CN107926986A - 一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂及其制备方法和应用，本发明的一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，包括有效活性成分，所述活性成分为松毛虫质型多角体病毒悬液和球孢白僵菌粉，所述活性成分占总制剂的质量百分比含量的2％‑30％。本发明安全无毒，具有高效、广谱的特点，对人畜无害，不伤害天敌。

Description

一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及生物农药加工技术领域，具体涉及一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂及其制备方法和应用。
背景技术
马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus Walker)，鳞翅目(Lepidoptera)，枯叶蛾科(Lasiocampidae)，松毛虫属(Tolype)昆虫，是马尾松的主要害虫，发生频繁、危害严重，常猖獗成灾，严重制约了马尾松的生长。一些地方长期以来所形成的固有观念，把马尾松毛虫的防治工作仅是作为“救灾”工作，只重治标，轻治本。治标也都是追求速效，不分虫情轻重和危害严重程度，不计防治成本，盲目大量使用高浓度大剂量广谱性的化学农药进行大面积的飞机和人工地面防治，容易造成污染环境，大量杀伤害虫天敌，破坏了生态平衡，使得害虫发生周期间隔缩短，造成恶性循环。
马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus Cypovirus--DpCPV)为我国重大森林害虫―松毛虫的致病原，对松毛虫有良好的控制效果。1989年，Belloncik S研究发现CPV感染昆虫中肠上皮细胞，其突出特点是对环境无毒无害，持续感染效果非常好，容易造成害虫流行病。赵同海等人(2004)研究发现DpCPV宿主范围较广，可以使10科36种鳞翅目昆虫感染发病。防治原理：在林内释放松毛虫质型多角体病毒，通过松毛虫的取食，造成松毛虫大面积的流行病，最终导致大量死亡。一般当代感染率在70％以上，因而大大的降低虫口密度，促进生态的良性循环。此外，该病毒还具有水平和垂直传播的效果，不污染环境，不杀伤天敌，能够起到持续防控的作用，这不但大大降低防治成本，而且增加了木材的收益，同时减少化学农药的使用量，改善松林的生态环境。
昆虫病毒是一种良好的生物杀虫剂，是生物防治的重要手段之一。昆虫病毒杀虫剂具有特异性强、致病力高、稳定性好、安全和不污染环境，用后能引起害虫群体病毒性疾病流行传播，可自然控制害虫消长，并导致相继世代流行病的死亡。但是昆虫病毒杀虫剂仍存在诸多问题，解决病毒增殖技术和降低生产成本是病毒商品化生产的关键问题之一。
球孢白僵菌(Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin)是一种昆虫病原真菌，作为活体生物农药，在寄主虫体内大量繁殖，使体液机能发生变化，新陈代谢紊乱以致死亡。由于白僵菌无毒、无味、无污染，已广泛用于农林害虫防治中。白僵菌可以用来防治松毛虫、蛴螬、家蝇、茶小绿叶蝉、介壳虫、白粉虱、蚜虫、蓟马、马铃薯叶甲、玉米螟、天牛、金龟子等40多种农林害虫。但是不同地理种群或不同株系的球孢白僵菌对害虫的毒力存在较大的差异，即使同一株系的球孢白僵菌对不同种类害虫的毒理也不相同，因此在真菌的生物防治中针对不同种类的害虫经常要筛选高毒力菌株；另外，白僵菌防治效果受环境湿度较大，在相对湿度较低时，防治效果并不理想，且杀虫速度相对较慢，影响了其在农林害虫防治上的积极性。
目前，缺乏一种安全无毒的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全无毒的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种松毛虫质型多角体病毒的毒株，该毒株为马尾松毛虫质型多角体病毒；保藏名称为马尾松毛虫质型多角体病毒DpCPV-JL Dendrol imus punctatus cytoplasmic polyhedrosis viruses-DpCPV-JL，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2016年4月1日；保藏编号：CCTCC No.V201607。
本发明的一种球孢白僵菌菌株，该菌株为球孢白僵菌；保藏名称为球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年08月13日；保藏编号：CGMCCNo.7998。
本发明的一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，包括有效活性成分松毛虫质型多角体病毒悬液和球孢白僵菌粉，所述活性成分占总制剂的质量百分比含量的2％-30％。
进一步地，所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂包括按照重量百分比的如下组分组成：
进一步地，所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂包括按照重量百分比的如下组分组成：
本发明所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)准确称取所述的质量百分比的各组分，依次加入100万-200亿PIB/mL的松毛虫质型多角体病毒悬液、球孢白僵菌、纳米级二氧化硅、芳香族氨基酸、精制荧光增白剂、木质素磺酸钠、氟啶脲、甘油和无菌水，
(2)再搅拌均匀分装，制得乳白色的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂。
进一步地，制备松毛虫质型多角体病毒悬液的方法：
病毒粗品经两次差速离心，低速800rpm，离心5min，取上清；然后将上清高速：4000rpm，离心30min，取沉淀，去掉杂质，再经过一次蔗糖梯度离心纯化，经计数后置于4℃冰箱备用；
以棉铃虫或甜菜夜蛾作为替代宿主增殖该松毛虫质型多角体病毒，采用通用型人工饲料饲养宿主，将1×106PIB/ml的病毒悬液均匀喷在养虫盒内的人工饲料上，感染4龄幼虫，从感染后的第4天至第10天收集患病死虫，然后松毛虫质型多角体病毒的分离、收集：将患病死虫匀浆捣碎，离心后过200目纱布去渣，计数后备用，制得松毛虫质型多角体病毒悬液；
所述通用型人工饲料配方包括按照重量百分比的如下组分组成：
进一步地，甜菜夜蛾或棉铃虫的饲养：
甜菜夜蛾的饲养：
将配制的人工饲料分装于经消毒的孵化盒中，将经人工饲料继代同步化的甜菜夜蛾适量卵块条(300粒)粘于养虫盒盖背面上；将孵化盒放入24-28℃、相对湿度为70-80％湿度，光照L:D的值为12:12hr的养虫室，待幼虫孵化直至化蛹；收取健康蛹，在5-10％甲醛液中消毒、漂洗、晾干后放入养虫笼内，保持80％湿度。成虫羽化后，将5W白炽灯放在产卵笼的一端，引诱雌蛾产卵于白纸上。每天定时更换产卵纸，卵纸经5-10％甲醛消毒、漂洗、晾干，再根据卵纸上卵粒的密度，将卵纸剪成小片放入养虫盒中，进入下一次生活周期再循环；
棉铃虫的饲养：
面铃虫幼虫有自相残杀的生活习性，幼虫需要单头饲养，除此之外，其他饲养条件与甜菜夜蛾的饲养相同。
更进一步地，制备白僵菌球孢粉的方法：
在无菌条件下接入灭菌常用的产孢培养基固体平板进行活化处理；刮取活化好的菌种制成悬液，加入液体产孢培养基YPDC进行扩大菌种培养；48小时后，将其接于发酵罐内灭菌后的液体培养基中进行液体发酵；培养24h后，接于待料灭菌后的固体培养料中，混合均匀后，进行固体发酵，固体培养物产孢好后进干燥房进行烘干处理，待固体培养物彻底干燥后，在密闭的抽提机上进行球孢粉的提取，制得白僵菌球孢粉；所述产孢培养基由酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、玉米粉和琼脂组成。
本发明所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂在生物杀虫剂中的应用。
有益效果：本发明安全无毒，具有高效、广谱的特点，对人畜无害，不伤害天敌。
与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)松毛虫质型多角体病毒和球孢白僵菌杀虫悬浮剂是一种新型的生物农药，由专一性的病毒、广谱性的白僵菌和化学助剂筛选研究复配而成，显示出病毒与白僵菌协同作用防治松毛虫的优势，克服了单纯用病毒潜伏期长和单独用球孢白僵菌防效期短的缺点，可广泛应用于森林、蔬菜、棉花、茶叶、果树等害虫的防治。
(2)增加剂型中的光保护剂,剂型组分更完善。本发明提供的松毛虫质型多角体病毒和球孢白僵菌杀虫悬浮剂，同时添加微量无机纳米材料、芳香族氨基酸和少量精制荧光增白剂，使昆虫病毒杀虫剂的组分更完善，悬浮性更好，货架寿命更长，田间应用是对紫外光有较好的防护作用，病毒持续作用时间延长，防治效果提高。
(3)质型多角体病毒和球孢白僵菌杀虫悬浮剂，对人畜、家禽、鱼类、植物无毒无害，不伤害天敌，有利于维护森林的生态平衡，对环境无不良影响，是一种安全无毒，不使害虫产生抗药性的高效生物农药。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1
本发明的一种松毛虫质型多角体病毒的毒株，该毒株为马尾松毛虫质型多角体病毒；保藏名称为马尾松毛虫质型多角体病毒DpCPV-JL Dendrol imus punctatuscytoplasmic polyhedrosis viruses-DpCPV-JL，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2016年4月1日；保藏编号：CCTCCNo.V201607。
本发明的一种球孢白僵菌菌株，该菌株为球孢白僵菌；保藏名称为球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年08月13日；保藏编号：CGMCCNo.7998。
本发明的一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，包括有效活性成分松毛虫质型多角体病毒悬液和球孢白僵菌粉，所述活性成分占总制剂的质量百分比含量的2％。
所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂包括按照重量百分比的如下组分组成：
本发明所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂的制备方法，包括如下步骤：
准确称取所述的质量百分比的各组分，依次加入100万-200亿PIB/mL的松毛虫质型多角体病毒悬液、球孢白僵菌、纳米级二氧化硅、芳香族氨基酸、精制荧光增白剂、木质素磺酸钠、氟啶脲、甘油和无菌水，再搅拌均匀分装，制得乳白色的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂。
制备松毛虫质型多角体病毒悬液的方法：
病毒粗品经两次差速离心，低速800rpm，离心5min，取上清；然后将上清高速：4000rpm，离心30min，取沉淀，去掉杂质，再经过一次蔗糖梯度离心纯化，经计数后置于4℃冰箱备用；
以棉铃虫作为替代宿主增殖该松毛虫质型多角体病毒，采用通用型人工饲料饲养宿主，将1×106PIB/ml的病毒悬液均匀喷在养虫盒内的人工饲料上，感染4龄幼虫，从感染后的第4天至第10天收集患病死虫，然后松毛虫质型多角体病毒的分离、收集：将患病死虫匀浆捣碎，离心后过200目纱布去渣，计数后备用，制得松毛虫质型多角体病毒悬液；
所述通用型人工饲料配方包括按照重量百分比的如下组分组成：
棉铃虫的饲养：
面铃虫幼虫有自相残杀的生活习性，幼虫需要单头饲养，除此之外，其他饲养条件与甜菜夜蛾的饲养相同。
制备白僵菌球孢粉的方法：
在无菌条件下接入灭菌常用的产孢培养基固体平板进行活化处理；刮取活化好的菌种制成悬液，加入液体产孢培养基YPDC进行扩大菌种培养；48小时后，将其接于发酵罐内灭菌后的液体培养基中进行液体发酵；培养24h后，接于待料灭菌后的固体培养料中，混合均匀后，进行固体发酵，固体培养物产孢好后进干燥房进行烘干处理，待固体培养物彻底干燥后，在密闭的抽提机上进行球孢粉的提取，制得白僵菌球孢粉；所述产孢培养基由酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、玉米粉和琼脂组成。
本发明所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂在生物杀虫剂中的应用。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：
本发明的一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，包括有效活性成分松毛虫质型多角体病毒悬液和球孢白僵菌粉，所述活性成分占总制剂的质量百分比含量的30％。
所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂包括按照重量百分比的如下组分组成：
本发明所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂的制备方法，包括如下步骤：
以甜菜夜蛾作为替代宿主增殖该松毛虫质型多角体病毒，采用通用型人工饲料饲养宿主，将1×106PIB/ml的病毒悬液均匀喷在养虫盒内的人工饲料上，感染4龄幼虫，从感染后的第4天至第10天收集患病死虫，然后松毛虫质型多角体病毒的分离、收集：将患病死虫匀浆捣碎，离心后过200目纱布去渣，计数后备用，制得松毛虫质型多角体病毒悬液；
甜菜夜蛾的饲养：
将配制的人工饲料分装于经消毒的孵化盒中，将经人工饲料继代同步化的甜菜夜蛾适量卵块条(300粒)粘于养虫盒盖背面上；将孵化盒放入24-28℃、相对湿度为70-80％湿度、光照L:D＝12:12hr的养虫室，待幼虫孵化直至化蛹；收取健康蛹，在5-10％甲醛液中消毒、漂洗、晾干后放入养虫笼内，保持80％湿度。成虫羽化后，将5W白炽灯放在产卵笼的一端，引诱雌蛾产卵于白纸上。每天定时更换产卵纸，卵纸经5-10％甲醛消毒、漂洗、晾干，再根据卵纸上卵粒的密度，将卵纸剪成小片放入养虫盒中，进入下一次生活周期再循环。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：
本发明的一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，包括有效活性成分松毛虫质型多角体病毒悬液和球孢白僵菌粉，所述活性成分占总制剂的质量百分比含量的20％。
所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂包括按照重量百分比的如下组分组成：
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于：本发明的一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，包括有效活性成分松毛虫质型多角体病毒悬液和球孢白僵菌粉，所述活性成分占总制剂的质量百分比含量的20％。
所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂包括按照重量百分比的如下组分组成：
甜菜夜蛾的饲养：
将配制的人工饲料分装于经消毒的孵化盒中，将经人工饲料继代同步化的甜菜夜蛾适量卵块条(300粒)粘于养虫盒盖背面上；将孵化盒放入24-28℃、相对湿度为70-80％湿度、光照L:D＝12:12hr的养虫室，待幼虫孵化直至化蛹；收取健康蛹，在5-10％甲醛液中消毒、漂洗、晾干后放入养虫笼内，保持80％湿度。成虫羽化后，将5W白炽灯放在产卵笼的一端，引诱雌蛾产卵于白纸上。每天定时更换产卵纸，卵纸经5-10％甲醛消毒、漂洗、晾干，再根据卵纸上卵粒的密度，将卵纸剪成小片放入养虫盒中，进入下一次生活周期再循环；
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于：
本发明所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，包括按照重量百分比的如下组分组成：
所述通用型人工饲料配方包括按照重量百分比的如下组分组成：
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于：
本发明所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，包括按照重量百分比的如下组分组成：
所述通用型人工饲料配方包括按照重量百分比的如下组分组成：
试验1
采用上述4个实施例松毛虫质型多角体和白僵菌的杀虫剂配方对松毛虫幼虫的杀虫效果如表1所示：
表1
注：如表1所示，表1中的防效(％)为各重复平均值；CPV(20％)剂型：实例Ⅳ中去除球孢白僵菌，其他成分不变；白僵菌(40％)：实例Ⅳ中去除松毛虫质型多角体病毒悬液，其他成分不变。
对施药后3天、7天、15天、30天的防效，运用SPSS软件采用方差分析法进行差异显著性检验。
药剂评价：
(1)松毛虫质型多角体病毒和球孢白僵菌处理与CK相比均具有明显的防治效果；
(2)松毛虫质型多角体病毒和球孢白僵菌复配剂，要比质型多角体病毒或者球孢白僵菌单独使用效果要好；
(3)松毛虫质型多角体病毒与球孢白僵菌复配的不同剂量之间在致死率上有一定差异，在是施药30天后，剂型2和剂型3的死亡率差异不显著，死亡率均达97％以上，从杀虫速度和节约成本的综合考量，我们认为选择剂量3作为杀虫最佳剂量。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种松毛虫质型多角体病毒的毒株，其特征在于：该毒株为马尾松毛虫质型多角体病毒；保藏名称为马尾松毛虫质型多角体病毒DpCPV-JL Dendrol imus punctatuscytoplasmic polyhedrosis viruses-DpCPV-JL，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2016年4月1日；保藏编号：CCTCCNo.V201607。
2.一种球孢白僵菌菌株，其特征在于：该菌株为球孢白僵菌；保藏名称为球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年08月13日；保藏编号：CGMCCNo.7998。
3.一种松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，其特征在于包括有效活性成分，所述活性成分为松毛虫质型多角体病毒悬液和球孢白僵菌粉，所述活性成分占总制剂的质量百分比含量的2％-30％。
4.根据权利要求3所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，其特征在于包括按照重量百分比的如下组分组成：
5.根据权利要求4所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂，其特征在于包括按照重量百分比的如下组分组成：
6.权利要求4所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
准确称取权利要求1所述的质量百分比的各组分，依次加入100万-200亿PIB/mL的松毛虫质型多角体病毒悬液、球孢白僵菌、纳米级二氧化硅、芳香族氨基酸、精制荧光增白剂、木质素磺酸钠、氟啶脲、甘油和无菌水，再搅拌均匀分装，制得乳白色的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂。
7.根据权利要求6所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂的制备方法，其特征在于：制备松毛虫质型多角体病毒悬液的方法：
病毒粗品经两次差速离心，低速800rpm，离心5min，取上清；然后将上清高速：4000rpm，离心30min，取沉淀，去掉杂质，再经过一次蔗糖梯度离心纯化，经计数后置于4℃冰箱备用；
以棉铃虫或甜菜夜蛾作为替代宿主增殖该松毛虫质型多角体病毒，采用通用型人工饲料饲养宿主，将1×106PIB/ml的病毒悬液均匀喷在养虫盒内的人工饲料上，感染4龄幼虫，从感染后的第4天至第10天收集患病死虫，然后松毛虫质型多角体病毒的分离、收集：将患病死虫匀浆捣碎，离心后过200目纱布去渣，计数后备用，制得松毛虫质型多角体病毒悬液；
所述通用型人工饲料配方包括按照重量百分比的如下组分组成：
8.根据权利要求7所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂的制备方法，其特征在于：甜菜夜蛾或棉铃虫的饲养：
甜菜夜蛾的饲养：
将配制的人工饲料分装于经消毒的孵化盒中，将经人工饲料继代同步化的甜菜夜蛾适量卵块条粘于养虫盒盖背面上；将孵化盒放入24-28℃、相对湿度为70-80％湿度、光照L:D的值为12:12hr的养虫室，待幼虫孵化直至化蛹；收取健康蛹，在5-10％甲醛液中消毒、漂洗、晾干后放入养虫笼内，保持80％湿度。成虫羽化后，将5W白炽灯放在产卵笼的一端，引诱雌蛾产卵于白纸上。每天定时更换产卵纸，卵纸经5-10％甲醛消毒、漂洗、晾干，再根据卵纸上卵粒的密度，将卵纸剪成小片放入养虫盒中，进入下一次生活周期再循环；
棉铃虫的饲养：
面铃虫幼虫有自相残杀的生活习性，幼虫需要单头饲养，除此之外，其他饲养条件与甜菜夜蛾的饲养相同。
9.根据权利要求8所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂的制备方法，其特征在于：制备白僵菌球孢粉的方法：
在无菌条件下接入灭菌常用的产孢培养基固体平板进行活化处理；刮取活化好的菌种制成悬液，加入液体产孢培养基YPDC进行扩大菌种培养；48小时后，将其接于发酵罐内灭菌后的液体培养基中进行液体发酵；培养24h后，接于待料灭菌后的固体培养料中，混合均匀后，进行固体发酵，固体培养物产孢好后进干燥房进行烘干处理，待固体培养物彻底干燥后，在密闭的抽提机上进行球孢粉的提取，制得白僵菌球孢粉；所述产孢培养基由酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、玉米粉和琼脂组成。
10.权利要求3至9任一项所述的松毛虫质型多角体病毒和白僵菌杀虫悬浮剂在生物杀虫剂中的应用。
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