CN101129141A

CN101129141A - 生物杀蚊剂的制备方法

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Publication number: CN101129141A
Application number: CNA2006101219295A
Authority: CN
Inventors: 彭明; 廖文彬; 董金琢
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-08-24
Filing date: 2006-08-24
Publication date: 2008-02-27

Abstract

本发明公开了一种生物杀蚊剂的制备方法，该方法将两类或两类以上的杀蚊细菌发酵后产生的多种杀蚊毒素，经选择性的混合非毒性的化学添加物与物理载体制成粉末、液体、片剂、悬浮剂等多种剂型。该生物杀蚊剂能够延缓双翅目昆虫对蚊幼细菌杀蚊毒素的抗性、扩大对双翅目昆虫的杀虫谱、适合多种生态环境，同时改善杀蚊剂的有效性与稳定性。采用该生物杀蚊剂的制备方法生产的杀蚊剂对环境友好，对靶标高度专一，对人、畜及其它昆虫安全，该制剂无味，性能稳定，使用方便且价格低廉。

Description

生物杀蚊剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物灭幼蚊制剂的制备方法。

背景技术

蚊虫是重要卫生害虫之一，也是最重要的媒介昆虫。它可以传播多种动物和人类疾病，包括痢疾、黄热病、西尼罗河病毒、病毒性脑炎、登革热、淋巴丝虫病，等等。据世界卫生组织(1999)估计世界上大约有二十亿人仍生活在这些传播疾病广为发生的地区。因此，我们需要新的药物与策略来控制这些疾病的传播。被认为是具有潜力的策略主要有注射疫苗和使传播性下降的转基因蚊子等，但在目前，将主要依赖于化学杀虫剂。自从第二次世界大战以来，传播性疾病控制的方法主要依靠使用广谱的化学合成杀虫剂来减少媒介蚊虫的数量，然而，由于化学合成的杀虫剂能使蚊子产生抗性；此外化学杀虫剂容易对环境造成污染，对水源与食物的污染会造成一些非标靶昆虫和一些脊椎动物的死亡，因此在很多国家化学合成杀虫剂已被限制使用。

世界卫生组织(1999)致力于用微生物杀蚊剂来代替化学杀蚊剂，用微生物控制媒介昆虫主要是通过控制蚊子的幼虫来实现，苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis(Bti))和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus(Bs))是用得最广的杀蚊细菌。苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌是能运动的革兰氏阳性细菌，呈短杆状、能够在大自然中分离得到，它们在孢子形成时产生伴孢晶体，该晶体在昆虫体内消化后对昆虫具有致死作用。在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中，关键的杀蚊蛋白有Cyt1A(27kDa)，Cry11A(72kDa)，Cry4A(128kDa)和Cry4B(134kDa)；在球形芽孢杆菌中，杀蚊蛋白是Bin双元毒蛋白，它由两种蛋白质组成，一个是51.4kDa毒蛋白结构域和一个41.9kDa毒蛋白结构域，它们共结晶成一个小的类芽孢体。相比于化学杀蚊剂，生物杀蚊剂灭杀蚊子更专一且有效，而且本身也能够被大自然降解，因此不会造成环境污染。在发达国家，这些菌株制成的杀蚊剂型已成功地用于控制蚊幼的产生。

由杀蚊细菌制成的杀蚊剂在发达国家取得了一定的市场，但高昂的价格阻止了它们在发展中国家的使用，如中国、亚洲、非洲。而且，对于这些产品的广泛使用产生的抗性也引起了人们的关注，已经有好几个国家报道了球形芽孢杆菌在田间使用对库蚊属蚊幼的虫口数量的影响。抗性定义为在一段时间内对昆虫重复使用杀虫剂而造成的昆虫对杀虫剂敏感性差异，这种差异可以通过统计软件计算LD₅₀或LD₉₅来实现。潜在的抗性问题使我们在使用单一的杀蚊毒素时存在缺陷。由于苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌中的杀蚊毒素在生物化学与毒理学上的存在着明显差异，因此组合使用这两类菌株，或经重组工程菌产生此两类菌株中的毒素都能够有效的增强蚊幼对生物杀蚊剂的抗性，如通过混合球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的Cyt 1A蛋白或者是直接混合苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌能够显著地改善蚊幼致乏库蚊对杀蚊细菌球形芽孢杆菌的抗性，这种通过组合来改善蚊幼对杀蚊毒素的抗性在商业上是值得提倡的，但在此方面商业上的应用还较少。

近来，在杀蚊剂的研究中，重点放在对高杀蚊活性菌株的分离、改进和对制剂技术改善上。例如，美国专利U.S.Pat.Nos.5,275,815和5,847,079通过分离方法得到了一种新颖的杀蚊细菌苏云金芽孢杆菌；U.S.Pat.No.4,865,842发明了多种缓释剂应用于杀蚊剂中；U.S.Pat.No.4,166,112公布了用Bacillus ONR-60A的芽孢来控制蚊幼的方法；U.S.Pat.No.5,912,162公布了一种能够大量产生杀蚊毒素的发酵培养基。在中国ZL 03113555.2的专利“灭蚊制剂的制备方法及灭蚊制剂的应用”公开了一种采用苏云金芽孢杆菌以色列变种制备摇蚊幼虫杀灭制剂的制备与应用方法，对发酵液进行后处理得到液剂、粉剂或固定剂型的制剂，此种制剂对花翅摇蚊具有特殊高效，使用浓度内24小时对3龄幼虫的杀灭率达到98％。

包含有杀蚊细菌的发酵产物、或者是它的芽孢、或是分离得到的毒素的生物杀蚊剂。必须在施用地有稳定的货架寿命。要达到这种目的，发明的剂型中必须包含有防止活性物质免受化学因素、生物因素、物理因素和自然条件(如阳光等)降解的物质。因此，为了得到有效的杀蚊活性，发明能使活性成分在应用地域高性能的分散剂型是必要的。

考虑到在蚊幼生命周期中，蚊的卵必须产在静止的水面上，随后幼虫孵化进入池塘、死水和有水的地方。因此发明一种能够抵抗水与阳光，同时能够漂浮于施用水面上，并且易于分散并保持较长的生物活性的剂型在杀蚊幼应用上是有效的。此外干粉剂型也是一个较好的选择，它易于包装、贮藏和运输到蚊幼繁殖的地域使用。因此，有必要制成这样的生物剂型，有适合的载体，在应用地域能长时间的喷施而能够有效的控制蚊幼，并且，对环境是友善的。这样的剂型具有实践、经济、有效、并且在生态上是安全的。

发明内容

本发明正是为了满足上述技术要求而发明的一种通过组合使用多个菌株来改善杀蚊幼活性，扩大杀蚊谱与减少对靶标蚊幼的抗性的生物杀蚊剂的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一、生物杀蚊剂液体制剂的制备方法按以下工艺方法制成：

①将真空冷冻干燥保存的菌种分别接种到生长液体培养基上，在33℃，搅拌速度200rpm条件下，活化培养16小时；

②取少许菌液在生长固体培养基上进行划线分离单菌落，在33℃下静止培养24小时；

③将经鉴定的单菌落分别接种到500ml液体生长液体培养基上，在33℃，搅拌速度200rpm条件下，摇瓶培养12小时；

④种子罐发酵：将上述培养好的摇瓶菌种在无菌条件下按1％的接种量引入到装有发酵培养基的种子发酵罐中，发酵时的各项参数是：发酵温度33±1℃；罐压保持在0.3-0.5kg/cm²；溶氧每分钟1∶1；pH保持在7.8-8.2；搅拌速度190-210rpm；发酵时间为7小时；

⑤发酵罐发酵：将上述在种子罐培养好的种子液按1％的接种量引入到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵时的各项参数是：发酵温度33±1℃；罐压保持在0.3-0.5kg/cm²；溶氧每分钟1∶1；pH保持在7.8-8.2；搅拌速度190-210rpm；发酵时间为36小时左右，当菌体产生的孢子形成率达85％以上时即可放罐；

⑥采用超滤膜过滤的方法浓缩；

⑦依次加入重量比均为0.1％-10％的防腐剂、诱蚊剂、分散剂，防腐剂的成分为苯甲酸钠，诱饵剂的成分为复合维生素B与蜂蜜(重量比为2∶1)的混合物，分散剂的成分为甲基纤维素；混匀后，即为液体制剂。

二、生物杀蚊剂粉末制剂的制备方法按以下工艺方法制成：

首先按上述生物杀蚊剂液体制剂的制备方法进行完第①、②、③、④、⑤和⑥步后，继续进行如下工艺方法：

⑦依次加入重量比为0.1％-10％的诱饵剂、0.1％-10％的干燥剂；干燥后加入重量比为0.1％-10％的分散剂、0.1％-10％的缓释剂，经干燥混匀后；再与重量比为0.1％-10％的防晒剂、0.1％-10％的粘湿剂一起混匀。诱饵剂为复合维生素B与蜂蜜(重量比为2∶1)的混合物；干燥剂的成分为硅藻土与磷酸钙(重量比为1∶1)；分散剂的成分为甲基纤维素；缓释剂的成分为脂肪酸盐；防晒剂的成分为对二甲氨基苯甲酸异辛酯；粘湿剂的成分为聚氧乙烯硬脂酸盐；混匀后，加入助剂碳酸钙，经喷雾干燥成粉末制剂。

三、生物杀蚊剂片剂的制备方法按以下工艺方法制成：

⑧在制成的粉末制剂的基础上，依次加入重量比为10％-50％的稀释剂、10％-50％的滑润剂、0.5％-5％中和剂，稀释剂的成分是微粉化的纤维素和一水乳糖，中和剂的成分为碳酸氢钠，润滑剂成分为PEG 6000；经压片后成片剂。

四、生物杀蚊剂悬浮剂的制备方法按以下工艺方法制成：

⑦依次加入防腐剂重量比均为0.1％-10％的苯甲酸钠、诱蚊剂、分散剂甲基纤维素，防腐剂的成分为苯甲酸钠，诱饵剂的成分为复合维生素B与蜂蜜(重量比为2∶1)的混合物，分散剂的成分为甲基纤维素；混匀后，加入助剂碳酸钙，喷雾干燥到剧木粉上即为悬浮剂。

上述生物杀蚊剂的制备方法中的生产用菌种为：苏云金芽孢杆菌以色列亚种、球形芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌马来西亚亚种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种、苏云金芽孢杆菌幕虫亚种、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种、苏云金芽孢杆菌福冈变种、苏云金芽孢杆菌肯尼亚亚种、苏云金芽孢杆菌加拿大亚种、苏云金芽孢杆菌杀虫亚种、苏云金芽孢杆菌印第安那亚种、苏云金芽孢杆菌墨西哥亚种、苏云金芽孢杆菌东北亚种、苏云金芽孢杆菌励木亚种、苏云金芽孢杆菌科尔默亚种、苏云金芽孢杆菌达姆斯塔特亚种、苏云金芽孢杆菌九州亚种和苏云金芽孢杆菌汤普逊亚种中的一种或多种。

上述生物杀蚊剂的制备方法中的生长液体培养基由下列成分组成：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，pH值为7.0-7.2，在1个大气压和121.3℃条件下灭菌20分钟制成。生长固体培养基由下列成分组成：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，pH值为7.0-7.2，在1个大气压和121.3℃条件下灭菌20分钟制成。

上述生物杀蚊剂的制备方法中的发酵培养基由下列成分组成：胰蛋白胨1.5％，黄豆粉1.5％，玉米粉1.0％，脲0.1％，甘露醇0.7％，NaC10.2％，无机盐0.1％。其中无机盐按以下组分的质量比合成：MgSO₄占64.0％，MnSO₄占4.0％，ZnSO₄占4.0％，CuSO₄占4.0％，FeSO₄占4.0％，CaCl₂占20.0％。

五、本发明生物杀蚊剂及其制备方法的特点：

在蚊子的综合防治中，轮换使用菌株或使用经遗传修饰的包含有新的或多种杀蚊毒素的菌株显得尤其重要。本发明就是使用多个杀蚊菌株产生的多种杀蚊毒素制成多种剂型来有效控制蚊幼。它至少包含两类及以上的菌株的毒素的混合，在应用地域交叉保护与特异地对目标蚊幼有效。

例如，苏云金芽孢杆菌以色列亚种具有的毒素有Cyt1A(27kDa)，Cry11A(72kDa)，Cry4A(128kDa)和Cry4B(134kDa)；球形芽孢杆菌产生41kDa和52kDa双元毒素；苏云金芽孢杆菌马来西亚亚种(B.thuringiensis subsp jegathesan)产生至少7种毒素，其中Cry11B毒素的毒性比苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的Cry11A的毒性高十倍；苏云金芽孢杆菌马来西亚亚种对致乏库蚊和东乡伊蚊具有高毒性，LD₅₀为0.34ng/ml；苏云金芽孢杆菌H44亚种产生的伴孢晶体蛋白对蚊幼虫有中等活性，纯化得到的伴孢晶体为球形，对两类蚊子具有活性(尖音家蚊、地下家蚊和印度按蚊)，LC₅₀值分别是3.41和0.15mg/ml。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种和苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种之间的协同增效作用也已被研究，苏云金芽孢杆菌以色列亚种和苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种的PG-14的对蚊子的毒性是Cyt1A、CryIVA、B和D四种蛋白混合的20倍，这种高毒性被认为是因为毒素之间的协同增效作用。

对杀蚊毒素产生菌进行发酵是经济与有效的产生大量具有杀蚊作用的类芽孢体与伴孢晶体的一种工业放大方法。在本发明中对使用的单个菌株使用合适的培养基、发酵条件与程序进行发酵。发酵后的细菌碎片以及它的产物可以分别加工；也可以和其它的菌株、非活性添加物混合后再加工。

发酵后，发酵液中包含有毒素蛋白、芽孢、碎片与细菌细胞以及代谢产物。获得高质量的活性晶体毒素的影响因素有：细菌产物的浓缩、晶体蛋白的抽提方法、在剂型制作过程中添加一些非活性添加物。在本发明中，包含毒素蛋白的发酵液、芽孢、纯毒素蛋白都可以用作生物杀蚊剂剂型制备。

菌株产生的毒素可以通过离心的方法来收集，也可以使用过滤膜或其它方法。喷雾干燥被证明是一种能有效保持生物活性物质的活性的干燥方法，在本发明中，喷雾干燥是从原发酵液或经浓缩后的发酵液体直接获得固体形式的杀蚊活性物质的主要干燥技术，干燥后的产品可以用于各种剂型的制备。

从发酵液中回收活性毒素以后，无论纯度如何，都可以用各种形式的制备制剂，如粉末、液体、颗粒、片剂等。

本发明的一个最重要的目的是制备各种剂型，剂型中至少包含两种或以上活性菌株产生的毒素，并可添加非活性添加物与载体。新发明的生物杀蚊剂能有效的杀灭双翅目昆虫，并具有实用价值，对经济的和对环境友善。新发明的制剂必须在施用地能在较短的时间内杀死＞95％的蚊幼虫，并且在贮存与运输过程中有较好的稳定性，发明的剂型中必须包含有防止活性物质免受化学因素、生物因素、物理因素和自然条件(如阳光等)降解的物质。

为了适应不同地域的要求，必须发明多种剂型，每一种剂型都必须包含毒素和各种非活性添加物来维持或提高杀蚊活性。本发明的剂型包括但不仅仅局限于：粉末、液体、颗粒、片剂、悬浮剂，所有的成分可以通过简易的混合来形成均匀的制剂。制成的各种形式的制剂，都能够进一步与物理或化学的载体相混合来制成混合制剂，以适应不同地域的需要。

无毒的具有缓释作用的试剂也可应用于本发明中，以此来延长杀蚊剂在应用表面的存留时间。固态的混合物或制剂可以用无毒性的成分来包被，如油、纤维素等，以此来延长活性物质在施用地的稳定性。

在各种剂型中，除包含有两种或以上杀蚊菌株的杀蚊毒素外，添加各种非活性成分，包括但不仅仅局限于：化学干燥剂、分散剂、表面活性剂、助流剂、粘着剂/湿润剂、防晒剂、缓释剂、包被剂；也可以添加各种载体物质：农副产品，如玉米穗轴，木材碎片或粉末，谷壳，果实加工后的副产品，织布，等等。

在本发明中，生物杀蚊剂的活性用TIU(Toxic International Units)/mg干粉来表示。

本发明的有益效果是采用该生物杀蚊剂的制备方法生产的杀蚊剂对环境友好，对靶标高度专一，对人、畜及其它昆虫安全，该制剂无味，性能稳定，使用方便且价格低廉。

具体实施方式

实施事例一、发酵过程的优化

以苏云金芽孢杆菌以色列亚种为例进行发酵过程的优化，具体操作如下：

对细菌的接种量、发酵温度、发酵时间、溶氧、发酵时PH值、搅拌速度进行了优化实验，每一个实验都至少选用6个处理3个重复进行，对所做的处理与重复以致乏库蚊为试蚊进行杀幼蚊生物测定，以LC₅₀确定最佳的优化组合。

优化实验说明，苏云金芽孢杆菌以色列亚种细菌在发酵7个小时达到对数生长期；接种量为1％；发酵温度以33℃为最好；发酵时间为36小时；溶氧为每分钟1∶1；发酵pH值为8.0为最佳；搅拌速度在200rpm为最佳。

以上条件对苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株进行了发酵实验后，以致乏库蚊为试蚊进行杀幼蚊生物测定，LC₅₀在24h后进行测试，苏云金芽孢杆菌以色列亚种对致乏库蚊LC₅₀为0.02559ug/ml。

实施事例二、两种或多种菌的混合比例的优化

(1)以苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌为例，进行了两种菌的不同比例组合实验，具体实施是：

对苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌分别进行发酵，发酵后进行离心收集菌体，按菌体湿重比进行以下组合：苏云金芽孢杆菌以色列亚种∶球形芽孢杆菌＝1∶1，5∶1，1∶5。组合后分别以致乏库蚊为试蚊进行杀幼蚊生物测定，以LC₅₀为指标进行优化组合。运用协同增效因数(synergism factor SF)来确定协同增效的大小，以苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌分别对库蚊的LC₅₀值的加权平均和为理论值，除以组合后对库蚊的LC₅₀得到值为协同增效因数SF，若SF＞1，则被认为具有协同增效作用。

实验表明：

苏云金芽孢杆菌以色列亚种∶球形芽孢杆菌＝1∶1时，SF＝12.1977＞1，具有协同增效作用。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种∶球形芽孢杆菌＝5∶1时，SF＝6.6032＞1，具有协同增效作用。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种∶球形芽孢杆菌＝1∶5时，SF＝3.7884＞1，具有协同增效作用。

以上三组实验说明，在所选用的组合中，苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌之间具有非常明显的增效作用。以苏云金芽孢杆菌以色列亚种：球形芽孢杆菌为1∶1时，协同增效效果最好。

(2)以苏云金芽孢杆菌以色列亚种、球形芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌马来西亚亚种为例，进行了多种菌的比例组合实验，具体实施是：

对苏云金芽孢杆菌以色列亚种、球形芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌马来西亚亚种分别进行发酵，发酵后进行离心收集菌体，按菌体湿重比进行以下组合：苏云金芽孢杆菌以色列亚种：球形芽孢杆菌：苏云金芽孢杆菌马来西亚亚种＝1∶1∶1。组合后分别以致乏库蚊为试蚊进行杀幼蚊生物测定，以LC₅₀和协同增效因数为指标进行优化组合的评价。

实验表明：

苏云金芽孢杆菌以色列亚种：球形芽孢杆菌：苏云金芽孢杆菌马来西亚亚种＝1∶1∶1时，SF＝25.1658＞1，具有明显的协同增效作用。

实施事例三、苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1对库蚊的抗性试验

用球形芽孢杆菌菌株对用于毒性测定的致乏库蚊连续筛选培养30代以上，获得对球形芽孢杆菌具有抗性的蚊虫株系，然后，用苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1对获得抗性的蚊虫株系进行生物活性测定，以LC₅₀值为指标，来确定两者的抗性水平。

球形芽孢杆菌对抗性蚊幼的毒杀效果在24小时测定时，球形芽孢杆菌在1000ug/ml对供试蚊幼没有毒杀效果；在48小时测定时，球形芽孢杆菌在1000ug/ml时，只有20％左右的蚊幼死亡；用苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1对获得抗性的蚊虫株系进行生物活性测定时，在24小时时对供试蚊幼的LC₅₀值为0.0253ug/ml。组合使用1∶1的苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌，对抗性蚊幼的毒性提高约1000/0.0253＝39,525倍。因此，在对蚊幼的抗性管理上，组合使用菌株是非常有效的方法。

实施事例四、苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1杀蚊谱实验

具体操作是：选用致乏库蚊与埃及伊蚊作为试虫进行生物活性测定。先用球形芽孢杆菌对两种的蚊幼的毒杀效果进行评价，然后再用苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1对两种蚊幼虫的毒杀效果进行评价。

实验结果：

球形芽孢杆菌对致乏库蚊的LC₅₀值为0.354ug/ml；对埃及伊蚊的LC₅₀值为106ug/ml，对埃及伊蚊基本无活性。

苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1对致乏库蚊的LC₅₀值为0.0401ug/ml；对埃及伊蚊的LC₅₀值为0.0875ug/ml。

从以上数据可以看出，组合使用菌株后扩大了球形芽孢杆菌对埃及伊蚊杀蚊谱，同时也改善了球形芽孢杆菌对致乏库蚊的杀蚊活性达8.8倍。

实施事例五、苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1时液体剂型的制备

(1)将真空冷冻干燥保存的苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌菌种分别接种到生长液体培养基上，在33℃下200rpm活化培养16小时；

(2)取少许菌液在生长固体培养基上进行划线分离单菌落，在33℃下静止培养24小时；

(3)将经鉴定的单菌落分别接种到500ml液体生长液体培养基上，33℃，200rpm，摇瓶培养12小时；

(4)种子罐发酵：将上述培养好的苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌摇瓶菌种在无菌条件下按1％的接种量分别引入到装有发酵培养基的两个种子发酵罐中，发酵时的各项参数是：发酵温度33±1℃；罐压保持在0.3-0.5kg/cm²；溶氧每分钟1∶1；pH保持在7.8-8.2；搅拌速度190-210rpm；发酵时间为7小时。

(5)发酵罐发酵：将上述在种子罐培养好的种子液按1％的接种量分别引入到装有发酵培养基的2个发酵罐中，发酵时的各项参数是：发酵温度33±1℃；罐压保持在0.3-0.5kg/cm²；溶氧每分钟1∶1；pH保持在7.8-8.2；搅拌速度190-210rpm；发酵时间为36小时左右，当菌体产生的孢子形成率达85％以上时即可放罐。

(6)将苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌分别采用超滤膜过滤的方法浓缩，并按苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌的湿菌重量比为1∶1的比例混合。

(7)依次加入防腐剂苯甲酸钠、诱蚊剂、分散剂甲基纤维素，它们的重量比分别是0.2％，0.5％，0.2％。混匀后，即为液体剂型。

(8)将制成的液体剂型用水稀释5倍，以稀释后的液体用于户外治理蚊幼。

将制备的液体剂型用于静止的水面进行蚊幼防治时，使用的工作浓度是50ppm，按水量每两天投药一次，持续2周，使用周期为4周。

实施事例六、苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1时以锯末或粉碎的玉米芯为载体的制剂的制备

(2)取少许菌液在生长固体培养基上进行划线分离单菌落，在在33℃下静止培养24小时；

(7)依次加入防腐剂苯甲酸钠、诱蚊剂、分散剂甲基纤维素，它们的重量比分别是0.2％，0.5％，0.2％。混匀后，加入助剂碳酸钙，混匀后喷雾到粉碎的剧木粉或粉碎的玉米芯上即为悬浮剂。

将制备的以剧木粉或粉碎的玉米芯为载体的悬浮剂剂型用于流动的水面进行蚊幼防冶时，使用的工作浓度是2.5-10.0g/m²，按水量每两天投药一次，持续2周，使用周期为4周。

实施事例七、苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1时以塑料泡沫或布为载体的制剂的制备

(5)发酵罐发酵：将上述在种子罐培养好的种子液按1％的接种量引入到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵时的各项参数是：发酵温度33±1℃；罐压保持在0.3-0.5kg/cm²；溶氧每分钟1∶1；pH保持在7.8-8.2；搅拌速度190-210rpm；发酵时间为36小时左右，当菌体产生的孢子形成率达85％以上时即可放罐。

(6)采用超滤膜过滤的方法浓缩，并按苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌的湿菌重量比为1∶1的比例混合。

(7)依次加入防腐剂苯甲酸钠、诱蚊剂、分散剂甲基纤维素，它们的重量比分别是0.2％，0.5％，0.2％。混匀后，加入助剂碳酸钙，混匀后喷雾到粉碎的塑料泡沫或布上即为悬浮剂。

将制备的以塑料泡沫或布为载体的制剂剂型用于流动的水面进行蚊幼防治时，使用的工作浓度是1.5-8.0g/m²，按水量每两天投药一次，持续2周，使用周期为4周。

实施事例八、苏云金芽孢杆菌以色列亚种与球形芽孢杆菌组合比例为1∶1时粉末剂型与片剂的制备

(7)依次加入重量比为1％的诱饵剂、2％的干燥剂，干燥后加入重量比为2％的分散剂、2％的缓释剂，经干燥混匀后，与重量比为1％的防晒剂、2％的粘湿剂一起混匀。混匀后，经喷雾干燥成粉末剂型。

(8)在上述所制成的粉末剂型中，依次加入重量比为20％的稀释剂、20％的滑润剂、3％中和剂，经压片后成片剂。

片剂适用于下水道、污水区等人为施药无法达到的地方，每平方米使用1-2片，每1个星期重复使用，使用周期为4周。

Claims

1.一种生物杀蚊剂液体制剂的制备方法，其特征在于：所述生物杀蚊剂液体制剂按以下工艺方法制成：

③将经鉴定的单菌落分别接种到500ml液体生长液体培养基上，33℃，搅拌速度200rpm条件下，摇瓶培养12小时；

⑥采用超滤膜过滤的方法浓缩；

2.一种生物杀蚊剂粉末制剂的制备方法，其特征在于：所述生物杀蚊剂粉末制剂按以下艺方法制成：

⑥采用超滤膜过滤的方法浓缩；

⑦依次加入重量比为0.1％-10％的诱饵剂、0.1％-10％的干燥剂；干燥后加入重量比为0.1％-10％的分散剂、0.1％-10％的缓释剂，经干燥混匀后；再与重量比为0.1％-10％的防晒剂、0.1％-10％的粘湿剂一起混匀；诱饵剂为复合维生素B与蜂蜜(重量比为2∶1)的混合物；干燥剂的成分为硅藻土与磷酸钙(重量比为1∶1)；分散剂的成分为甲基纤维素；缓释剂的成分为脂肪酸盐；防晒剂的成分为对二甲氨基苯甲酸异辛酯；粘湿剂的成分为聚氧乙烯硬脂酸盐；混匀后，加入助剂碳酸钙，经喷雾干燥成粉末制剂。

3.一种生物杀蚊剂片剂的制备方法，其特征在于：所述生物杀蚊剂片剂按以下工艺方法制成：

⑥采用超滤膜过滤的方法浓缩；

4.一种生物杀蚊剂悬浮剂的制备方法，其特征在于：所述生物杀蚊剂悬浮剂按以下工艺方法制成：

⑥采用超滤膜过滤的方法浓缩；

5.根据权利要求1、2、3或4之一所述的生物杀蚊剂的制备方法，其特征在于：生产用菌种为：苏云金芽孢杆菌以色列亚种、球形芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌马来西亚亚种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种、苏云金芽孢杆菌幕虫亚种、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种、苏云金芽孢杆菌福冈变种、苏云金芽孢杆菌肯尼亚亚种、苏云金芽孢杆菌加拿大亚种、苏云金芽孢杆菌杀虫亚种、苏云金芽孢杆菌印第安那亚种、苏云金芽孢杆菌墨西哥亚种、苏云金芽孢杆菌东北亚种、苏云金芽孢杆菌励木亚种、苏云金芽孢杆菌科尔默亚种、苏云金芽孢杆菌达姆斯塔特亚种、苏云金芽孢杆菌九州亚种和苏云金芽孢杆菌汤普逊亚种中的一种或多种。

6.根据权利要求1、2、3或4之一所述的生物杀蚊剂的制备方法，其特征在于：生长液体培养基由下列成分组成：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，pH值为7.0-7.2，在1个大气压和121.3℃条件下灭菌20分钟制成。

7.根据权利要求1、2、3或4之一所述的生物杀蚊剂的制备方法，其特征在于：生长固体培养基由下列成分组成：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，pH值为7.0-7.2，在1个大气压和121.3℃条件下灭菌20分钟制成。

8.根据权利要求1、2、3或4之一所述的生物杀蚊剂的制备方法，其特征在于：发酵培养基由下列成分组成：胰蛋白胨1.5％，黄豆粉1.5％，玉米粉1.0％，脲0.1％，甘露醇0.7％，NaCl 0.2％，无机盐0.1％。

9.根据权利要求8所述的生物杀蚊剂的制备方法，其特征在于：所述无机盐按以下组分的质量比合成，其中：MgSO₄占64.0％，MnSO₄占4.0％，ZnSO₄占4.0％，CuSO4占4.0％，FeSO₄占4.0％，CaCl₂占20.0％。