CN101889583B - 一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂及制备方法，其步骤是：A．从果园里的苹果蠹蛾虫尸中提取苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV），用改进的人工饲料进行苹果蠹蛾的人工饲养并增殖CpGV；B．将增殖得到的CpGV稀释为悬液；C．筛选到对苹果蠹蛾幼虫有活性的Bt菌株，离心回收菌体；D．向收集的菌体中加入轻质碳酸钙、农乳700#、渗透剂JFC和食盐，搅拌均匀；E．Bt-CpGV复配剂的配制：24,000IU/毫克的Bt可湿性粉剂与300亿颗粒体/毫升CpGV悬液，按30-5:1的比例体积比混合均匀，冷冻干燥后制成复配的可湿性粉剂。配方合理，使用方便，方法易行，操作简便，实现工厂化加工配制，细菌杀虫速度较快。
Description
技术领域
本发明属于绿色杀虫剂增效生物农药技术领域，更具体涉及一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，同时还涉及一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂的制备方法，即苏云金芽胞杆菌（Bt）与苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）复配的生物杀虫剂，该生物杀虫剂能代替国内当前施用的化学杀虫剂有效防治苹果蠹蛾的为害。
背景技术
苹果蠹蛾（Cydia pomonella L.）是世界性检疫害虫，自上世纪50年代后期在新疆发现以来，至今连年在疆内大流行。近年来，苹果蠹蛾在新疆每年使几十万公顷果树受害，造成减产30-50%，每年损失30多亿元。苹果蠹蛾自上世纪80年代中期传入甘肃省后，已在河西走廊西段造成严重危害，并逐步向东扩散，严重威胁该省东部水果主产区甚至全国水果生产的安全（秦晓辉等，植物检疫，2006，20: 95-96）。目前我国防治苹果蠹蛾还是以菊酯类和有机磷类化学农药为主，但化学农药的大量使用，不仅造成果品的农药残留超标，而且在杀灭害虫的同时也伤害了害虫的天敌，破坏了生态平衡，同时还容易引起害虫的抗药性，不利于有害生物的可持续控制。而在欧洲和美国，主要采用颗粒体病毒（C. pomonella Granulovirus, CpGV）等生物杀虫剂作为治理苹果蠹蛾的主要策略。
相比于化学杀虫剂，苏云金芽胞杆菌（Bt）和昆虫病毒是环境相容性好的微生物杀虫剂，在农林害虫（特别是抗药性害虫）的可持续治理方面发挥了重要作用，是21世纪最具发展前景的生物杀虫剂。但目前无论是Bt还是病毒杀虫剂都存在杀虫谱窄、剂型单一等缺点，这些缺点导致了我国目前除棉铃虫NPV每年用于田间防治的面积稍大外，其它病毒制剂应用规模都很小。
对于一些重要农业害虫，如苹果蠹蛾、玉米螟和稻纵卷叶螟等，Bt的活性较低。而对于一些杀虫谱较广的病毒，如苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica NPV, AcNPV）和甘蓝夜蛾核多角体病毒（Mamestra brassicae NPV, MbNPV），只是对少数几种昆虫的杀虫活性较高，对其它昆虫虽然可以感染，但感染率较低。此外，长期大量使用一种微生物杀虫剂能够使昆虫产生抗性。例如在欧洲一些国家，CpGV的长期大量使用会使苹果蠹蛾对其产生抗性（Asser-Kaiser et al., Science, 2007, 317: 1916-1918）。有报道表明，害虫对Bt也产生越来越严重的抗性（Ferré J, et al. Annu Rev Entomol, 2002, 47: 501-33）。
为了解决害虫对单一制剂产生抗性的问题，目前国内外常用的方法是将两种作用机制不同的杀虫剂复配，如Bt与阿维菌素复配、病毒与化学农药复配等等。由于Bt与昆虫病毒杀虫的作用机制不同，将二者复配将能够有效预防目标昆虫对其中单一制剂抗药性的产生。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，配方合理，使用方便，安全环保，没有任何毒性和副作用，长期使用害虫不容易产生抗性。病毒与细菌的复配，能发挥活体生物的双重杀虫效果。细菌杀虫速度较快，但不能在害虫种群中形成流行病；病毒对害虫的致死时间较长，但能够在种群中形成流行病；同时，颗粒体病毒的增效蛋白可以降解昆虫的围食膜，增加细菌的杀虫效果。二者的复配，能充分发挥它们的杀虫效果同时互相弥补对方的不足。Bt-CpGV复配剂的田间防效和化学杀虫剂高效氯氰菊酯相当，而CpGV单剂也能够有效地防治苹果蠹蛾的为害，防效与复配制剂相当。
本发明的另一个目的是在于提供了一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂的制备方法，方法易行，操作简便，既可以实现工厂化加工配制，也可以分装成小包装由使用者根据田间情况现用现配，效果更好。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种Bt与CpGV复配的生物杀虫剂，复配制剂中Bt可湿性粉剂的含量为8000-24000 IU/毫克，苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）的含量为1-6百万颗粒体（OB）/毫克。该技术解决了苏云金芽胞杆菌对苹果蠹蛾毒力不高、颗粒体病毒单独使用成本较高、苹果蠹蛾对Bt及病毒单剂容易产生抗性等问题。
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，它由下述重量百分比的原料制成：
苹果蠹蛾颗粒体病毒悬浮剂的配制：苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）终浓度为300亿颗粒体/毫克，其它助剂成分由如下原料组成：
原料 重量百分比%
甘油 2-7%
木质素磺酸钠 0.2-0.8%
乳化剂656 H 1-2%
水 90.2-96.8%。
所述的苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）终浓度为300亿颗粒体/毫克，不占本发明的比重。
苹果蠹蛾颗粒体病毒悬浮剂的配制：CpGV终浓度为300亿颗粒体/毫克，其它助剂成分由如下原料组成（优选范围）：
原料 重量百分比%
甘油 3-6%
木质素磺酸钠 0.3-0.7%
乳化剂656 H 1.2-1.8%
水 91.2-95.8%。
苹果蠹蛾颗粒体病毒悬浮剂的配制：CpGV终浓度为300亿颗粒体/毫克，其它助剂成分由如下原料组成（最好范围）：
原料 重量百分比%
甘油 4-5%
木质素磺酸钠 0.4-0.6%
乳化剂656 H 1.3-1.7%
水 92.2-94.8%。
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，每毫克制剂中含有的各成分如下：
苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂的配制：Bt的最终有效成分含量为8,000 IU/毫克-24,000 IU/毫克，其它助剂成分由如下原料组成：
原料 每毫克制剂中的含量
轻质碳酸钙 120-210微克/毫克
农乳700# 12-17微克/毫克
渗透剂JFC 12-18微克/毫克
食盐 30-45微克/毫克。
苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂的配制：Bt的最终有效成分含量为8,000 IU/毫克-24,000 IU/毫克，其它助剂成分由如下原料组成（优选范围）：
原料 每毫克制剂中的含量
轻质碳酸钙 140-170微克/毫克
农乳700# 14-16微克/毫克
渗透剂JFC 13-16微克/毫克
食盐 35-42微克/毫克。
苏云金芽胞杆菌可湿性粉剂的配制：Bt的最终有效成分含量为8,000 IU/毫克-24,000 IU/毫克，其它助剂成分由如下原料组成（最好范围）：
原料 每毫克制剂中的含量
轻质碳酸钙 150-165微克/毫克
农乳700# 15-16微克/毫克
渗透剂JFC 14-15微克/毫克
食盐 37-40微克/毫克。
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，每毫克制剂中含有的各成分如下：
苹果蠹蛾颗粒体病毒与苏云金芽胞杆菌复配型粉剂的配制，每毫克粉剂中含有的各成分如下：
原料 每毫克制剂中的含量
苏云金芽胞杆菌 8000-24000 IU/毫克
苹果蠹蛾颗粒体病毒 1-6百万颗粒体/毫克
农乳700# 12-17微克/毫克
木质素磺酸钠 0.13-0.52微克/毫克
渗透剂JFC 10-20微克/毫克
食盐 32-43微克/毫克。
苹果蠹蛾颗粒体病毒与苏云金芽胞杆菌复配型粉剂的配制，每毫克粉剂中含有的各成分如下（优选范围）：
原料 每毫克制剂中的含量
苏云金芽胞杆菌 10000-21000 IU/毫克
苹果蠹蛾颗粒体病毒 1.5-5百万颗粒体/毫克
农乳700# 13-16微克/毫克
木质素磺酸钠 0.23-0.45微克/毫克
渗透剂JFC 12-18微克/毫克
食盐 35-40微克/毫克。
苹果蠹蛾颗粒体病毒与苏云金芽胞杆菌复配型粉剂的配制，每毫克粉剂中含有的各成分如下（最好范围）：
原料 每毫克制剂中的含量
苏云金芽胞杆菌 16000-18000 IU/毫克
苹果蠹蛾颗粒体病毒 2-4百万颗粒体/毫克
农乳700# 14-15微克/毫克
木质素磺酸钠 0.33-0.40微克/毫克
渗透剂JFC 14-16微克/毫克
食盐 37-39微克/毫克。
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂的制备方法，其步骤如下：
1．从果园里发现的苹果蠹蛾虫尸中提取纯化苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV），用改进的人工饲料（根据Ivaldi-Sender, C. Ann. Zool. Ecol. Anim., 1974, 6:337-343改进）进行苹果蠹蛾的人工大规模饲养，并大量增殖苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV），经过对苹果蠹蛾幼虫的生物活性测定表明，苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）对该虫具有较高的毒力；
2．将增殖得到的苹果蠹蛾颗粒体病毒稀释为高于目标浓度的悬液，向其中加入一定量的甘油、木质素磺酸钠和农用乳化剂656 H，搅拌均匀，并加入一定量的水，制备成苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）悬浮剂（甘油浓度达到2-7%，木质素磺酸钠浓度达到0.2-0.8%，乳化剂656 H浓度达到1-2%，病毒浓度达到300亿颗粒体/毫升），病毒浓度达到300亿颗粒体/毫升。
3．筛选到2个对苹果蠹蛾幼虫有活性的Bt菌株，即Bt C-33（Gao et al., Biol. control, 2008, 44: 380-388）或kurstakistandard。参照中国专利02138712.5的方法，用牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 5克/升，pH 7.0-7.5）在30°C培养Bt C-33或kurstakistandard菌株72 h，离心回收菌体；
4．向收集的菌体中加入一定量的轻质碳酸钙、农乳700#、渗透剂JFC和食盐，搅拌均匀，最终使轻质碳酸钙的含量达到120-200微克/毫克，农乳700#的含量达到12-17微克/毫克，渗透剂JFC的含量达到12-18微克/毫克，食盐的含量达到30-45 微克/毫克，加工成Bt的有效含量为16,000 IU/毫克-24,000 IU/毫克的可湿性粉剂；
5．Bt-CpGV复配剂的配制：24,000 IU/毫克的Bt可湿性粉剂与300亿颗粒体/毫升苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液，按30-5:1的比例（重量：体积比）混合均匀，冷冻干燥后制成复配的可湿性粉剂。复配的可湿性粉剂中农乳700#的含量达到12-17微克/毫克，木质素磺酸钠的含量达到0.13-0.52微克/毫克，渗透剂JFC的含量达到10-20微克/毫克，食盐的含量达到32-43微克/毫克，Bt的含量为8,000-24,000 IU/毫克，苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）的含量为1-6百万颗粒体/毫克。
所述的Bt可湿性粉剂为16,000 IU/毫克，稀释600-1,500倍后田间施用可对苹果蠹蛾起到较好的防效；所述的苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）悬浮剂为300亿颗粒体/毫升，稀释8,000-20,000倍后施用可有效防治苹果蠹蛾；所述的Bt-CpGV复配剂中Bt含量为8,000-24,000 IU/毫克、苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）含量为1-6百万颗粒体/毫克，用于田间防治可以有效防治苹果蠹蛾的为害，防效好于Bt可湿性粉剂单独使用，而且其生产成本大大低于苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）悬浮剂。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和和效果：
本发明提供的CpGV及Bt-CpGV复配剂属于微生物杀虫剂，这两种杀虫剂仅作用于无脊椎动物，对环境友好，是取代当前果园施用的化学杀虫剂的理想药剂。与国内当前果园施用的化学杀虫剂相比，本发明提供的微生物杀虫剂具有如下特色：
1. CpGV能够经过人工饲养的昆虫感染病毒进行大量的增殖，而Bt可以通过室内发酵制备，二者的制备方法简便，产量大。
2. CpGV单剂可以有效地防治苹果蠹蛾的为害。将CpGV-Bt复配剂投入田间施用，其对苹果蠹蛾的防效明显好于Bt可湿性粉剂单独施用，其效果与化学杀虫剂高效氯氰菊酯的防效无明显差异（表1）。
3. Bt-CpGV复配剂配方合理，使用方便，节能环保，没有任何毒性和副作用。
4. 该发明与目前国内正在使用的苹果蠹蛾防治技术相比，突出优点是所用的杀虫剂全部为微生物杀虫剂，不含任何化学杀虫剂成分，不仅防治效果好，而且无残留，对人、畜无影响，不污染环境。
5. 用CpGV、Bt，特别是Bt-CpGV复配剂防治苹果蠹蛾的危害，更是国内首创，相对于病毒，Bt的杀虫效果较快，但不能造成昆虫种群中的流行病，而病毒的存在，不仅可以杀死直接感染的昆虫，还可以引发昆虫的流行病，可以达到一年防治多年有效的效果。二者的混用，不仅能够克服苹果蠹蛾对单剂产生严重抗性的问题，而且可以提供更快、更持久的防治效果。
表 1 不同药剂处理后的虫果率
CK为对照处理，施用清水；虫果率（%）=100 × 虫果树/调查的总果数；调查数据用单因素方差分析（one-way ANOVA; P < 0.05），同一列中数据后的不同字母代表差异显著。
附图说明
图1为一种CpGV对苹果蠹蛾幼虫的杀虫活性示意图
图2为一种3个Bt菌株对苹果蠹蛾幼虫的杀虫活性示意图
图3A为一种药剂对苹果蠹蛾的田间防治效果示意图
图3B为一种药剂对苹果蠹蛾的田间防治效果示意图
图3C为一种药剂对苹果蠹蛾的田间防治效果示意图
图3D为一种药剂对苹果蠹蛾的田间防治效果示意图。
具体实施方式
实施例1：
一种抗苹果蠹蛾生物杀虫剂，它由下述重量百分比的原料制成(%)：苹果蠹蛾颗粒体病毒悬浮剂的配制：CpGV终浓度为300亿颗粒体/毫升，其它成分由如下原料组成：
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂的制备方法，其步骤如下：
1．苹果蠹蛾的人工饲养
苹果蠹蛾人工饲料成分及用量（根据Ivaldi-Sender, C. Ann. Zool. Ecol. Anim., 1974, 6:337-343改进）：水800毫升，琼脂20克，玉米粉50克，麦芽粉50克，啤酒酵母50克，复合维生素B、C 6克，苯甲酸钠2克，尼泊金乙酯2克。配制时称取20克琼脂放入1000 毫升搪瓷量杯中，加入800毫升水，置高压消毒锅内15磅灭菌15分钟，取出琼脂用搅拌机搅拌，依次缓缓加入苯甲酸钠，尼泊金乙酯，啤酒酵母，玉米粉，麦芽粉等，边加入边搅拌，待温度降至60-70°C时加入复合维生素B、C，混匀后倒入干净的搪瓷盘内，冷却至室温（20-25°C）后，放入4°C冰箱备用。
将带苹果蠹蛾卵的纱布置于温度25°C、相对湿度70-80%培养箱中培养，待孵化的卵块变黑时（约6-7天）取出，浸入4%（体积/体积）的福尔马林溶液中10分钟，用无菌水漂洗2-3次，放在灭菌的滤纸上吸干水份。然后将消毒的卵块每50粒装入一个由25 mm × 20 mm长方形滤纸折叠成的小盒中。将配制好的人工饲料从冰箱中取出，切成25 × 30 × 15 mm3大小的方块，每块重约12克。每个400毫升的玻璃罐头瓶分装2块。然后将装好的卵用镊子放入罐头瓶内，用灭菌的黑布盖住瓶口，并用橡皮筋捆好上架。
当大部分幼虫达四龄初期时，选留一部分继续饲养传代，另一部分送入感染室。
2．CpGV的大规模增殖
将苹果蠹蛾人工饲料切成约10 × 10 × 30 mm3块状，置于罐头瓶，铺满瓶底。将提纯的多角体稀释成3 × 106 颗粒体/毫升）悬液，滴于人工饲料块表面，以不见明水为宜。待晾干后，每瓶接入4龄初幼虫约50头。处理后的苹果蠹蛾幼虫置于养虫架饲养，温度25°C、相对湿度70-90%。感染后10天每2天检查一次幼虫，收集死虫。病毒致死虫尸于4°C冰箱保存。
3．CpGV的提纯和计数
用差速离心法纯化苹果蠹蛾颗粒体病毒（Sun et al.，J. Invertebr. Pathol., 2002, 81: 63-69）。收集感染病毒而死的虫尸，加入去离子水，匀浆，用四层纱布过滤。滤液于4000 × g离心35 min，弃上清，然后将沉淀重悬于去离子水中，800 × g离心5 min，弃沉淀，上层溶液再于4000 × g离心35 min。用上面程序进行至少3次差速离心，直至得到灰白色纯净的颗粒体沉淀。将沉淀吹散于去离子水或磷酸缓冲液中，4°C保存备用。病毒悬液浓度用标准的血球计数板来检测。
4．CpGV悬浮剂的制备
将增殖得到的苹果蠹蛾颗粒体病毒稀释为高于目标浓度的悬液，向其中加入一定量的甘油、木质素磺酸钠和农用乳化剂656 H，搅拌均匀，并加入一定量的水，使甘油浓度达到4%，木质素磺酸钠浓度达到0.5%，乳化剂656 H浓度达到2%，病毒浓度达到300亿颗粒体/毫升。
一种抗苹果蠹蛾的昆虫病毒，苹果蠹蛾颗粒体病毒，通过如下步骤测试其对苹果蠹蛾3龄幼虫的杀虫活性：
1．苹果蠹蛾颗粒体病毒的获得：从田间采集到的苹果蠹蛾虫尸分离得到CpGV，悬浮于蒸馏水。病毒悬液浓度用标准的血球计数板来检测；
2．苹果蠹蛾颗粒体病毒的增殖：挑选大小均一的苹果蠹蛾3龄幼虫，置于无菌的24孔板，25°C饥饿培养24 h。将CpGV稀释成1×105颗粒体/毫升的感染液，随后将人工饲料切成2 mm3的小块加入24孔养虫板中，把稀释好的病毒感染液均匀喷涂于人工饲料上饲养苹果蠹蛾幼虫，保持养虫板内的湿度。待饲料吃完后补加新鲜的不含病毒的饲料。从感染后48 h开始，每天收集因感染病毒而死的虫尸；
3．苹果蠹蛾颗粒体病毒的纯化和计数：用差速离心法纯化CpGV（Sun et al.，J. Invertebr. Pathol., 2002, 81: 63-69）。收集感染病毒而死的虫尸，加入去离子水，匀浆，用四层纱布过滤。滤液于4000 × g离心35 min，弃上清，然后将沉淀重悬于去离子水中，800 × g离心5 min，弃沉淀，上层溶液再于4000 × g离心35 min。用上面程序进行至少3次差速离心，直至得到灰白色纯净的颗粒体沉淀。将沉淀吹散于去离子水或磷酸缓冲液中，4°C保存备用。病毒悬液浓度用标准的血球计数板来检测。
4．苹果蠹蛾颗粒体病毒对苹果蠹蛾幼虫的毒力：生测采用Droplet法（Hughes et al., J. Invertebr. Pathol., 1986, 48: 187-192）。用血球计数板对CpGV进行浓度测定，以1×107 颗粒体/毫升CpGV 溶液为母液，稀释为五个浓度，见表 2。每个浓度两个重复，每个重复24头幼虫，将取食了药剂的幼虫重新放入加有10 × 10 × 30 mm3人工饲料的24孔板，25°C恒温培养，每隔24 h 观察幼虫死亡情况并做好记录，直至所有试虫死亡或者化蛹，用SPSS统计软件对试验数据进行统计分析；
5．统计结果表明，随着浓度的增加，3龄苹果蠹蛾幼虫死亡率增加明显（图 1），而对照组也没有试虫死亡，CpGV 对3龄苹果蠹蛾幼虫的LC50分别7.73 × 105颗粒体/毫升，表明苹果蠹蛾幼虫对CpGV 较为敏感。
表 2 不同浓度CpGV 的配制
实施例2：
一种抗苹果蠹蛾的Bt C-33菌株，通过如下步骤测试其对苹果蠹蛾3龄幼虫的杀虫活性：
1．将Bt C-33菌株转接到含有牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 5克/升，琼脂粉15克/升，pH 7.0-7.5）的培养皿中，30°C倒置培养72 h，挑选产生伴孢晶体的单菌落；
2．将单菌落接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 5克/升，pH 7.0-7.5）中，在30°C、200转/分钟的摇瓶中发酵，至伴孢晶体脱落，即为发酵液；
3．用考马斯亮蓝G-250法（Bradfold, Analyt Biochem., 1976, 72: 248-254）测定Bt C-33毒素蛋白浓度，以2倍稀释法，分别将发酵液稀释为36.12、18.06、9.03、4.52、2.26 微克/毫升 5个浓度；
4．生测采用Droplet法，用上述不同浓度的Bt溶液分别喂食经过饥饿的3 龄苹果蠹蛾幼虫，每个浓度两个重复，每个重复24头幼虫，将取食了药剂的幼虫重新放入加有人工饲料的24孔板，25°C恒温培养，每隔24 h观察幼虫死亡情况并做好记录，直至72 h；
5．用SPSS统计软件对试验数据进行统计分析，结果表明，随着浓度的增加，用Bt C-33处理的3龄苹果蠹蛾幼虫死亡率增加明显，其LC50为20.43 ± 7.05微克/毫升（图 2）。
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，每毫克制剂中含有的各成分如下：
苏云金芽胞杆菌Bt C-33可湿性粉剂的配制：Bt的最终有效成分含量为16,000 IU/毫克，其它助剂成分由如下原料组成：
原料 每毫克制剂中的含量
轻质碳酸钙 160 微克/毫克
农乳700# 15.5 微克/毫克
渗透剂JFC 14.5 微克/毫克
食盐 38 微克/毫克
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂的制备方法，其步骤如下：
1．配制牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 5克/升，pH 7.0-7.5），转入发酵罐中，121°C灭菌20 min；
2．将发酵培养基重量的0.003%的Bt C-33菌种放入60°C的温水中30 min，制成孢子悬液，待培养基温度降至37°C时，把孢子悬液放入发酵罐中；
3．在32°C、400转/分钟、通气量2 m3/分钟的条件下发酵10 h，随后在29°C、500转/分钟、通气量2.5 m3/分钟的条件下发酵12 h，最后，在32°C、500转/分钟、通气量2.5 m3/分钟的条件下发酵15 h，在芽孢脱落50%时终止发酵，用HCl将发酵液的pH值调至4.5；
4．干燥发酵液，向其中加入一定量的轻质碳酸钙、农乳700#、渗透剂JFC和食盐，搅拌均匀，最终使轻质碳酸钙的含量达到160 微克/毫克，农乳700#的含量达到15.5 微克/毫克，渗透剂JFC的含量达到14.5 微克/毫克，食盐的含量达到38 微克/毫克，分别加工成Bt的有效含量为16,000 IU/毫克-24,000 IU/毫克的可湿性粉剂；
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，每毫克制剂中含有的各成分如下：
其制备步骤同上。
实施例3：
一种抗苹果蠹蛾的Bt kurstakistandard菌株，通过如下步骤测试其对苹果蠹蛾3龄幼虫的杀虫活性：
1．将Bt kurstakistandard菌株转接到含有牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 5克/升，琼脂粉15克/升，pH 7.0-7.5）的培养皿中，30°C倒置培养72 h，挑选产生伴孢晶体的单菌落；
2．将单菌落接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 5克/升，pH 7.0-7.5）中，在30°C、200转/中的摇瓶中发酵，至伴孢晶体脱落，即为发酵液；
3．用考马斯亮蓝G-250法测定Bt kurstakistandard毒素蛋白浓度，以2倍稀释法，分别将发酵液稀释为26.46、13.23、6.62、3.31、1.66微克/毫升5个浓度；
4．生测采用Droplet法，用上述稀释成不同浓度的Bt溶液分别喂食经过饥饿的3龄苹果蠹蛾幼虫，每个浓度两个重复，每个重复24头幼虫，将取食了药剂的幼虫重新放入加有人工饲料的24孔板，25°C恒温培养，每隔24 h观察幼虫死亡情况并做好记录，直至72 h；
5．用SPSS统计软件对试验数据进行统计分析，结果表明，随着浓度的增加，用Bt kurstakistandard处理的3龄苹果蠹蛾幼虫死亡率增加明显，其LC50为15.69±1.06微克/毫升（图2）。
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，每毫克制剂中含有的各成分如下：
苏云金芽胞杆菌Bt kurstakistandard可湿性粉剂的配制：Bt的最终有效成分含量为16,000 IU/毫克，其它助剂成分由如下原料组成：
原料 每毫克制剂中的含量
轻质碳酸钙 170 微克/毫克
农乳700# 15 微克/毫克
渗透剂JFC 15.5 微克/毫克
食盐 40 微克/毫克
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂的制备方法，其步骤如下：
1．配制牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 5克/升，pH 7.0-7.5），转入发酵罐中，121°C灭菌20 min；
2．将发酵培养基重量的0.0025%的Bt kurstakistandard菌种放入60°C的温水中30 min，制成孢子悬液，待培养基温度降至37°C时，把孢子悬液放入发酵罐中；
3．在32°C、400转/分钟、通气量2 m3/分钟的条件下发酵10 h，随后在29°C、500转/分钟、通气量2.5 m3/分钟的条件下发酵12 h，最后，在32°C、500转/分钟、通气量2.5 m3/分钟的条件下发酵15 h，在芽孢脱落50%时终止发酵，用HCl将发酵液的pH值调至4.5；
4．干燥发酵液，向其中加入一定量的轻质碳酸钙、农乳700#、渗透剂JFC和食盐，搅拌均匀，最终使轻质碳酸钙的含量达到170微克/毫克，农乳700#的含量达到15微克/毫克，渗透剂JFC的含量达到15.5微克/毫克，食盐的含量达到40微克/毫克，加工成Bt的有效含量为16,000 IU/毫克-24,000 IU/毫克的可湿性粉剂；
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，每毫克制剂中含有的各成分如下：
其制备步骤同上。。
实施例4：
一种抗苹果蠹蛾生物杀虫剂，每毫克制剂中含有的各成分如下：：
Bt-CpGV复配型可湿性粉剂的配制：CpGV终浓度为200万颗粒体/毫克，Bt kurstakistandard的有效成分含量为16,000 IU/毫克，其它成分由如下原料组成：
原料 每毫克制剂中的含量
渗透剂JFC 16微克/毫克
农乳700# 14.5微克/毫克
木质素磺酸钠 0.35微克/毫克
食盐 38微克/毫克
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂的制备方法，其步骤如下：
1．按照实施例1中的方法和步骤制备300亿颗粒体/毫升的 CpGV悬浮剂；
2．按照实施例3中的方法和步骤制备24,000 IU/毫克的Bt kurstakistandard可湿性粉剂；
3．24,000 IU/毫克的Bt kurstakistandard可湿性粉剂与300亿颗粒体/毫升苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液，按15:1的比例（重量：体积比）混合均匀，冷冻干燥后制成复配的可湿性粉剂。复配的可湿性粉剂中Bt的含量为16000 IU/毫克，CpGV的含量为2百万颗粒体/毫克，调整渗透剂JFC、农乳700#、木质素磺酸钠、食盐的量，使其最终含量分别为16微克/毫克、14.5微克/毫克、0.35微克/毫克、38微克/毫克；
一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂，每毫克制剂中含有的各成分如下：
其制备步骤同上。
抗苹果蠹蛾生物杀虫剂的田间应用效果
1．选择5亩长势良好的苹果果园，对Bt-CpGV复配制剂（Bt 16000 IU/毫克 + CpGV 2百万颗粒体/毫克），与300亿颗粒体/毫升 CpGV悬浮剂、16000 IU/毫克 Bt可湿性粉剂以及化学防治药剂高效氯氰菊酯（5%水乳剂）进行田间杀虫效果对比。所述的Bt-CpGV复配剂田间施用时稀释900倍施用；所述的CpGV为300亿颗粒体/毫升悬浮剂，稀释12,500倍后施用；所述的Bt为16,000 IU/毫克可湿性粉剂，田间施用时稀释900倍施用；所述的高效氯氰菊酯为市售的5%水乳剂，稀释375倍后施用。
2．第一代雄蛾诱捕高峰期后2天开始施药，共施药2次，间隔10天。起始蛀果率从第1次施药前1天调查，从第1次施药后，每隔10天调查一次，共3次。每棵果树标记果实较多长势均匀的树枝，每种处理随机调查1,000个果，分别记录被苹果蠹蛾为害的果实和健康果实的数量，并按照下列公式计算田间防效：虫果率（%）=100 × 虫果数/调查果总数。
3．施药之前每种处理之间的虫果率没有明显差异（图3A）；药后10 天的虫果率均有增加，但统计结果表明，对照的虫果率高于各药剂处理后的虫果率，且差异明显，而不同药剂处理之间的虫果率并没有明显的差异（图 3B）；在药后20 天，用高效氯氰菊酯处理的小区虫果率的增加幅度最小，CpGV 处理的小区与其没有显著性差异，同时与Bt-CpGV复配剂处理的小区内虫果率也没有明显差异，但与Bt 可湿性粉剂单独处理后的虫果率有明显差异，对照区的虫果率增幅明显高于各药剂处理的虫果率增幅（图3C）；药后30天，Bt-CpGV混合制剂可以有效防治苹果蠹蛾的为害，其防效与化学农药高效氯氰菊酯并无明显差异，而CpGV单剂的防效也较好，与Bt-CpGV混合制剂相当（图3D）；无论是CpGV悬浮剂还是Bt-CpGV混合制剂都可以作为防治苹果蠹蛾为害的理想药剂，从其防效上看，二者足可以取代当前果园施用的化学杀虫剂，同时，Bt-CpGV混合制剂的生产成本低于CpGV悬浮剂。
Claims (1)
1.一种抗苹果蠹蛾的生物杀虫剂的制备方法，其步骤是：
A．从果园里的苹果蠹蛾虫尸中提取纯化苹果蠹蛾颗粒体病毒，用改进的人工饲料进行苹果蠹蛾的人工饲养，并增殖苹果蠹蛾颗粒体病毒；
B．将增殖得到的苹果蠹蛾颗粒体病毒稀释为悬液，向其中加入甘油、木质素磺酸钠和乳化剂656 H，搅拌均匀，并加入水，制备成CpGV悬浮剂，甘油浓度达到2-7%，木质素磺酸钠浓度达到0.2-0.8%，乳化剂656 H浓度达到1-2%，病毒浓度达到300亿颗粒体/毫升；
C．选择2个对苹果蠹蛾幼虫有活性的Bt菌株，分别接种于液体培养基，在30°C培养Bt C-33或kurstaki standard菌株72 h，离心回收菌体；
D．向收集的菌体中加入轻质碳酸钙、农乳700#、渗透剂JFC和食盐，搅拌均匀，最终使轻质碳酸钙的含量达到120-200微克/毫克，农乳700#的含量达到12-17微克/毫克，渗透剂JFC的含量达到12-18微克/毫克，食盐的含量达到30-45微克/毫克，加工成Bt的有效含量为8000 IU/毫克-24000 IU/毫克的可湿性粉剂；
E．Bt-CpGV复配剂的配制：24000 IU/毫克的Bt可湿性粉剂与300亿颗粒体/毫升苹果蠹蛾颗粒体病毒悬液，按重量：体积比为30-5:1的比例混合均匀，冷冻干燥后制成复配的可湿性粉剂，复配的可湿性粉剂中农乳700#的含量达到12-17微克/毫克，木质素磺酸钠的含量达到0.13-0.52微克/毫克，渗透剂JFC的含量达到10-20微克/毫克，食盐的含量达到32-43微克/毫克，Bt的含量为8000-24000 IU/毫克，CpGV的含量为1-6百万颗粒体/毫克。
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