CN102965346B

CN102965346B - 美国白蛾核型多角体病毒生产工艺

Info

Publication number: CN102965346B
Application number: CN201210480369.8A
Authority: CN
Inventors: 梁洪柱; 陈倩; 田会鹏; 梁晓梅
Original assignee: BEIJING XISHAN EXPERIMENT FOREST FARM
Current assignee: Beijing Xishan Experimental Forest Farm Management Office
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2032-11-22
Also published as: CN102965346A

Abstract

本发明提供一种美国白蛾核型多角体病毒的生产工艺，其中对美国白蛾饲养密度、饲养容器以及病毒复制最佳幼虫龄期、接毒浓度等进行了改进。通过这些改进完善了美国白蛾核型多角体病毒工厂化生产流程与方法，扩大了美国白蛾病毒产量。

Description

美国白蛾核型多角体病毒生产工艺

技术领域

本发明涉及一种美国白蛾核型多角体病毒的生产工艺，其用于防治美国白蛾，属于林木害虫——美国白蛾生物防治领域。

背景技术

美国白蛾（Hyphantria cunea）属鳞翅目灯蛾科昆虫，是国际上重要的检疫对象，是多种林木、果树和农作物的危险性害虫。1979年传入我国以来，先后在辽宁省丹东、山东荣成、烟台、陕西武功、天津、河北秦皇岛等地区爆发成灾。由于其繁殖力强（每个卵块500-2000粒卵），食性杂（可危害200多种植物），又具有暴食性以及其成虫具有较强的迁飞习性等特点，对我国的农、林业、养蚕业和城市园林造成很大的威胁。

联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）多次共同推荐昆虫杆状病毒用于大面积防治农林害虫，并将其列为二十一世纪首选的生物农药开发对象。美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）属杆状病毒科，核型多角体病毒属，是实现美国白蛾持续控制的重要措施，其宿主专一性强、毒力和稳定性高、不污染环境、对生态系统中的其他非靶标生物安全，是控制害虫种群数量变动的重要生物因子，不仅可以通过感病幼虫的排泄物和尸体进行水平扩散，而且能够通过产卵方式进行垂直传递。此外，病毒还能在环境及寄主种群中积累，并可通过外界环境刺激或诱发等多种途径在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口密度，是引起昆虫种群数量变动的主要因素。同时，因为它是生态系统中固有的生态因子，能够从生态系统的内部出发，通过调节内部生态因子，逐步建立起比较稳定的植物-害虫-天敌等食物链关系来实现整个生态系统的和谐与稳定，从而降低害虫连续爆发成灾的风险，实现对害虫的持久有效控制。

美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）是一种对美国白蛾非常有效的病毒杀虫剂。其杀虫效果、防治方法、以及病毒生产复制方法等，国内外已有很多报道。如丹东动植物检疫所于1983-1985年，使用美国白蛾核型多角体病毒在辽宁省丹东市防治美国白蛾。武汉大学于1985年在陕西生产美国白蛾病毒，并采用病毒与Bt、敌百虫和除虫菊酯混合防治美国白蛾。1985年中国林科院何介田等从自然界分离得到了美国白蛾核型多角体病毒，经人工接种试验对各龄幼虫都有很强的感染力。在国外关于美国白蛾以及HcNPV病毒的研究很多，如美国、南斯拉夫、原捷克斯洛伐克、保加利亚、原苏联、日本、朝鲜等。而且国内外对舞毒蛾病毒、松毛虫病毒、春尺蠖病毒增效剂的研究颇多，并取得一定成果。对美国白蛾病毒辅助杀虫剂的研究提供了重要基础信息和技术支持。

目前美国白蛾核型多角体病毒以在美国白蛾幼虫体内复制最为经济，而且美国白蛾人工饲养已完全解决，可以实现美国白蛾核型多角体病毒室内人工规模化扩繁。在室内条件下，美国白蛾饲养密度、饲养容器以及接毒龄期、接毒浓度对美国白蛾的生长、发育、存活以及病毒复制量等有着决定的影响。因此，本研究对美国白蛾饲养密度、饲养容器以及病毒复制最佳幼虫龄期、接毒浓度等进行了试验筛选。通过这些试验完善了美国白蛾核型多角体病毒工厂化生产流程与方法，扩大了美国白蛾病毒产量。

发明内容

本发明涉及一种美国白蛾病毒的生产工艺，在一容器中放入4龄美国白蛾幼虫，将浓度为1.0×10⁷PIB/ml的美国白蛾病毒液施予饲料上，用上述带有病毒的饲料来饲养上述容器中的美国白蛾幼虫使其感染，收集感毒虫或死亡虫，粉碎、过滤，将滤液离心后收集沉淀。

优选的，本发明中的美国白蛾病毒为美国白蛾核型多角体病毒。

优选的，所述容器杯底直径4.5cm，杯口直径7cm，高8.5cm，优选透明塑料杯。

优选的，本发明涉及一种美国白蛾病毒的生产工艺，包括：

1、美国白蛾病毒的扩增

美国白蛾幼虫发育3龄末4龄初时，用消毒的无菌水配制浓度为1.0×10⁷PIB/ml美国白蛾病毒液，优选加入氯霉素滴眼液（优选每500ml病毒液中加1管氯霉素滴眼液）。将配制好的病毒液均匀施予饲料表面，晾干（优选饲料表面无水珠，且无干裂不会过干脱离杯壁），让幼虫取食感染。优选复制室条件为T=25℃，L:D=14:10。至接毒第5d时，优选将每养虫杯内的虫粪清除一遍，防止虫体感染杂菌。

2、感毒虫的收集

在幼虫接毒后至80％虫体死亡时（约接毒的第10d），将每养虫杯内的虫粪清除干净，再将每杯的虫尸收集。

3、病毒的提取

将收集的病死虫尸加无菌水稀释（优选加入1倍无菌水），搅碎（例如用绞肉机），过滤，将滤液离心后收集沉淀。优选的，在离心之前，加水稀释滤渣（优选加入1倍的水），过滤，将两次的滤液混合。其中过滤优选使用80目筛子。

根据本发明，所述饲料可以为人工饲料。

根据本发明，所述人工饲料包括：韦氏盐4-15重量份、麦胚80-180重量份、干酪素30-90重量份、蔗糖5-15重量份、抗坏血酸4-15重量份、氯化胆碱0.3-6重量份、肌醇0.3-6重量份、胆固醇0.5-6重量份。优选地，进一步包括琼脂8-25重量份、水适量。更优选地，所述饲料还包括山梨酸0.3-6重量份。

更优选的，本发明的人工饲料包括：韦氏盐6-10重量份、麦胚100-140重量份、干酪素35-70重量份、蔗糖8-13重量份、抗坏血酸6-10重量份、氯化胆碱0.5-4重量份、肌醇0.5-4重量份、胆固醇1-5重量份。优选地，进一步包括琼脂10-20重量份、水适量。更优选地，所述饲料还包括山梨酸0.5-4重量份。

特别优选的，本发明的人工饲料中的组分及其重量份为：韦氏盐8重量份、麦胚120重量份、干酪素50重量份、蔗糖10重量份、抗坏血酸8重量份、氯化胆碱2重量份、肌醇2重量份、胆固醇3重量份。优选地，进一步包括琼脂15重量份、水780重量份。更优选地，所述饲料还包括山梨酸2重量份。

根据本发明，所述人工饲料可以为：干酪素35g、韦氏盐10g、蔗糖12g、果糖23g、麦胚60g、氯化胆碱1g、对羟1.5g、琼脂25g、金霉素0.3g、抗坏血酸4g、4M KOH 5ml、38%甲醛0.5ml、55％亚麻酸4.3ml、混合维生素10ml（烟酸100g、泛酸钙100g、核黄素50g、盐酸硫胺素25g、盐酸吡哆醇25g、叶酸25g、生物素2g、B₁₂0.2g）、水860ml；或者

饲料：干酪素40g、蔗糖30g、韦氏盐10g、山梨酸2g、麦胚100g、琼脂16g、对羟1g、混合维生素10g（抗坏血酸280g、氯化胆碱55g、叶酸250ml、肌醇20g、烟酸1g、吡哆辛230mg、胆固醇50g、B₁₂1.5g）、水800ml。本发明进一步涉及一种人工饲养美国白蛾的方法，其中使用一特定的容器进行饲养，优选杯底直径4.5cm，杯口直径7cm，高8.5cm，优选使用透明塑料杯。优选的，在该容器的饲养密度为8头/杯。

本发明中饲养容器不宜太大，因为饲养容器太大，在更换饲料时有不少幼虫逃逸或被遗漏。并且较大的容器中幼虫数量多，需要的饲料也多，使得容器中湿度很大，幼虫容易感染病毒或真菌。因此容器优选透明塑料杯，杯底直径4.5cm，杯口直径7cm，高8.5cm。

本发明中饲养密度不宜过高和过低，密度过高幼虫对食物竞争激烈，化蛹时间早，导致蛹重较小。并且化蛹时相互拥挤致使一些幼虫在预蛹期死亡。密度很小时对幼虫的体重增长也不利，其原因可能与美国白蛾低龄时群聚的习性有关。优选饲养密度为8头/杯时的饲养效果最好，不但幼虫存活率最高，幼虫和蛹的体重增长最多，而且蛹羽化率、总产卵量、单雌产卵量以及产生后代个数也最高。

本发明中饲毒时的虫龄和HcNPV浓度是影响美国白蛾取食（排泄）和体重的主要因素。而且饲毒龄期以及饲毒浓度均是影响HcNPV室内增殖的重要因子。其中饲毒龄期越小，体重增加速率越慢，虫尸重也越小，从而影响最终的病毒获得量。但龄期若太高，会有绝大部分个体发育至蛹期，不发生死亡现象，最终也影响病毒的产量。优选的饲毒龄期为4龄幼虫。同饲毒龄期一样，饲毒浓度对美国白蛾幼虫虫尸重以及含毒量也存在一定影响。饲毒浓度过高，抑制幼虫的体重增长，虫尸重也低。饲毒浓度若过低，部分虫体不发生死亡，故虫体内病毒含量少。优选的饲毒浓度为1.0×10⁷PIB/ml。优选每500ml病毒液中加1管氯霉素滴眼液。

附图说明

图1不同密度下幼虫体重增长情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于实施例。任何对本发明做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。

美国白蛾：2006年6月采自北京市大兴区苗圃地，室内续代饲养；

美国白蛾核型多角体病毒（HcNPV）原液：北京市西山试验林场生防中心实验室保存。

HcNPV母液的制备：利用无菌水将上述实验室保存的HcNPV原液配成浓度为1.0×10⁹PIB/ml的母液。

实施例1：美国白蛾核型多角体病毒的生产工艺

1、美国白蛾病毒的扩增

美国白蛾幼虫发育3龄末4龄初时，用消毒过放凉的无菌水配制浓度为1.0×10⁷PIB/ml美国白蛾核型多角体病毒液，且每500ml病毒液中加1管氯霉素滴眼液。将配制好的病毒液均匀涂于人工饲料（例如前述任一种，或者韦氏盐8重量份、麦胚120重量份、干酪素50重量份、蔗糖10重量份、抗坏血酸8重量份、氯化胆碱2重量份、肌醇2重量份、胆固醇3重量份。）表面，在病毒室内晾干，保证饲料和杯壁表面无水珠，且饲料无干裂不会过干脱离杯壁，每杯放入8头幼虫，让其取食感染，复制室条件为T=25℃，L:D=14:10。至接毒第5d时，将每养虫杯内的虫粪清除一遍，防止虫体感染杂菌。

2、感毒虫的收集

在幼虫接毒后至80％虫体死亡时（约接毒的第10d），将每养虫杯内的虫粪清除干净，再将每杯的虫尸收集于塑料桶内，放于-5℃条件下保存备用。

3、病毒提取、浓缩

将收集的病死虫尸加1倍无菌水稀释，用绞肉机进行搅碎，然后再用80目筛子过滤。然后再加1倍的水稀释滤渣，80目筛过滤。将两次的滤液混合均匀，装桶备用。

4、病毒多角体含量的测定

称取美国白蛾毒尸30g，加入50ml蒸馏水，放入组织捣碎匀浆机中打匀成浆，并用三层纱布过滤，将滤液倒入50ml的离心管中，4000r/min离心10min去上清液，沉淀加入30ml蒸馏水轻轻摇动，直至离心管底部仅剩黑色沉淀为止，将液体倒入到新的离心管中进行二次离心，离心完成后倒掉上清液，留下的沉淀加入20ml蒸馏水轻轻摇动，直至离心管底部仅剩黑色沉淀为止，将液体倒入到新的离心管中。取1ml提取液稀释10倍，连续稀释3次。取1ml稀释液滴于血球计数板上，在光学显微镜10倍镜头下先寻找血球计数板的方格条，然后在40倍镜头下沿血球计数板方格对角线进行病毒颗立体计数，其中在血球计数板每一小方格线上的病毒颗立体，按固定的两条边线进行计数，重复测定4次。病毒多角体含量=4次病毒颗粒体计数之和÷80×4.0×10⁶×1000，单位：PIB/ml。实施例2：饲养容器、饲养密度、饲毒龄期、饲毒浓度的影响分析

1.实验

1.1饲养容器对美国白蛾生长发育及存活的影响

饲养容器：①透明塑料杯，杯底直径4.5cm，杯口直径7cm，高8.5cm。②透明塑料方盒，边长9cm，高4cm。③透明塑料带分隔方盒1，长21.2cm，宽13.9cm，高8cm。④透明塑料带分隔方盒2，长28.4cm，宽19cm，高9cm。⑤透明塑料带分隔方盒3，长38.3cm，宽25.1cm，高11cm。（注：其中饲养容器③～⑤利用硬纸壳将其分隔为3.5×3.5cm的小空格。）

选取刚蜕皮的3龄幼虫，在容器①～⑤中（其中③～⑤为每一空格中）置入8头幼虫，置于室内条件下饲养。室内平均温度25.0℃，RH＝60％。每24小时更换一次新鲜树叶，并观察记录一次幼虫死亡和蜕皮情况，直至化蛹，不同处理重复20次。将蛹置于养虫笼中，待其羽化后记录羽化率、产卵量以及卵的孵化情况。分析不同饲养容器对美国白蛾幼虫生长发育、存活以及成虫和卵等的影响。

1.2饲养密度对美国白蛾生长发育及存活的影响

选取刚蜕皮的3龄幼虫，按不同密度分别放于容器①中（密度分别为4、6、8、10、12头/杯），用新鲜杨树叶置于室内条件下饲养。室内平均温度25.0℃，RH＝60％。每24h更换一次新鲜树叶，并观察记录一次幼虫蜕皮情况、死亡情况、失踪情况以及体重，直至化蛹，不同处理重复20次。将蛹置于养虫笼中，待其羽化后记录雌雄性比、单雌产卵量以及卵的最终孵化率。分析不同容器对美国白蛾幼虫体重、存活以及对美国白蛾生物学特性等的影响。

1.3饲毒浓度对美国白蛾排泄以及死亡率的影响

将HcNPV母液分别稀释1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷和1.0×10⁸PIB/ml后，放入有新鲜人工饲料的养虫杯内，2s后倒出，阴干饲料待用。然后选取体重相当的美国白蛾2龄幼虫，单头放于带盖养虫杯（底Φ=4.5cm，顶Φ=7.0cm，H＝8.5cm）中，分别饲喂上述浸过HcNPV的阴干饲料，置于室内条件下饲养。室内平均温度25.0℃，RH＝60％。每24小时记录一次虫粪重，并更换新鲜浸毒饲料，直至完全死亡或化蛹，不同处理重复50次。以浸清水的人工饲料喂饲2龄初幼虫为CK。统计分析饲毒浓度对美国白蛾排泄和死亡率的影响。

1.4饲毒龄期对美国白蛾排泄和死亡率的影响

将1.0×10⁷PIB/mlHcNPV放带有新鲜人工饲料的养虫杯（底Φ=4.5cm，顶Φ=7.0cm，H＝8.5cm）中浸2s，取出，阴干饲料。然后分别选取体重相当的美国白蛾2、3、4和5龄幼虫，单头放于带盖养虫杯中，置于室内条件下饲养。室内平均温度25.0℃，RH＝60％。每24小时记录一次虫粪重和死亡情况，并更换新鲜浸毒叶片，直至完全死亡或化蛹。不同处理重复50次，以浸清水的饲料喂饲2～5龄幼虫为CK。统计分析饲毒龄期对其排泄和死亡率的影响。

1.5饲毒龄期对美国白蛾体重影响以及虫尸重与病毒含量关系分析

将1.0×10⁷PIB/mlHcNPV放带有新鲜人工饲料的养虫杯（底Φ=4.5cm，顶Φ=7.0cm，H＝8.5cm）中浸2s，取出，阴干饲料。然后分别选取体重相当的美国白蛾2、3、4和5龄幼虫，单头放于上述带盖养虫杯中，置于室内条件下饲养。室内平均温度25.0℃，RH＝60％。每24小时记录一次幼虫体重，并更换新鲜浸毒叶片，直至完全死亡或化蛹，并分别收集死亡虫尸，称重后测病毒核型多角体含量。不同处理重复50次，以浸清水的饲料喂饲2～5龄幼虫为CK。统计分析饲毒龄期对其体重的影响以及虫尸重与病毒含量之间的关系。

1.6饲毒浓度对美国白蛾体重影响以及虫尸重与病毒含量关系分析

上述HcNPV母液分别稀释1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷和1.0×10⁸PIB/ml后，放入有新鲜人工饲料的养虫杯内，2s后倒出，阴干饲料待用。然后选取体重相当的美国白蛾初孵4龄幼虫，单头放于带盖养虫杯（底Φ=4.5cm，顶Φ=7.0cm，H＝8.5cm）中，置于室内条件下饲养。室内平均温度25.0℃，RH＝60％。每24小时记录一次体重，并更换新鲜浸毒叶片，持续10天（80％个体死亡），不同处理重复50次。分别收集所有虫体，称重后测病毒核型多角体含量，统计分析饲毒浓度对其体重的影响以及虫尸重和病毒含量之间的关系。

1.7美国白蛾核型多角体病毒含量测定

收取1.5和1.6中刚死亡的幼虫虫尸，分别称重后加蒸馏水至200mL，用组织匀浆器10000rpm匀浆9min后稀释至500倍，然后1000rpm离心20min，取上清液按最初病毒尸体重量稀释成2000倍液体（W/V），镜检测定美国白蛾核型多角体病毒浓度。

1.9数据分析

应用SPAS软件对上述试验相关数据进行单因素方差分析。

美国白蛾致死中时LT₅₀的计算方法为，将死亡时间（d）作为自变量x，死亡率作为因变量y，进行线性回归分析。然后计算出y=0.5时x的值，即为致死中时LT₅₀。

2.结果与分析

2.1饲养容器对美国白蛾生长发育及存活的影响

表1不同容器饲养美国白蛾生长发育和存活的影响

注：同列不同字母表示彼此间差异显著，以下同。

由表1可以看出，饲养容器不同，对美国白蛾幼虫死亡率、逃逸率、化蛹率、幼虫平均发育历期（3龄初至化蛹的时间）、羽化率、单雌产卵量、卵孵化率等方面均存在显著影响，差异显著。

其中，不同容器中幼虫的死亡率以①为最少，并且幼虫无逃逸现象，而②～⑤，随着容器体积的增加，死亡率逐渐降低，但均在43.00%以上，同①存在显著差异。逃逸率同死亡率相反，②～⑤随着容器体积的增加，逃逸率逐渐增加，最高为49.85%（容器⑤），同①间均差异显著。单就幼虫死亡率和逃逸率而论，以容器①为最佳。

幼虫发育历期也因饲养容器不同而有所差异，随容器体积的增加而增加，其中①与②相同，为17.00d；③与④同为18.00d；⑤增加至18.50d，同上述几种容器饲养下的美国白蛾幼虫发育历期差异显著。单就幼虫发育历期而言，容器①和②中幼虫发育时间最短，可做为饲养美国白蛾的最佳容器。

此外，容器①饲养的美国白蛾化蛹率、蛹羽化率、单雌产卵量以及卵羽化率均为最高，分别为94.25%、92.65%、545.13粒/雌、94.35%，均明显高于容器②～⑤饲养的结果，且前三项同其它容器相比差异显著。

综上所述，使用容器①饲养的美国白蛾幼虫存活、发育等情况均为最好，此为最佳饲养容器。

2.2饲养密度对美国白蛾生长发育及存活的影响

2.2.1饲养密度对幼虫总存活率的影响

表2不同饲养密度下幼虫的累计死亡数

密度	4头/杯	6头/杯	8头/杯	10头/杯	12头/杯
						存活率(%)	90.00a	93.00a	99.75a	94.50a	89.45a

由表2可知，饲养密度对美国白蛾幼虫总存活率存在一定影响，但彼此间无显著差异。其中8头/杯时幼虫总存活率最高，为99.75%，12头/杯时，总存活率最低，为89.45%，二者之间差10.3%。

2.2.2饲养密度对幼虫和蛹重的影响

不同饲养密度下幼虫体重增长情况见图1。

通过图1可以看出，饲养密度的差异对美国白蛾幼虫体重增长情况也存在一定影响。随着3龄美国白蛾幼虫的取食发育，待其发育至预蛹之前，其中8头/杯的幼虫体重值最高，其次为10头/杯、6头/杯，4头/杯和12头/杯的虫体重差异不大。由此可知，在固定容器①的条件下，8头/杯幼虫最有利于其体重的增加。

表3不同饲养密度下的蛹重

密度(头/杯)	4	6	8	10	12
						蛹重（g）	0.2065a	0.2143a	0.2278a	0.2154a	0.2029a

由表3可以看出，饲养密度对美国白蛾蛹重也存在一定的影响。其中8头/杯时蛹重最大，为0.2278g，12头/杯时蛹重最小，为0.2029g，但彼此间差异不显著。在固定容器①的条件下，8头/杯的饲养密度不但最有利于幼虫体重的增加，同样也对应于蛹重。

2.2.3不同饲养密度对美国白蛾生物学特性的影响

表4不同饲养密度对成虫生物学特性的影响

*代表不同密度下饲养100头幼虫，如果雌雄性比为1：1，可以产生的后代个数。

计算公式为：产生后代个数=100×羽化率×1/2×单雌产卵量×孵化率。

由表4可以看出，饲养密度对美国白蛾蛹羽化率、成虫雌雄性比、总产卵量、单雌产卵量以及卵的孵化率和产生后代个数均有显著影响。

其中，蛹羽化率、总产卵量、单雌产卵量、卵孵化率以及产生后代个数均以8头/杯饲养的美国白蛾为最高，92.65%、23467（粒）、545.13粒/雌、94.35%，23926.3（头）。综合上述数据，8头/杯时，有利于繁殖更多的美国白蛾后代，从而最有利于美国白蛾的大量饲养。

2.3饲毒浓度和龄期对美国白蛾排泄的影响

2.3.1饲毒浓度对美国白蛾排泄的影响

表5饲毒浓度对美国白蛾排泄的影响（单位：g）

饲毒浓度

CK

1.0×10⁸

1.0×10⁷

1.0×10⁶

1.0×10⁵

1.0×10⁴

排泄量

0.0143a

0.0078b

0.0084b

0.0081b

0.0079b

通过表5可以看出，饲毒浓度不同对美国白蛾2龄初幼虫的排泄量无显著影响，但同CK均有显著差异。说明HcNPV能抑制美国白蛾幼虫的取食，但室内增殖HcNPV时，接毒浓度对幼虫取食的影响不大。

2.3.2饲毒龄期对美国白蛾排泄的影响

美国白蛾不同龄幼虫取食HcNPV直至死亡或化蛹，其累加排泄量如表6所示。随饲毒龄期的降低，排泄量同CK间差异逐渐加大，由5龄时的0.1216g增加至2龄的0.6170g，说明HcNPV能抑制美国白蛾幼虫的取食。美国白蛾幼虫体内带毒时间越长，HcNPV对其取食量的抑制性越强。

表6饲毒龄期对美国白蛾排泄的影响（单位：g）

排泄量	2龄	3龄	4龄	5龄
					1.0×10⁷	0.0061	0.0532	0.1823	0.2297
CK	0.6231	0.6148	0.5546	0.3513

2.4饲毒浓度和龄期对饲毒虫尸重与病毒含量的影响

2.4.1饲毒龄期对虫尸重和病毒含量的影响

通过表7可以看出，饲喂病毒时的虫龄越小，死后尸体重量越小。2和3龄幼虫饲毒后虫尸体重差异不显著，而与4、5龄虫尸重则有显著差异。而且通过表7还可以发现，虫尸内病毒核型多角体含量与虫尸体重成正比，虫尸体重越大，颗粒体含量越多。因此，室内增殖HcNPV时，还应选取老熟幼虫进行该病毒的复制。由于5龄幼虫饲毒后，有50％个体发育至蛹，没有全部死亡，因此，以4龄幼虫为饲毒虫最佳。

表7饲毒龄期对美国白蛾虫尸重和病毒含量的影响

2.4.2饲毒浓度对虫尸重和病毒含量的影响

由表8可以看出，饲毒浓度对虫尸重和病毒含量有较大影响。其中，饲毒浓度超过1.0×10⁷PIB/ml时，能明显抑制美国白蛾幼虫体重的增长。但是饲毒浓度低于1.0×10⁷PIB/ml时，美国白蛾单头虫尸病毒含量又逐渐下降，可能与饲毒浓度低，在第10天时，部分饲毒虫没有死亡有关。综合上述因素，室内增殖HcNPV时，饲毒浓度以1.0×10⁷PIB/ml为宜。

表8饲毒浓度对美国白蛾虫尸重和病毒含量的影响

Claims

1.一种美国白蛾病毒扩增的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)美国白蛾病毒的扩增

美国白蛾幼虫发育3龄末4龄初时，用消毒的无菌水配制浓度为1.0×10⁷PIB/ml美国白蛾病毒液，并在所述美国白蛾病毒液中加入氯霉素滴眼液，将配制好的病毒液均匀施予饲料表面，晾干，让幼虫取食感染；

2)感毒虫的收集

在幼虫接毒后至80％虫体死亡时，将每杯的虫尸收集；

3)病毒的提取

将收集的病死虫尸加无菌水稀释，搅碎，过滤，将滤液离心后收集沉淀，

其中，所使用的4龄初美国白蛾幼虫是在一特定的容器中进行饲养的，所述容器的杯底直径4.5cm，杯口直径7cm，高8.5cm，且美国白蛾幼虫的饲养密度为8头/杯。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，美国白蛾病毒为美国白蛾核型多角体病毒。

3.根据权利要求1所述的生产方法，所述饲料为人工饲料。

4.根据权利要求1-3任一项所述的生产方法，在步骤3)中滤液离心之前，加水稀释滤渣，过滤，将两次的滤液混合。

5.根据权利要求1-3任一项所述的生产方法，其中过滤使用80目筛子。

6.根据权利要求1-3任一项所述的生产方法，其中，每500ml病毒液中加1管氯霉素滴眼液。