CN104430538A

CN104430538A - 苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂及其工厂化生产工艺

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Publication number: CN104430538A
Application number: CN201410657739.XA
Authority: CN
Inventors: 梁小文; 靳亮; 陈晓燕; 李肖宇; 冯文文; 李英武; 聂影钊
Original assignee: JIANGXI TIANREN ECOLOGY CO Ltd
Current assignee: JIANGXI TIANREN ECOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-11-18
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂，该悬浮剂以质量百分比计包括苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液5～15％、纳米级二氧化硅0.1～0.5％、芳香族氨基酸0.1～0.15％、精制荧光增白剂0.5～1％、木质素磺酸钠0.1～1％、乳化剂656H 1～2％、灭幼脲类似物氟啶脲0.01～0.1％、甘油1～5％和无菌水余量。本发明还公开了一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，包括步骤：苹果蠹蛾卵的获取、苹果蠹蛾卵的处理、苹果蠹蛾健康虫的饲养、苹果蠹蛾颗粒体病毒的复制增殖以及苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的制备。本发明属于生物农药制备技术领域，配方合理，方法易行，操作简便，细菌杀虫效果好，价格经济，成本低廉，省时省力，可实现工厂化大规模加工配制。

Description

苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂及其工厂化生产工艺

技术领域

本发明属于生物农药制备技术领域，具体涉及一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂及其工厂化生产工艺。

背景技术

苹果蠹蛾(Cydia pomonella L.)属鳞翅目，卷叶蛾科，小卷蛾亚科，广泛分布于世界各大洲，主要危害苹果、梨、沙果、桃、杏等果树，是世界性蛀果害虫之一，其危害具有毁灭性，被列为国际检疫性对象。苹果蠹蛾原产于欧亚大陆南部，原始寄主为野生的苹果树，后开始危害苹果栽培品种，并随着苹果栽培品种的扩展而扩大适生范围。自上世纪50年代后期在我国新疆发现苹果蠹蛾以来，至今在疆内连年造成大流行。苹果蠹蛾自上世纪80年代中期传入甘肃省后，已在河西走廊西段造成严重危害，并逐步向东扩散，严重威胁该省东部水果主产区甚至全国的水果生产安全。

目前我国防治苹果蠹蛾还是以菊酯类和有机磷类化学农药为主，但化学农药的大量使用，不仅造成果品的农药残留超标，而且在杀灭害虫的同时也伤害了害虫的天敌，破坏了生态平衡，同时还容易引起害虫的抗药性，不利于有害生物的可持续控制。而在欧洲和美国，主要采用颗粒体病毒(C.pomonella Granulovirus,CpGV)等生物杀虫剂作为治理苹果蠹蛾的主要策略。利用苹果蠹蛾颗粒体病毒防治苹果蠹蛾，是一种环保，专一性很强的生物防治方法。苹果蠹蛾GV在苹果蠹蛾体内进行自我复制增殖，破坏苹果蠹蛾幼虫内部结构致其死亡。这种防治方法具有持续性，能很好地控制苹果蠹蛾病虫害，而且防治成本低，对环境友好。

昆虫病毒杀虫剂的特异性强，只能在活的宿主细胞内增殖，目前多采用野外感染，收集发病昆虫的方式生产病毒杀虫剂。其缺点容易受季节和气候影响，从而使生产病毒杀虫剂的产量极不稳定，不能实现苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫剂工厂化的大规模化生产。

故设计一种工厂化生产苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫剂的生产工艺迫在眉睫。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂及其工厂化生产工艺，该苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂配方合理，使用方便。该苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂工厂化生产工艺方法易行，操作简便。使用该苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂工厂化生产工艺生产的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂，细菌杀虫效果好，价格经济，成本低廉，省时省力，可实现工厂化大规模加工配制，同时也可为其它鳞翅目昆虫的生物杀虫剂工厂化生产工艺以及剂型的设计提供参考。

本发明提供了一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂，以质量百分比计包括苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液5～15％、纳米级二氧化硅0.1～0.5％、芳香族氨基酸0.1～0.15％、精制荧光增白剂0.5～1％、木质素磺酸钠0.1～1％、乳化剂656H1～2％、灭幼脲类似物氟啶脲0.01～0.1％、甘油1～5％和无菌水余量。

所述苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的制备方法为将感染苹果蠹蛾颗粒体病毒幼虫经粉碎、过滤、滤液离心、收集沉淀处理后，按照所述的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的原料及其配比，在该沉淀中加入甘油、纳米级二氧化硅、精制荧光增白剂、芳香族氨基酸、木质素磺酸钠、乳化剂656H、灭幼脲类似物氟啶脲和无菌水，搅拌均匀即可得到苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂。

本发明还提供了一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，包括以下步骤：

将采自野外的苹果蠹蛾蛹装入容器中，室温下羽化成虫并解除滞育。

将羽化后的成虫雌雄搭配成对，放入成虫产卵间进行交配产卵。

将交配产生的卵经消毒后孵出幼虫，接入装有专门配制的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料的苹果蠹蛾幼虫饲养板内，放入健康养虫间内饲养到4龄初。

再将专门配制的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料补装入苹果蠹蛾幼虫饲养板中，饲料表面接上经纯化后的苹果蠹蛾颗粒体病毒，每个饲养板中接入经健康养虫间饲养的4龄初幼虫，放入复制养虫间饲养。

经复制养虫间饲养的感染苹果蠹蛾颗粒体病毒幼虫经粉碎、过滤、滤液离心和收集沉淀处理后，在该沉淀中加入甘油、纳米级二氧化硅、精制荧光增白剂、芳香族氨基酸、木质素磺酸钠、乳化剂656H、灭幼脲类似物氟啶脲和无菌水，搅拌均匀即可得到产品。

所述专门配制的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料以质量百分比计包括豆粕2～10％、全麦粉2～4％、蔗糖1～3％、酵母2～5％、麦胚4～8％、琼脂1.2～1.8％、柠檬酸0.2～0.4％、苹果酸0.2～0.5％、抗坏血酸0.3～0.6％、山梨酸0.2～0.6％、尼泊尔金0.1～0.5％和水65～87％。进一步优选包括豆粕6％、全麦粉3％、蔗糖2％、酵母2％、麦胚6％、琼脂1.5％、柠檬酸0.3％、苹果酸0.4％、抗坏血酸0.6％、山梨酸0.5％、尼泊尔金0.3％和水77.4％。

所述专门配制的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料的制备方法，包括以下步骤：

按照所述的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料的原料及其配比，称取琼脂放入搪瓷量杯中，加入水，置于高压消毒锅内灭菌15分钟。

取出琼脂用搅拌机搅拌，按照所述的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料的原料及其配比，依次缓缓加入柠檬酸，苹果酸，尼泊尔金，酵母，豆粕，全麦粉，麦胚和山梨酸，边加入，边搅拌，待温度降至60～70℃时加入抗坏血酸和蔗糖，混匀后倒入干净的搪瓷盘内冷却，待冷却至20～25℃即可得到用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料，放入4℃冰箱保存备用。

所述苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液的规格为200亿PIB/mL。

所述纳米级二氧化硅的规格为60nm。

所述的室温下羽化成虫并解除滞育，其室温设置为25℃。

所述成虫产卵间内悬挂供成虫产卵用纸条。

所述苹果蠹蛾颗粒体病毒为核型多角体病毒，该核型多角体病毒为单粒包埋型，囊膜大小在0.36×0.19μm，囊膜内包含着一个病毒颗粒。且该核型多角体病毒大多为不规则三角形、四角形或近圆形,直径一般在0.5～2μm之间。

所述饲养室的洁净度为千级，优选为每升空气中粒径≥0.5μm的尘埃粒子数≤35，具有控温、光控及空气循环功能。室顶和四壁使用隔热彩钢板建造，顶部进风口安装空气净化装置及送风机组，功率达循环60次/小时。加温采用空调机，顶及四壁安装日光灯，光照强度优选3000LX以上，顶部安装紫外灯，洁净室入口安装风淋机，保持室内温度在20～25℃间。

本发明的有益效果在于本发明的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂配方合理，使用方便。本发明的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂工厂化生产工艺方法易行，操作简便。使用本发明的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂工厂化生产工艺生产的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂，细菌杀虫效果好，价格经济，成本低廉，省时省力，可实现工厂化大规模加工配制，同时也可为其它鳞翅目昆虫的生物杀虫剂工厂化生产工艺以及剂型的设计提供参考。

下面通过具体实施例对本发明做进一步地说明，但不作为对本发明的限定。

具体实施方式

所述苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺具体地说包括以下步骤：

将采自野外的苹果蠹蛾蛹装入容器中，在25℃下羽化成虫并解除滞育。

将交配产生的卵进行消毒，具体为：将带苹果蠹蛾卵的纱布，优选为40目纱布，置于温度25℃、相对湿度70～80％培养箱中培养，待孵化的卵块变黑时(约6～7天)取出，浸入次氯酸钠溶液中，优选2％(V/V)的次氯酸钠溶液，优选浸渍时间为5分钟，取出后用无菌水洗涤，优选洗涤3次，阴干后放入的冰箱内，优选设置温度为4℃，备用，但储存期超过6个月的虫卵不能再用，然后将消毒的卵块每50粒装入一个由50mm×40mm长方形滤纸折叠成的小盒中。

将经消毒后的卵放入健康虫饲养室孵化至幼虫破壳而出，优选设置饲养室温度为25℃、湿度为70％～80％，优选孵化4～5天后的1龄幼虫。将配制好的专门用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料从冰箱中取出，切成25×30×15mm³大小的方块，每块重约12克，放入玻璃罐头瓶中，每个400毫升的玻璃罐头瓶分装2块。而后及时将1龄幼虫用毛笔接入已装好人工饲料的玻璃罐头瓶中，每个罐头瓶优选接入50头。将接入幼虫的玻璃瓶放在养虫架上，幼虫发育到4龄初时，选留一部分继续饲养传代，另一部分送入复制养虫间饲养。

将提纯的苹果蠹蛾颗粒体病毒稀释成3×10⁶(颗粒体/毫升)悬液，滴于10×10×20mm³人工饲料块表面，以不见明水为宜。待晾干后，每瓶接入4龄初幼虫约50头。处理后的苹果蠹蛾幼虫置于养虫架饲养，温度25℃、相对湿度70～80％。感染后10天每2天检查一次幼虫，收集死虫。病毒致死虫尸于4℃冰箱保存。

将收集的病毒致死虫尸加水稀释，优选为2～3倍。在高速组织捣碎机上，做间断匀浆，优选为2～3分钟，后取出，用纱布过滤。滤液再用筛子过滤，优选筛子为80目，并加水稀释，优选为2～3倍。此滤液用离心机离心，优选转速为16000r/min。将滤液离心后收集沉淀，在该沉淀中加入甘油、纳米级二氧化硅、精致荧光增白剂、芳香族氨基酸、木质素磺酸钠、乳化剂656H、灭幼脲类似物氟啶脲和无菌水，搅拌均匀后得到产品，病毒浓度达到200亿颗粒体/毫升。

所述苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液的规格为200亿PIB/mL。

所述纳米级二氧化硅的规格为60nm。

所述的室温下羽化成虫并解除滞育，其室温设置为25℃。

所述成虫产卵间内悬挂供成虫产卵用纸条。

所述苹果蠹蛾颗粒体病毒为核型多角体病毒，该核型多角体病毒为单粒包埋型，囊膜大小在0.36×0.19μm，囊膜内包含着一个病毒颗粒。且该核型多角体病毒大多为不规则三角形、四角形或近圆形，直径一般在0.5～2μm之间。

下文将结合实施例对本发明做进一步描述。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

表1 苹果蠹蛾幼虫人工饲料以质量百分比计的不同配方

实施例1

将苹果蠹蛾蛹5000头，置于25℃培养箱中，10天后开始羽化，每个产卵容器中放入2对成虫进行交配产卵，而后将交配产生的卵经消毒后孵化出幼虫。

按照表1的配方1进行苹果蠹蛾幼虫人工饲料制作。

加热均匀，将制作好的苹果蠹蛾幼虫人工饲料分装到苹果蠹蛾幼虫饲养板中，将初孵幼虫接入，放入健康养虫间内饲养至4龄，室温设置为25℃。

将饲料分装置苹果蠹蛾幼虫饲养板中，在表面接上浓度为200万PIB/ml苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液。10天后采集病毒病致死幼虫虫尸，处理加工成200亿PIB/ml的苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液。

然后，按质量配比，依次加入200亿PIB/ml苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液15％、60nm二氧化硅0.3％、芳香族氨基酸0.12％、精制荧光增白剂1％、木质素磺酸钠0.2％、乳化剂656H1.5％、氟啶脲0.05％、甘油2％和无菌水余量，再搅拌均匀分装，得到一种乳白色的悬浮剂产品。

实施例2

将苹果蠹蛾蛹10000头，置于25℃培养箱中，10天后开始羽化，每个产卵容器中放入2对成虫进行交配产卵，而后将交配产生的卵经消毒后孵化出幼虫。

按照表1的配方2进行苹果蠹蛾幼虫人工饲料制作。

将饲料分装置苹果蠹蛾幼虫饲养板中，在表面接上浓度为100万PIB/ml苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液。10天后采集病毒病致死幼虫虫尸，处理加工成200亿PIB/ml的苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液。

然后，按质量配比，依次加入200亿PIB/ml苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液10％、60nm二氧化硅0.2％、芳香族氨基酸0.14％、精制荧光增白剂0.8％、木质素磺酸钠0.3％、乳化剂656H1％、氟啶脲0.05％、甘油1.5％和无菌水余量，再搅拌均匀分装，得到一种乳白色的悬浮剂产品。

实施例3

将苹果蠹蛾蛹15000头，置于25℃培养箱中，10天后开始羽化，每个产卵容器中放入2对成虫进行交配产卵，而后将交配产生的卵经消毒后孵化出幼虫。

按照表1的配方3进行苹果蠹蛾幼虫人工饲料制作。

然后，按质量配比，依次加入200亿PIB/ml苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液5％、60nm二氧化硅0.15％、芳香族氨基酸0.14％、精制荧光增白剂0.8％、木质素磺酸钠0.3％、乳化剂656H2％、氟啶脲0.75％、甘油2％和无菌水余量，再搅拌均匀分装，得到一种乳白色的悬浮剂产品。

实施例4

将苹果蠹蛾蛹20000头，置于25℃培养箱中，10天后开始羽化，每个产卵容器中放入2对成虫进行交配产卵，而后将交配产生的卵经消毒后孵化出幼虫。

按照表1的配方4进行苹果蠹蛾幼虫人工饲料制作。

然后，按质量配比，依次加入200亿PIB/ml苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液5％、60nm二氧化硅0.15％、芳香族氨基酸0.14％、精制荧光增白剂0.8％、木质素磺酸钠0.3％、乳化剂656H2％、氟啶脲0.1％、甘油2％和无菌水余量，再搅拌均匀分装，得到一种乳白色的悬浮剂产品。

实施例5结果与分析

表2 对苹果蠹蛾幼虫的杀虫效果对比

注：同列数据后标不同大、小写字母表示在5％水平上分别于灭幼脲、空白对照差异性显著。

综上所述：本发明的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫剂均具有很好的防治苹果蠹蛾的效果，其中实施例3中的配方效果接近灭幼脲，效果好于商业化株系Cypo-GV(France)(法国株苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫剂)。

本发明的有益效果在于本发明的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂配方合理，组分更完善，使用方便。本发明的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂工厂化生产工艺方法易行，操作简便。使用本发明的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂工厂化生产工艺生产的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂，杀虫效果好，悬浮性更强，储存时间更长。在田间应用时对紫外光有较好的防护作用，病毒持续作用时间延长，防治效果明显，价格经济，成本低廉，省时省力，可实现工厂化大规模加工配制，同时也可为其它鳞翅目昆虫的生物杀虫剂工厂化生产工艺以及剂型的设计提供参考。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims

1.一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂，其特征在于，以质量百分比计包括苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液5～15％、纳米级二氧化硅0.1～0.5％、芳香族氨基酸0.1～0.15％、精制荧光增白剂0.5～1％、木质素磺酸钠0.1～1％、乳化剂656H 1～2％、灭幼脲类似物氟啶脲0.01～0.1％、甘油1～5％和无菌水余量。

2.如权利要求1所述的一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂，其特征在于所述悬浮剂的制备方法为将感染苹果蠹蛾颗粒体病毒幼虫经粉碎、过滤、滤液离心、收集沉淀处理后，按照权利要求1所述的苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的原料及其配比，在该沉淀中加入甘油、纳米级二氧化硅、精制荧光增白剂、芳香族氨基酸、木质素磺酸钠、乳化剂656H、灭幼脲类似物氟啶脲和无菌水，搅拌均匀即可得到苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂。

3.一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：

将采自野外的苹果蠹蛾蛹装入容器中，室温下羽化成虫并解除滞育；

将羽化后的成虫雌雄搭配成对，放入成虫产卵间进行交配产卵；

将交配产生的卵经消毒后孵出幼虫，接入装有专门配制的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料的苹果蠹蛾幼虫饲养板内，放入健康养虫间内饲养到4龄初；

再将专门配制的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料补装入苹果蠹蛾幼虫饲养板中，饲料表面接上经纯化后的苹果蠹蛾颗粒体病毒，每个饲养板中接入经健康养虫间饲养的4龄初幼虫，放入复制养虫间饲养；

4.如权利要求3所述的一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，其特征在于所述专门配制的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料包括豆粕、全麦粉、蔗糖、酵母、麦胚、琼脂、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、山梨酸、尼泊尔金和水。

5.如权利要求4所述的一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，其特征在于所述专门配制的用以工厂化饲养苹果蠹蛾幼虫的人工饲料以质量百分比计包括豆粕2～10％、全麦粉2～4％、蔗糖1～3％、酵母2～5％、麦胚4～8％、琼脂1.2～1.8％、柠檬酸0.2～0.4％、苹果酸0.2～0.5％、抗坏血酸0.3～0.6％、山梨酸0.2～0.6％、尼泊尔金0.1～0.5％和水65～87％。

6.如权利要求3所述的一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，其特征在于所述苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液的规格为200亿PIB/mL，所述纳米级二氧化硅的规格为60nm。

7.如权利要求3所述的一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，其特征在于所述苹果蠹蛾颗粒体病毒为核型多角体病毒。

8.如权利要求3所述的一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，其特征在于所述的室温下羽化成虫并解除滞育，其室温设置为25℃。

9.如权利要求3所述的一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，其特征在于所述成虫产卵间内悬挂供成虫产卵用纸条。

10.如权利要求3所述的一种苹果蠹蛾颗粒体病毒杀虫悬浮剂的工厂化生产工艺，其特征在于所述饲养室的洁净度为千级，具有控温、光控及空气循环功能，保持室内温度在20～25℃间。