收集发病昆虫的方式生产病毒杀虫剂。绿僵菌(Metarhizium)是最早用于防治害虫的昆虫病原真菌之一，能感染全世界200多种昆虫，具有适应性强、在果林间能长期宿存、致病周期短、对人畜无毒害以及对环境友好等特点，利用绿僵菌防控苹果蠹蛾将成为必然。而利用昆虫病原真菌来防治苹果蠹虫的报道很少甚至没有，因此，筛选一株对苹果蠹虫高致病力的金龟子绿僵菌菌株将是一项必要而紧迫的研究工作，为一种防治苹果蠹虫的微生物制剂的工业化生产奠定一定的基础，以期达到生态、经济、社会效益最大化。
发明内容
为了解决缺乏优良的生防菌株而限制苹果蠹蛾生物防治的问题，本发明的首要目的是提供一株对苹果蠹蛾具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株。
本发明的另一目的在于提供上述金龟子绿僵菌菌株在防治苹果蠹蛾方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株对苹果蠹蛾具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株，菌株为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)MaQLU1，已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC No.11766。
该金龟子绿僵菌MaQLU1具有以下特征：
在PPDA培养基上25～28℃条件下生长3～4天，菌落的平均直径20mm,15天后达到70mm。菌落初期菌落质地呈白色棉絮状，后期有橄榄绿色的孢子层呈中心凸起状态。菌丝体透明光滑，具有分枝和分隔，直径为1.6～2.1μm；分生孢子孢子梗单生或多生紧密排列，呈帚状分支，直径约为2.0μm，其末端产生瓶形小梗，相互缠绕交叉生长，大量聚集成分生孢子座；从瓶梗的末端以向基式连续形成串链的分生孢子，分生孢子为单细胞，呈长椭圆形，脱落后聚集成孢子团大小4.8-6.7×2.2-3.6μm。
本发明所提供的或所述的菌剂可用于防治苹果蠹蛾。
本发明所提供的菌剂的有效成分是上述的金龟子绿僵菌MaQLU1产生的分生孢子。
本发明所提供金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)MaQLU1对苹果蠹蛾具有较强的侵染致病能力。实验室采用体壁侵染的方法，将一组30～40头苹果蠹蛾在30ml 108个孢子/ml的悬液中浸渍10s，并以0.02％吐温-80的浸渍作为空白对照。每组幼虫置于直径15cm的大号培养皿中，在25℃和12:12h条件下保持12天，每隔一天观察记录死亡数，各处理重复3次。统计培养期间处理组和对照组苹果蠹蛾的累计死亡数量，计算半致死时间LT5O，评估防治效果。
本发明的优势在于：本发明提供了一株对苹果蠹蛾具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用，对防治苹果蠹蛾方面提供了一种生物防治资源。同时利用绿僵菌进行生物防治具有安全可靠、无污染、药性持久、致病力强的特点，利用绿僵菌防治苹果蠹蛾，从根本上解决了用化学防治产生的农药残留、污染环境等问题，具有良好的开发潜力和应用价值。
附图说明
图1为金龟子绿僵菌分子鉴定的N-J系统发生树结构示意图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中的PPDA培养基为蛋白胨－马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其具体配方为去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨l0g,水1000ml。
实施例1金龟子绿僵菌MaQLU1的鉴定
本次采用的分离方法是僵虫分离法。从山东省农科院长清科研基地采集到的苹果蠹蛾僵虫放在灭菌的培养皿中，经0.1％升汞酒精(用95％的酒精1000ml溶解1g升汞)表面消毒3～4min，再用无菌水洗涤三次，将消毒的僵虫放置于PPDA平板的培养基的中央，在26℃恒温培养箱中培养10～14天，将其体表的绿色粉状物轻轻抖落到盛有0.1％的吐温-80的水溶液的三角瓶中，用磁力搅拌子剧烈震荡使绿僵菌分生孢子单个分开。将孢子悬浮液进行梯度稀释，利用移液枪吸取少量菌液滴到PPDA培养基平板上，并利用涂布器均匀涂布，置于26～28℃恒温培养箱中培养。
当在培养基上长出单个白色絮状的菌落，及时用接种环挑出并及时转到另一个灭菌的PPDA培养基平板上，继续培养观察并没有其他杂菌侵染，纯化培养即完成。
1.2形态学鉴定
将分离纯化的金龟子绿僵菌菌株在直径为90mm平板PPDA培养基上于上25～28℃条件下培养，5～8天后从平板上挑取绿色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子的形态；12天后挑取成熟的分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。14～15天观察记录菌落的形态特征。
菌落初期呈白色棉絮状，后期有橄榄绿色的孢子层呈中心凸起状态。菌丝具有分枝和分隔，透明光滑，直径为1.6～2.1μm；分生孢子孢子梗单生或聚集或紧密排列，呈帚状分支，直径约为2.0μm，其末端产生瓶形小梗，相互缠绕交叉生长，大量聚集成分生孢子座；从瓶梗的末端以向基式连续形成串链的分生孢子，分生孢子单细胞，长椭圆形，大小4.8-6.7×2.2-3.6μm。
1.3菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子测定
将分离纯化的5种菌株分别制成孢子悬液，分别接种于PPDA平板表面的玻璃纸上，于25℃下培养3～4天后收获菌丝，参照Raeder&Broda(1985)的方法提取DNA，步骤如下：
称取1g鲜菌丝置于预冷研钵中，液氮研磨至粉末。加入4ml DNA提取液[0.2MTris·HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,10mM EDTA,1％SDS]，继续研磨后转移至离心管，冰浴3～5min。加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液，剧烈震荡3min，4℃下1840g离心10min。吸取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液，颠倒混匀后于4℃下1200g离心10min。吸取上清液，加入1/10体积3M NaAC缓冲液(pH 5.3)和2.5倍体积乙醇，混匀后在-20℃下沉淀1h。4℃下10000g离心10min，弃上清后再用0.5mL 75％乙醇洗涤沉淀，再4℃下9300g离心5min。自然干燥3～5min后，加入0.6mL无菌水溶解，再加入2μL RNAase，在37℃下保温15min。重复一轮酚/氯仿抽提，最后用0.2ml无菌水溶解DNA。
绿僵菌样品DNA-ITS区域PCR扩增：PCR扩增体系为25μl:其中上述提取的DNA 1.0μl；委托公司合成真菌TW81(5'-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3')和AB28(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')各1.0μl；2×Taq PCR MasterMix(含染料)12.5μl；ddH2O9.5μl。
PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后72℃延伸7min，用无菌水代替模板作为阴性对照。
PCR产物经过电泳条带检测后确认样品DNA-ITS区域PCR扩增产物符合测序要求后。将PCR扩增产物进行连接、转化之后，送到铂尚生物技术(上海)有限公司进行序列测定。将测定的结果与NCBI基因数据库的绿僵菌菌株序列进行比对。
该序列与NCBI基因数据库比对，符合预期长度，无预期序列相同的菌株。MaQLU1菌株DNA-ITS碱基序列为684bp,与NCBI数据库的6株金龟子绿僵菌的同源性达99.21％。因此，MaQLU1为金龟子绿僵菌菌株(Metarhizium anisopliae)。
金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)MaQLU1，已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，登记入册编号为：CGMCCNO.11766。
实施例2金龟子绿僵菌MaQLU1的生物学特性
2.1营养生长速率的测定
将金龟子绿僵菌MaQLU1采用十倍稀释法涂布于贴有玻璃纸PPDA平板培养基上，25～28℃和12:12(L:D)h条件下在培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落的直径，每处理设3个重复，共观察15天。
表1金龟子绿僵菌MaQLU1的生长速率测定
由表1可见，金龟子绿僵菌MaQLU1的菌落的生长比较快，9天后菌落的平均直径为36mm，15天菌落的直径达70mm。
2.2产孢量测定
将培养好的100μl分生孢子液涂布于PPDA上，在25℃和12:12(L:D)h条件下培养3d后，用打孔器从平板上截取直径5mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入2ml 0.02％吐温80中，滤去菌丝，用血球计数板计算测定孢子浓度，再换算为每cm2平板上的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定取其平均值,作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。
表2金龟子绿僵菌MaQLU1的生长量测定
由表2可见，金龟子绿僵菌MaQLU1的菌株第四天开始出现绿色分生孢子，产孢量为0.05×108个/cm2。
2.3致病力的测定
取5株菌株MaQLU1、MaQKS1、MaCPS1、MaCPK2、MaCPK3进行苹果蠹蛾致病力的测定，菌株均采自山东济南市、甘肃省敦煌市和河北邯郸市，由分离纯化获得，经鉴定均为金龟子绿僵菌。用含有0.1％的吐温-80的无菌水将原液配制成1×108个/ml的孢子悬浮液，每组设3个重复区，每区30头，每只浸蘸10s，每天观察记录幼虫的死亡情况,连续观察20天。
表3不同菌株对苹果蠹蛾的致病力的测定
由表3可知，本发明的菌株MaQLU1对苹果蠹蛾的致病力最强，使其幼虫的致病率达到96.8％，略高于其他供试菌株MaQKS1。
实施例3金龟子绿僵菌MaQLU1对苹果蠹蛾的防治效果
3.1孢悬液的制备
将单孢分离纯化的金龟子绿僵菌菌种置于PPDA培养基培养12-15天，让其长出大量的分生孢子，用灭菌的不锈钢钥匙将培养好的分生孢子刮入一个灭过菌的盛有0.1％的吐温-80无菌水的100ml的离心管中，在快速振荡器上充分震荡混匀，用规格为(25格×16格)血球计数板计数孢子悬浮液(该悬浮液即为金龟子绿僵菌MaQLU1菌剂)中的孢子的个数，并按照公式计算分生孢子的浓度，进而将原液按照一定的比例进行稀释配制成浓度为1×108个/ml，备用。
3.2试虫接种
本次试验的致病性的测定是利用浸蘸法，根据以上配制成的1×108个/ml的孢子悬浮液对1龄健康的苹果蠹蛾进行浸蘸，浸蘸时间为10s，置于无菌的滤纸上，任其爬行晾干身体上的水分，然后放入无菌的塑料饭盒中，并以新鲜的苹果为食物。每个浓度梯度3次重复，每重复20头试虫，以0.1％的吐温-80作为对照。处理后每天观测1次，记录试虫的死亡数。死虫保湿培养观察菌丝生长及产孢情况(虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子)，并挑片在显微镜下观察是否为绿僵菌感染致死，统计死亡率以及感染率。
采用108个/ml的孢子悬浮液接种苹果蠹蛾10天后，苹果蠹蛾的死亡率达到94％以上，死亡高峰期在5-7天。实验组2天后就出现死虫，经保湿培养后发现，感染率为94％以上；对照组未出现感染的现象。统计培养期间处理组和对照组死虫的累计数量，经DPS统计分析得到LT50(半致死时间)。结果表明，金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)MaQLU1菌株对一龄苹果蠹蛾的LT50为5.3d，显著优于其他实验菌株的防治效果。

Claims (3)

1.一株金龟子绿僵菌，其特征在于：所述菌株为金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)MaQLU1，已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：CGMCC NO.11766。
2.权利要求1所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)在制备作为微生物杀虫剂防治害虫方面的应用。
3.权利要求1所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)在制备作为微生物杀虫剂防治苹果蠹蛾方面的应用。
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