CN102978170B - 舞毒蛾核型多角体病毒的生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种舞毒蛾病毒的生产方法，其中对舞毒蛾病毒复制最佳幼虫龄期、接毒浓度、接毒时间等进行了改进。通过这些改进完善了舞毒蛾核型多角体病毒工厂化生产流程与方法，扩大了舞毒蛾病毒产量，降低了生产成本，为野外大面积推广应用舞毒蛾核型多角体病毒防治舞毒蛾奠定基础。

Description

舞毒蛾核型多角体病毒的生产工艺

技术领域

本发明涉及一种舞毒蛾病毒的生产方法，其用于生产舞毒蛾病毒杀虫剂，属于林木害虫——舞毒蛾生物防治领域。

背景技术

舞毒蛾(Lymantria dispar L．)，又名秋千毛虫、苹果毒蛾、柿毛虫，隶属于鳞翅目Lepidoptera，毒蛾科Lymantriidae，毒蛾属Lymantria，是世界性食叶害虫，具有分布广、食性杂、危害重、幼虫随风迁移等特点。

由于舞毒蛾对农林业的危害严重，近百年来，人们采用了多种方法对舞毒蛾进行防治。化学农药防治是应用最早也是迄今为止应用最为广泛的防治手段。因其具有经济、有效、方法简便、不受地形限制等特点，当森林虫害发生时，能在短期内取得满意的防治效果，减少经济损失。但大量采用化学制剂防治，产生了严重的―3R”问题，即抗药性(Resistance)、再猖獗(Resurgence)和残留(Residue)。

近年来，随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，使用和开发高效、低毒、无公害的农药已成为发展的必然趋势。昆虫病毒不仅具有寄主专一性、防治效果好、不污染环境、对其它生物安全、不使害虫产生抗药性等优点，而且病毒还能在环境中积累，通过外界因子的刺激或诱发等多种途径在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口密度，在害虫的可持续控制中发挥重要的作用。

在舞毒蛾防治中，核型多角体病毒(NPV)是最常用的一种。利用舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)防治舞毒蛾已有几十年的历史。国外对LdNPV的应用研究较早，60年代初就开始利用舞毒蛾核型多角体病毒进行林间防治，并取得了较为理想的效果。实验证明，舞毒蛾核型多角体病毒是影响舞毒蛾种群动态的主要因子之一，常引起舞毒蛾种群数量的急剧下降，是有效防治舞毒蛾、降低其危害的有效方法。应用舞毒蛾核型多角体病毒(LdNPV)防治舞毒蛾在世界各地均取得了良好效果，特别是在各种化学合成杀虫剂严重污染环境以及害虫对化学合成杀虫剂抗性日益增强的情况下，应用舞毒蛾核型多角体病毒防治舞毒蛾显得尤为重要和迫切。

上述试验证明，LdNPV对舞毒蛾不但有良好的防治效果，且对哺乳动物无不良影响，值得推广使用。目前，舞毒蛾核型多角体病毒以在舞毒蛾幼虫体内复制最为经济，且舞毒蛾人工饲养技术已成功解决，但利用人工饲料饲养的舞毒蛾接毒龄期、接毒浓度、接毒时间对舞毒蛾生长、发育、存活以及病毒复制量是否存在影响还未见报道。因此，本发明对舞毒蛾病毒复制最佳幼虫龄期、接毒浓度、接毒时间等进行了试验筛选。通过这些试验完善了舞毒蛾核型多角体病毒工厂化生产流程与方法，扩大了舞毒蛾病毒产量，降低了生产成本，为野外大面积推广应用舞毒蛾核型多角体病毒防治舞毒蛾奠定基础。

发明内容

本发明涉及一种舞毒蛾病毒扩增的生产方法，其特征在于，将浓度为1.0×10⁶PIB/ml的舞毒蛾病毒施予饲料上，用带有病毒的饲料来饲养4龄舞毒蛾的幼虫使其感染，10天后收集感毒虫或死亡虫，粉碎、过滤，将滤液离心后收集沉淀。

根据本发明，所述舞毒蛾病毒优选舞毒蛾核型多角体病毒。

进一步优选的，本发明涉及一种舞毒蛾病毒的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)舞毒蛾病毒的扩增

将配制好的病毒液（浓度为1.0×10⁶PIB/ml）均匀施予饲料（例如人工饲料）表面，晾干（以人工饲料表面无水滴为准）后，让4龄幼虫取食感染，扩增室温度优选控制在25℃。

2)感毒虫的收集及病毒提取

健康虫接毒10天后，收集感毒虫或死亡虫，放入容器中，优选将其放入-18℃的冰箱中保存，必须保证及时收集，避免虫体破损造成病毒液流失。

将收集的感毒虫或死亡虫的尸体加无菌水稀释（例如2～3倍），粉碎（优选在高速组织捣碎机上，做间断匀浆2～3min），用纱布过滤（优选三层），然后再用筛子过滤（优选80目），滤液加水稀释（例如2～3倍），再离心（例如使用16000r/min离心机），弃上清液，得沉淀。

将提取的多角体沉淀加适量蒸馏水稀释，利用血球计数器在光学显微镜下进行观察计数。多角体含量不得低于2.5×10¹⁰PIB/ml。

本发明进一步涉及一种舞毒蛾病毒杀虫剂的制备方法，将上述扩增得到的舞毒蛾病毒用水稀释，加入荧光素钠、防腐剂、乳化剂、甘油，搅拌得到悬浮液剂。在上述制备过程中，优选在无菌环境下进行，所有器皿、分装盛具均优选消毒灭菌，所述水优选使用无菌水。

进一步优选的，本发明涉及一种舞毒蛾病毒杀虫剂的制备方法：将已测数的多角体沉淀物加水稀释至2.5×10¹⁰PIB/ml，称取萤光素钠，再加少量无菌水，充分研磨溶解后，加入多角体悬液再搅匀；将防腐剂溶于无菌水然后加入前液中搅匀，加入乳化剂搅匀；最后加入甘油，用电动机搅拌（例如20min）。分装，封口，贴标签。在配制过程中，应在无菌环境下进行。

饲毒龄期、饲毒浓度以及饲毒时间均是影响LdNPV室内增殖的重要因子。

其中饲毒龄期低于4龄时，幼虫体重增加速率缓慢，虫尸重也越小，从而影响最终的病毒获得量。但龄期若太高（5龄），会有绝大部分个体发育至蛹期，最终也影响病毒的产量。舞毒蛾饲毒以4龄幼虫为最佳。

同饲毒龄期一样，饲毒浓度对舞毒蛾幼虫体重、虫尸重以及含毒量也存在一定影响。饲毒浓度高于1.0×10⁶PIB/ml时，会抑制幼虫的取食，促进幼虫死亡的速度，从而影响体重增长，虫尸重也越低。但饲毒浓度若低于该浓度时，最终死亡幼虫体重同此浓度无显著差异，但死亡时间会增加4－8d，从而增加一次喂饲次数，提高人工饲养成本。饲毒浓度以1.0×10⁶PIB/ml为最佳。

饲毒时间优选10天，此时收集的饲毒虫体重最高，体内浓度含量也最高。

根据本发明，所述饲料可以为人工饲料，或者为本发明人于2011年11月19日提交的，申请号为201110318830.5，发明名称为“舞毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的生产工艺”的在先申请中提及的饲料或人工饲料，其全文引入本文作为参考。

根据本发明，所述人工饲料可以为：干酪素35g、韦氏盐10g、蔗糖12g、果糖23g、麦胚60g、氯化胆碱1g、对羟1.5g、琼脂25g、金霉素0.3g、抗坏血酸4g、4M KOH 5ml、38%甲醛0.5ml、55％亚麻酸4.3ml、混合维生素10ml（烟酸100g、泛酸钙100g、核黄素50g、盐酸硫胺素25g、盐酸吡哆醇25g、叶酸25g、生物素2g、B₁₂0.2g）、水860ml；或者

饲料：干酪素40g、蔗糖30g、韦氏盐10g、山梨酸2g、麦胚100g、琼脂16g、对羟1g、混合维生素10g（抗坏血酸280g、氯化胆碱55g、叶酸250ml、肌醇20g、烟酸1g、吡哆辛230mg、胆固醇50g、B121.5g）、水800ml。

根据本发明，所述人工饲料包括：韦氏盐4-15重量份、麦胚80-180重量份、干酪素30-90重量份、蔗糖5-15重量份、抗坏血酸4-15重量份、氯化胆碱0.3-6重量份、肌醇0.3-6重量份、胆固醇0.5-6重量份。优选地，进一步包括琼脂8-25重量份、水适量。更优选地，所述饲料还包括山梨酸0.3-6重量份。

更优选的，本发明的人工饲料包括：韦氏盐6-10重量份、麦胚100-140重量份、干酪素35-70重量份、蔗糖8-13重量份、抗坏血酸6-10重量份、氯化胆碱0.5-4重量份、肌醇0.5-4重量份、胆固醇1-5重量份。优选地，进一步包括琼脂10-20重量份、水适量。更优选地，所述饲料还包括山梨酸0.5-4重量份。

特别优选的，本发明的人工饲料中的组分及其重量份为：韦氏盐8重量份、麦胚120重量份、干酪素50重量份、蔗糖10重量份、抗坏血酸8重量份、氯化胆碱2重量份、肌醇2重量份、胆固醇3重量份。优选地，进一步包括琼脂15重量份、水780重量份。更优选地，所述饲料还包括山梨酸2重量份。

附图说明

图1：饲毒龄期舞毒蛾幼虫存活率的影响。

图2：饲料浓度对舞毒蛾幼虫存活率的影响。

图3：饲毒龄期对舞毒蛾幼虫体重增长的影响。

图4：饲毒浓度对舞毒蛾幼虫体重增长的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。任何对本发明做出的改进都在本发明的保护范围之内。

实施例1：舞毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的生产工艺

1、供试昆虫和病毒

舞毒蛾：2010年4月舞毒蛾卵块采自内蒙古赤峰市乌兰察布林区，卵块用10％甲醛溶液消毒，将同一时期孵出的活泼的一龄幼虫为供试昆虫；

舞毒蛾核型多角体病毒（LdNPV）原液：北京市西山试验林场生防中心2000年自北京市房山区林区采集获得，-10℃实验室保存；

LdNPV母液的制备：利用无菌水将上述实验室保存的LdNPV原液配成浓度为1.0×10⁹PIB/ml的母液。

2、饲料

韦氏盐8g、麦胚120g、干酪素50g、蔗糖10g、山梨酸2g、抗坏血酸8g、氯化胆碱2g、肌醇2g、胆固醇3g、琼脂15g、水780ml。

3、生产工艺

1)舞毒蛾病毒的扩增

幼虫发育4龄时，用滴管吸取舞毒蛾病毒液（浓度为1.0×10⁶PIB/ml）（由病毒原液稀释而成），每杯滴入0.1～0.2ml（约3滴）于人工饲料表面上，晾干（以人工饲料表面无水滴为准）后，每杯放入6条4龄虫，让其取食感染，扩增室温度控制在25℃。

2)感毒虫的收集及病毒提取

健康虫接毒10天后，收集感毒虫或死亡虫，放入容器中，并将其放入-18℃的冰箱中保存，必须保证及时收集，避免虫体破损造成病毒液流失。

将收集的病死虫尸加2～3倍无菌水稀释，在高速组织捣碎机上，做间断匀浆2～3min后取出，用三层纱布过滤，然后再用80目筛子过滤，滤液加2～3倍的水稀释，再用16000r/min离心机离心，弃上清液，得沉淀。

将提取的多角体沉淀加适量蒸馏水稀释，利用血球计数器在光学显微镜下进行观察计数。多角体含量不得低于2.5×10¹⁰PIB/ml。

3)病毒杀虫剂的配制

将已测数的多角体沉淀物加水稀释至2.5×10¹⁰PIB/ml，称取萤光素钠，再加少量无菌水，充分研磨溶解后，加入多角体悬液再搅匀；将防腐剂溶于无菌水然后加入前液中搅匀，加入乳化剂搅匀；最后加入甘油，用电动机搅拌20min。分装，封口，贴标签。在配制过程中，应在无菌环境下进行。

制成的产品为浓缩悬浮液剂，浓度为1.25×10¹⁰PIB/ml。该制剂对光和高温敏感，应避光低温保存。一般情况下，保质期为：-15℃保存3年，4℃保存2年，常温保存1年。

实施例2：饲毒龄期、饲毒浓度、饲毒时间的影响分析

1、实验

1.1饲毒龄期对舞毒蛾存活的影响以及虫尸重与病毒含量关系分析

将1.1LdNPV母液稀释1000×，倒入盛有新鲜人工饲料的透明塑料养虫杯（底Φ=3.5cm，顶Φ=5.0cm，H＝5cm）内，将多余液体倒出，放于养虫室内阴干后待用。然后分别选取体重相当的舞毒蛾2、3、4和5龄幼虫，单头放于上述养虫杯中，盖盖后倒置于饲养筐内，置于养虫室内饲养。室内平均温度25.0℃，RH＝60％，L：D＝16：8。每24小时记录一次幼虫体重并清理一次虫粪，每5d更换一次新鲜带毒人工饲料，直至完全死亡或化蛹，并分别收集死亡虫尸，称重后测病毒颗粒体含量。不同处理重复200次，以浸清水的人工饲料喂饲2～5龄幼虫为CK。统计分析饲毒龄期对其体重的影响以及虫尸重与病毒含量之间的关系。

1.2饲毒浓度对舞毒蛾存活的影响以及虫尸重与病毒含量关系分析

将1.1LdNPV母液分别稀释至1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³PIB/ml后，倒入盛有新鲜人工饲料的透明塑料养虫杯（底Φ=3.5cm，顶Φ=5.0cm，H＝5cm）内，将多余液体倒出，放于养虫室内阴干后待用。然后选取体重相当的舞毒蛾4龄初幼虫，单头放于带盖养虫杯中，试验条件与方法同上。不同处理重复200次，以浸清水的人工饲料喂饲初孵4龄幼虫为CK。统计分析饲毒浓度对其体重的影响以及虫尸重与病毒含量之间的关系。

1.3饲毒时间对舞毒蛾含毒量的影响

将1.1LdNPV母液分别稀释至1.0×10⁶，倒入盛有新鲜人工饲料的透明塑料养虫杯（底Φ=3.5cm，顶Φ=5.0cm，H＝5cm）内，将多余液体倒出，放于养虫室内阴干后待用。然后选取体重相当的舞毒蛾初孵4龄幼虫，单头放于带盖养虫杯中，单头放于上述养虫杯中，盖盖后倒置于饲养筐内，试验条件同上。分别自第6、8、10、12、14d收集50头幼虫，称重后测病毒颗粒体含量。统计分析饲毒时间对其体重的影响以及虫尸重与病毒含量之间的关系。

1.4舞毒蛾核型多角体病毒含量测定

收取1.1、1.2、1.3中收集的幼虫，分别称重后加蒸馏水至200mL，用组织匀浆器10000rpm匀浆9min后稀释至500倍，然后1000rpm离心20min，取上清液按最初病毒尸体重量稀释成2000倍液体（W/V），镜检测定舞毒蛾颗粒体病毒浓度。

应用SPAS软件对上述试验相关数据进行单因素方差分析。具体结果和分析如图1-4及以下分析所示：

2、结果与分析

2.1饲毒龄期和浓度对舞毒蛾存活的影响

2.1.1饲毒龄期对舞毒蛾存活的影响

从图1可以看出，饲毒浓度一致时，饲毒龄期对舞毒蛾幼虫存活率影响较大。龄期越大，饲毒后幼虫开始死亡的时间越长，且全部死亡的时间也越长，即取食的时间越长，有利于幼虫体重的增长。而低龄幼虫，如2龄幼虫，饲毒后9天内即全部死亡，死亡时体重较轻，病毒获得量较少，不利于工厂化病毒的生产。5龄幼虫喂饲9天后有78％的个体发育至蛹，也不利于病毒的复制。

2.1.2饲毒浓度对舞毒蛾存活的影响

如图2所示，饲毒浓度对4龄舞毒蛾幼虫存活率存在一定影响，饲毒浓度越大，幼虫发生死亡的时间越短，且全部死亡的时间也越短。4龄幼虫喂饲1.0×10³PIB/ml浓度的病毒后，幼虫自第11d开始死亡，自21d全部死亡；而喂饲1.0×10⁸PIB/ml病毒后，第5d即开始死亡，第11d时已经完全死亡。对照存活率为100％，全部正常化蛹。

2.2饲毒龄期和浓度对舞毒蛾体重的影响

2.2.1饲毒龄期对舞毒蛾体重的影响

舞毒蛾不同龄期的幼虫饲喂病毒后的体重增长情况如图3所示。各龄期幼虫饲毒后体重均低于CK，说明饲毒对各龄期幼虫体重增长均有不同程度的抑制。最高体重量从高至低依次为CK>5龄>4龄>3龄>2龄，饲毒龄期越小，增长越缓慢。

2.2.2饲毒浓度对舞毒蛾体重增长的影响

图4统计了不同饲毒浓度对舞毒蛾4龄幼虫体重增长的影响，可以看出，饲毒浓度越高越抑制舞毒蛾的取食，从而影响它死亡时的体重。

2.3饲毒虫尸重与病毒含量关系分析

2.3.1饲毒龄期对虫尸重和病毒含量的影响

通过表1可以看出，饲毒龄期与虫尸重成正相关，饲毒龄期越大，死后尸体重量越重。其中，2、3龄幼虫饲毒后虫尸体重彼此差异不显著，单头重量均不超过0.03g，而4、5龄饲毒幼虫虫尸重与2、3龄差异显著，单头虫尸均超过0.2g。通过表1还可以发现，虫尸内病毒颗粒体含量与虫尸体重也成正比，虫尸体重越大，颗粒体含量越多。因此，室内增殖LdNPV时，还应选取老熟幼虫进行复制。由于5龄幼虫饲毒后，有78％个体发育至蛹，没有全部死亡，因此，以4龄幼虫为饲毒虫最佳。

表1饲毒龄期对舞毒蛾虫尸重和病毒含量的影响

饲毒龄期	虫尸重（g/头）	病毒含量（109PIB/头）
			2龄	0.0145b	0.73a
3龄	0.0293b	1.84a
			4龄	0.2468a	15.68b
5龄	0.2650a	15.87b

注：表中同列字母相同，表示5%水平上差异不显著，下表同。

2.3.2饲毒浓度对虫尸重和病毒含量的影响

采用不同的饲毒浓度，研究对尸重和病毒含量的影响。

由表2可以看出，饲毒浓度对虫尸重和病毒含量有较大影响。其中，饲毒浓度超过1.0×10⁶PIB/ml时，能明显抑制舞毒蛾幼虫体重的增长，虫尸内病毒含量相应降低。饲毒浓度低于1.0×10⁶PIB/ml(含1.0×10⁶PIB/ml)时，幼虫死亡后虫尸重无显著差异，单头虫尸重均在0.25-0.27g之间，体内病毒含量也无显著差异。但饲毒浓度越低，舞毒蛾幼虫80％以上个体死亡的时间越长，最长可达17d，延长了病毒生产时间，相应增加生产成本。综合上述因素，室内增殖LdNPV时，饲毒浓度以1.0×10⁶PIB/ml为宜。

表2饲毒浓度对舞毒蛾虫尸重和病毒含量的影响

2.3.3饲毒时间对舞毒蛾体重和病毒含量的影响

饲毒时间对舞毒蛾体重和病毒含量影响见表3。通过此表可以看出，饲毒6-10d内幼虫体重呈上升趋势，至第10d达到最高，为0.2646g/头，随着饲毒时间的延长，幼虫体重反而下降。幼虫体内病毒含量变化趋势同体重一致，均为6-10d内，随饲毒时间的延长而增加，10-14d内，随饲毒时间的延长而下降。主要因为，饲毒时间过短，幼虫体重还未发育到最大龄期，所以体重较低，体内病毒量较少；饲毒时间过长，部分死亡的幼虫体壁破裂，体内病毒汁液流出，因此体重反而下降，体内病毒含量降低。因此，最佳饲毒时间为10d。

表3饲毒时间对舞毒蛾体重和病毒含量的影响

Claims (5)

1.一种舞毒蛾病毒扩增的生产方法，将浓度为1.0×10⁶PIB/ml的舞毒蛾病毒施予人工饲料上，用上述带有病毒的人工饲料来饲养4龄舞毒蛾的幼虫使其感染，10天后收集感毒虫或死亡虫，粉碎、过滤，将滤液离心后收集沉淀，所述人工饲料包括：韦氏盐8重量份、麦胚120重量份、干酪素50重量份、蔗糖10重量份、抗坏血酸8重量份、氯化胆碱2重量份、肌醇2重量份、胆固醇3重量份、琼脂15重量份、山梨酸2重量份、水780重量份。

2.如权利要求1所述的生产方法，包括如下步骤：

1)舞毒蛾病毒的扩增

将配制好的浓度为1.0×10⁶PIB/ml的病毒液均匀施予所述人工饲料表面，晾干后，让4龄幼虫取食感染；

2)感毒虫的收集及病毒提取

健康虫接毒10天后，收集感毒虫或死亡虫，放入容器中，放入冰箱中保存，

将收集的病死虫尸加无菌水稀释，粉碎，用纱布过滤，然后再用筛子过滤，滤液加水稀释，再离心，弃上清液，得沉淀。

3.一种舞毒蛾病毒杀虫剂的制备方法，将权利要求1-2任一项中扩增得到的舞毒蛾病毒用水稀释，加入荧光素钠、防腐剂、乳化剂、甘油，搅拌得到悬浮液剂。

4.如权利要求3所述的制备方法，该方法在无菌环境下进行。

5.如权利要求3所述的制备方法，将已测数的多角体沉淀物加水稀释至2.5×10¹⁰PIB/ml，称取萤光素钠，再加少量无菌水，充分研磨溶解后，加入多角体悬液再搅匀；将防腐剂溶于无菌水然后加入前液中搅匀，加入乳化剂搅匀；最后加入甘油，用电动机搅拌。