CN105039184B - 一种对波纹杂毛虫幼虫具有致病力的白僵菌菌株及其应用 - Google Patents
一种对波纹杂毛虫幼虫具有致病力的白僵菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种对波纹杂毛虫幼虫具有致病力的白僵菌菌株及其应用。本发明所提供的白僵菌菌株命名为球孢白僵菌FJBb201202，已于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10641。该菌株生长速度快、产孢能力强、生产性能好，同时对波纹杂毛虫幼虫的致病力高，以107孢子/mL的孢子悬浮液接种后波纹杂毛虫3龄幼虫15天后，幼虫死亡率达100%，LT50（致死中时）为5.83天。利用该菌株生产的真菌制剂，对波纹杂毛虫的防治效果好，能有效降低波纹杂毛虫林间虫口密度，是一株在波纹杂毛虫的防治上具有应用价值的生防菌株，对减轻波纹杂毛虫危害具有积极的意义。
Description
技术领域
本发明属于害虫生物防治领域，涉及一种白僵菌菌株及其应用，具体地说是涉及一株对波纹杂毛虫幼虫具有致病力的球孢白僵菌及其应用。
背景技术
波纹杂毛虫Cyclophragma undans (Walker)，属鳞翅目、枯叶蛾科、杂毛虫属，是多种针阔叶林木、果数的重要食叶害虫，其寄主范围较广，除主要危害马尾松外，还危害包括杉木、油茶、山苍子、板栗、杨梅等在内的数十种针阔叶树，在局部地区爆发成灾，大发生时可将寄主植物的叶片（针叶）取食殆尽，被害的林分似火烧，造成极大的经济损失。
目前生产上波纹杂毛虫的防治主要是采用化学防治的手段，但长期使用化学药剂会大量杀死害虫天敌和林中有益生物，也会使害虫产生抗药性，同时带来环境污染等问题。寻求高效、环保、无公害的生物防治途径是目前生产上的迫切需求。
白僵菌是一种应用最为广泛的虫生真菌，其具有致病力强、能在林间形成流行病、不污染环境、易于规模化生产等优点，使得白僵菌在农林害虫的防治中得到了大量应用，是林业害虫防治中使用量最大的微生物杀虫剂。白僵菌存在一定的寄主专化性，有研究证明不同地理、寄主来源的菌株对靶标害虫的致病力差异十分显著，不同菌株对靶标害虫的致死中时（LT50）可相差数倍，甚至数十倍，因此，针对不同害虫筛选出致病力强的菌株是利用白僵菌生物防治害虫的基础而又十分必要的工作。因此，本发明提供了一株对波纹杂毛虫具有高致病力的白僵菌菌株，并进行了林间应用。
发明内容
本发明的目的是提供一株对波纹杂毛虫幼虫具有致病力的白僵菌菌株及其应用。
一株白僵菌，命名为球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）FJBb201202，已于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC No.10641。
球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202具有以下特征：
该菌株从福建省光泽县司前乡黄坊村油茶林中采集的波纹杂毛虫幼虫僵虫体上分离得到，在PPDA培养基上25±1℃下生长5天，菌落直径17mm，15天达60mm。菌落白色至乳白色，初为疏茸状或棉絮状，后期形成乳粉状的孢子层，孢子层厚且均匀，中心凸起。菌丝分枝，有格，无色光滑，有时成簇生长；产孢细胞（瓶梗）浓密簇生于短而膨大的柄细胞上，瓶形，产孢细胞上部“之”字形，顶端变细长。分生孢子为近球形，单细胞，透明，光滑，1.8-2.8×2-2.7μm。最佳生长温度为24~28℃。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供用于防治波纹杂毛虫幼虫的菌剂。
本发明所提供的菌剂具体为孢子悬浮液或粉剂。其中孢子悬浮液的浓度为107孢子/ml，粉剂孢子含量为120~180×108孢子/g菌剂。
本发明所提供的菌剂的有效成分是上述球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）FJBb201202的分生孢子。
本发明所提供的菌剂中的分生孢子来源于以上述球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）FJBb201202菌株为菌种经固体发酵培养得到。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202菌株经液体发酵后接种于以麦麸和谷壳组成的固体培养基上固体发酵8~10天后，发酵产物产孢量为120~180×108孢子/克粉剂。
本发明所提供的或所述的菌剂可用于防治波纹杂毛虫幼虫。
本发明提供的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202具有如下有益效果：
生产形状好，产孢能力强，同时对波纹杂毛虫幼虫的致病力强，采用浓度为107孢子/ml的孢子悬浮液浸渍法接种致死中时（LT50）为5.83天，感染率为90.0%。使用该菌株为菌种，经液体发酵后，接种于以麦麸和谷壳组成的固体培养基上固体发酵8~10天，产孢量可达120~180×108孢子/g粉剂。使用固体发酵产物配制成107孢子/ml孢子悬浮液林间喷雾后15天防治效果可达90%以上。使用固体发酵产物（粉剂）制成的粉炮林间防治15天后，防治效果可达85%以上。使用该菌株的菌剂防治能显著降低波纹杂毛虫幼虫林间种群数量。同时该菌株能在林间中长期宿存，具有较强的二次侵染能力，适合在波纹杂毛虫发生林分中应用。
菌种名称：球孢白僵菌
拉丁学名：Beauveria bassiana (Bals.) Vuill
菌株编号：FJBb201202
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年3月19日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10641。
附图说明
图1 为波纹杂毛虫幼虫及其被球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）FJBb201202感染状。
图2 为FJBb201202菌株在PPDA培养基上25±1℃下培养15天的菌落形态图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中的PPDA培养基是指蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基的英文缩写，其具体配方为每1000ml水中含有马铃薯200g（切块煮熟后过滤，取滤液），葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂20g。
实施例1
球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202的鉴定
形态学鉴定
将分离纯化的白僵菌菌株在直径为90mm的平板PPDA培养基上于25±1℃条件下培养，4-5天后挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10-12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特征。该菌株菌落白色至乳白色，初为疏茸状或棉絮状，后期形成乳粉状的孢子层，孢子层厚且均匀，中心凸起。菌丝分枝，有格，无色光滑，有时成簇生长；产孢细胞（瓶梗）浓密簇生于短而膨大的柄细胞上，瓶形，产孢细胞上部“之”字形，顶端变细长。分生孢子为近球形，单细胞，透明，光滑，1.8-2.8×2-2.7μm。
球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202已于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），登记入册编号为CGMCCNo.10641。
实施例2
球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202的生物学特性
用点滴法将球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株FJBb201202接种于PPDA平板培养基中央，置于25±1℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个重复，共观察15天。同时记录开始产孢时间，第15天（产孢基本结束）用直径为1.5cm的打孔器，于菌落中心至边缘1/2处打取小菌碟，取出菌碟置于含30 mL的0.3‰吐温-80无菌水的锥形瓶内，振荡使孢子充分分散并适当稀释，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定，取其平均值作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。同时测定白僵菌BbMaA-01菌株作为对照，白僵菌BbMaA-01菌株（球孢白僵菌和金龟子绿僵菌不同菌株对黑足角胸叶甲成虫的致病力评价. 昆虫学报，2011年第11期.）为福建省林科院森保所保存菌株，为公知菌株。
表1 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株FJBb201202生物学特性
由表1可见，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株FJBb201202菌落生长较快，5天菌落直径为17mm，15天菌落直径达60mm，生长3天后菌落上开始出现白色孢子，产孢量为1.86×108孢子/cm2。而作为对照的球孢白僵菌BbMaA-01菌株，生长速度较FJBb201202菌株慢，且产孢量也低，只有球孢白僵菌FJBb201202菌株产孢量的59%。
实施例3
球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202对波纹杂毛虫幼虫的致病力测定
从PPDA平板上刮取一定量球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202孢子置于灭菌的0.3‰ 吐温-80溶液中，配制成107孢子/mL的孢子悬浮液（该悬浮液即为球孢白僵菌FJBb201202菌剂）；将健康的3龄波纹杂毛虫幼虫在孢悬液中浸渍10s，然后重新放入养虫盒内，以新鲜松针喂食，接种30头波纹杂毛虫幼虫，重复3次；以浸渍0.3‰吐温-80无菌水溶液处理作为对照。处理后将养虫盒放置于黑暗的25±1℃恒温培养箱中，每天观察记载波纹杂毛虫幼虫死亡情况，死虫保湿培养观察菌丝生长及产孢情况（虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子），并挑片在显微镜下观察是否为白僵菌感染致死，统计死亡率及感染率（僵虫率）。
表2 波纹杂毛虫幼虫接种白僵菌不同菌株后累计死亡率
表3白僵菌对波纹杂毛虫幼虫致病力
采用107孢子/mL的球孢白僵菌FJBb201202菌株的孢子悬浮液接种波纹杂毛虫幼虫15天后，幼虫死亡率达100%，死亡高峰在4~8天。接种球孢白僵菌BbMaA-01的波纹杂毛虫幼虫15天的死亡率为75%，空白对照组15天后死亡率为5%。死亡的幼虫经保湿培养后发现，接种FJBb201202感染率为90%，接种BbMaA-01菌株的感染率为50%，空白对照组未出现感染。经计算，孢子悬浮液浸渍法接种后，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202菌株对波纹杂毛虫幼虫的致病力回归方程为y=0.7262+55804x，致死中时（LT50）为5.83天。球孢白僵菌BbMaA-01菌株对波纹杂毛虫幼虫的致病力回归方程为Y=-0.0441+5.143x，致死中时（LT50）为9.57天。
实施例4
白僵菌FJBb201202菌株的生产特性
1 液体菌种的培养，包括如下步骤：
1.1 菌种：球孢白僵菌FJBb201202菌株。
1.2 斜面菌种：预先将白僵菌菌种用试管斜面培养基在25℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PPDA培养基）。
1.3 液体培养基：配制马铃薯葡萄糖液体培养基（在PPDA培养基的基础上去除琼脂成分即可）2L，用500ml三角瓶中装入，每个装200ml培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。
1.4 接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。
1.5 摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成粘稠菌丝体后即可接入固体培养基，进行白僵菌固体培养。
2 固体培养，包括如下步骤：
2.1 固体培养基配方及制备：
白僵菌固体培养基配方：按体积比麦麸：谷壳=1:1的比例进行配制，混合均匀后，按每500g培养基加入400ml水进行混匀。
制备方法：将固体培养基的各组分分别称量，加入水后搅拌均匀，装入聚乙烯袋中，放入高压灭菌锅中，121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。
2.2 接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内进行，按15%的接种量，将液体菌种倒入固体培养基中，搅拌均匀，装入预先进行过表面消毒的、可堆叠的PP塑料发酵箱（底部有孔）中（培养基厚度5cm），随即转入发酵室培养。
2.3 固体培养：将6个上述装有接种后固体培养基的塑料发酵箱堆叠放入22±1℃的发酵室中培养，4天后待固体培养基长满菌丝即可。第5天将发酵箱十字交叉堆叠，室内开放式培养，保持培养室内温度在25±2℃，湿度80%左右，继续培养，4天后，待固体料内外长满白色或浅黄白色孢子即可，将发酵产物置于阴凉通风处晾干即成粗粉剂。
3 培养结果：发酵周期为8天，自然干燥后随机称取粗粉剂5g，用0.03%吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，结果发酵产物粉剂含孢量在120~180×1010孢子/克之间。
实施例5
球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202菌液对波纹杂毛虫幼虫防治效果
球孢白僵菌FJBb201202菌株作为生产菌株生产菌剂。生产方法为液固双相发酵培养，同实施例4。生产由福建省林科院森保所中试实验室完成。经测定，白僵菌菌粉含孢量为180亿/g，白僵菌孢子萌发率超过95%。
菌液配制：将上述菌粉置于0.05%的吐温-80溶液中，稀释至107孢子/ml的浓度，然后用双层纱布过滤，即配制成孢子悬浮液。
林间防治及效果检查：在波纹杂毛虫发生严重的6-7年生马尾松林分中，防治前调查每株的平均虫口数，防治虫龄为2~3龄波纹杂毛虫幼虫，将上述配制好的孢子悬浮液直接用背负式喷雾机在林间进行喷雾，面积2hm2，每0.067 hm2喷菌液200kg，林中按5点式设调查点标准株（每点选紧邻的3株树），详细调查各标准株的虫口数。并在点清虫口的标准枝上套笼。另设3块标准地作为对照，对照用清水进行喷雾。防治15天后检查幼虫死亡情况，死亡的幼虫带回实验室内进行保湿培养，观察虫体上是否有白色菌丝及孢子长出，以判断是否由白僵菌感染致死。统计幼虫死亡率、感染率，计算防治效果。
表4球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202菌液对波纹杂毛虫幼虫防治效果
使用球孢白僵菌FJBb201202菌株107孢子/mL孢子悬浮液（菌液）林间喷雾后15天，波纹杂毛虫幼虫平均校正死亡率可达90%以上，感染率可达80%以上，防治效果十分显著，降低了林间虫口密度。
实施例6
球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202粉炮对波纹杂毛虫林间防治效果
球孢白僵菌FJBb201202菌株作为生产菌株生产菌剂。生产方法为液固双相发酵培养，同实施例4。生产由福建省林科院森保所中试实验室完成。经测定，白僵菌菌粉含孢量为180亿/g，白僵菌孢子萌发率超过95%。
粉炮制作：用牛皮纸制成纸杯状容器，向其中装入125g白僵菌粉剂，并塞入一个鞭炮，将鞭炮的引火线穿过封口纸露在外面，然后封口，即制成白僵菌粉炮。
林间防治及效果检查：在波纹杂毛虫发生严重的马尾松林分中，防治前调查每株的平均虫口数，防治虫龄为2~3龄波纹杂毛虫幼虫，将上述配制好的粉炮，点燃鞭炮引火线后适时将粉炮抛向空中，使粉炮在林冠层中爆炸，利用鞭炮的爆炸力使孢子迅速扩散。每0.067 hm2使用4个粉炮，林中设5个标准样点。详细调查各标准样点样株虫口数。并在点清虫口的标准枝上套笼。另设3块标准地作为对照，对照用不用粉炮处理。防治15天后检查幼虫死亡情况，死亡的幼虫带回实验室内进行保湿培养，观察虫体上是否有白色菌丝及孢子长出，以判断是否由白僵菌感染致死。统计幼虫死亡率、感染率，计算防治效果。
表4球孢白僵菌FJBb201202菌株粉炮林间防治波纹杂毛虫的效果
使用球孢白僵菌FJBb201202菌株粉炮林间放菌后15天，波纹杂毛虫幼虫平均校正死亡率可达88%以上，感染率可达70%以上，防治效果十分显著，降低了林间虫口密度。
实施例3、5、6结果表明，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202菌株对波纹杂毛虫幼虫具有较强的致病力，感染效果好，无论使用菌液或是粉炮，均可以有效降低林间波纹杂毛虫种群数量，减轻波纹杂毛虫带来的危害，是一株在波纹杂毛虫的防治上具有应用价值的生防菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要说明的是，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种对波纹杂毛虫幼虫具有致病力的白僵菌菌株，其特征在于：所述菌株为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202，该菌株已于2015年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10641。
2.一种真菌杀虫剂，其特征在于：所述的真菌杀虫剂含有权利要求1所述的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202菌株的分生孢子。
3.根据权利要求2所述的真菌杀虫剂，其特征在于：其剂型为分生孢子悬浮液或粉剂。
4.根据权利要求3所述的真菌杀虫剂，其特征在于：其孢子悬浮液有效成分为球孢白僵菌FJBb201202菌株的分生孢子，浓度为1×107孢子/mL。
5.根据权利要求3所述的真菌杀虫剂，其特征在于：粉剂的有效成分为球孢白僵菌FJBb201202菌株的分生孢子，孢子含量为（120~180）×108孢子/g菌剂。
6.根据权利要求3所述的真菌杀虫剂，其特征在于：所述的白僵菌分生孢子，是由以球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202菌株为菌种经固体发酵得到，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201202菌株经液体发酵后接种于以麦麸和谷壳组成的固体培养基上固体发酵8~10天后，发酵产物产孢量为（120~180）×108孢子/克粉剂。
7.如权利要求1所述的白僵菌菌株在防治波纹杂毛虫幼虫中的应用。
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