CN100521945C - 苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌的混合物用于控制对杀幼蚊剂的抗性 - Google Patents

苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌的混合物用于控制对杀幼蚊剂的抗性 Download PDF

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Abstract

公开了一种控制双翅目昆虫幼虫的方法或者一种抑制幼虫抗性发展、控制双翅目昆虫抗性种群并降低抗性水平的方法，其通过将杀幼虫有效量的苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株和球形芽孢杆菌菌株的混合物引入到含有双翅目昆虫幼虫的环境中；以及混合物的组合物。优选两种菌株都是未遗传修饰的。

Description

苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌的混合物用于控制对杀幼蚊剂的抗性
发明领域
本发明涉及一种用于控制双翅目昆虫幼虫的方法或者一种用于抑制双翅目昆虫中的杀幼虫剂抗性的方法，其通过引入一种杀幼虫有效量的苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株和球形芽孢杆菌菌株的混合物到包含双翅目昆虫幼虫的环境里；以及该混合物的组合物。优选地，两种菌株都是未遗传修饰的。
发明背景
蚊子和墨蚊是双翅目昆虫的代表，是危害人类和动物生存的害虫。蚊子是许多人类和动物疾病的主要携带者，包括疟疾、黄热病、病毒性脑炎、登革热和丝虫病。
已经开发了以控制双翅目昆虫为目标的各种化学杀虫剂。例如，用水溶性乙醇以水混合形式用于灭蚊的水源处理披露于美国专利6,077,521。然而，更为最近的重点已经放在了生物杀虫剂的使用上。例如，至少一种生物杀虫剂成分的释放控制配方披露于美国专利4,865,842；用形成芽孢的杆菌ONR-60A控制幼蚊披露于美国专利4,166,112；具有抗双翅目昆虫害虫活性的新的苏云金芽孢杆菌分离物披露于美国专利5,275,815和5,847,079；具有抗双翅目昆虫害虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株的生物纯化培养物披露于美国专利5,912,162，以及具有抗双翅目昆虫活性的重组衍生的生物杀虫剂披露于美国专利5,518,897，包括用含有苏云金芽孢杆菌以色列亚种的杀双翅目昆虫蛋白的质粒转化的藻蓝菌，该蛋白可翻译地融合到强的、高活性天然藻蓝菌调控基因序列中。
然而这些生物杀虫剂具有缺陷；因此要继续寻找新的生物杀虫剂。某些生物杀虫剂的一个缺陷是可能发展形成杀虫剂抗性。
抗性定义为连续暴露于杀虫剂一段时间后，在同一种属的种群之间产生的敏感性差别。这些差别通过观测杀死50％或者95％种群的致死剂量(LD)(分别为LD50或LD95)的统计变化。易感性的个体差别存在于每个种群中，实际上不太敏感的害虫可能通常以低的发生率存在于至少一些野生型种群中。存在杀虫剂时，这些实际上不太敏感的害虫存活并繁殖。由于它们的存活能力是它们遗传组成的结果，因此它们的抗性遗传组成随后被传递给它们的后代，导致了由杀虫剂诱导选择的种群敏感性的变化。杀幼虫剂抗性已经在一些双翅目昆虫种属中发现。
特别地，五带淡色库蚊对球形芽孢杆菌(B.s.)的抗性发展由Rodcharoen等人发现了：Journal of Economic Entomology，Vol.87，No.5,1994，pp.11331140。为克制该抗性，一种通过将B.s.与分离自苏云金芽孢杆菌以色列亚种的纯化CytlA晶状物混合，或者通过将重组B.t.i.与B.s.混合的方法由Wirth等人披露了：Journal of Medical Entomologv，Vol.37，No.3,2000，pp.401-407。然而，除了天然衍生的或产生的之外，克制库蚊对B.s.抗性的改进的生物杀虫剂和组合物应用将是值得期待的。
发明概述
本发明涉及一种组合物，包含：苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株和球形芽孢杆菌菌株的混合物。苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株可以是未遗传修饰的，或者球形芽孢杆菌菌株可以是未遗传修饰的，尽管必然地优选的组合物包括未遗传修饰的苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株和未遗传修饰的球形芽孢杆菌菌株。
混合物可以具有约1:10到约10:1的苏云金芽孢杆菌以色列亚种对球形芽孢杆菌的重量比；优选约1:3到约3:1的苏云金芽孢杆菌以色列亚种对球形芽孢杆菌的重量比；更优选约1:2到约2:1的苏云金芽孢杆菌以色列亚种对球形芽孢杆菌的重量比；以及最优选1:1的苏云金芽孢杆菌以色列亚种对球形芽孢杆菌的重量比。
额外的成分，例如表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、食物兴奋剂、引诱剂、封装剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线防护剂、缓冲液、漂移控制剂、喷雾沉积助剂、自由流动剂或者它们的组合也可用来与杀幼虫组合物混合。
本发明也涉及一种控制双翅目昆虫幼虫的方法，包括步骤：将杀幼虫有效量的苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株和球形芽孢杆菌菌株的混合物引入到含有双翅目昆虫幼虫的环境中。在该方法中，双翅目昆虫可以是蚊子例如尖音库蚊、五带淡色库蚊、埃及伊蚊、环喙库蚊、脉毛蚊、按蚊或者它们的组合。
本发明还涉及一种抑制双翅目昆虫中杀幼虫剂抗性的方法，包括步骤：将杀幼虫有效量的苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株和球形芽孢杆菌菌株的混合物引入到含有双翅目昆虫幼虫的环境中。优选地，双翅目昆虫是库蚊以及杀幼虫剂抗性是抗球形芽孢杆菌而发展形成的。
发明详述
本发明涉及一种用于控制双翅目昆虫幼虫的方法或者一种用于抑制双翅目昆虫中的杀幼虫剂抗性的方法，其通过引入一种杀幼虫有效量的苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株和球形芽孢杆菌菌株的混合物到包含双翅目昆虫幼虫的环境里；以及该混合物的组合物。优选地，两种菌株都是未遗传修饰的。下面详细论述该组合物以及利用组合物的方法。
杀幼虫剂组合物
生物杀虫剂是一类天然产生的杀虫剂，通常衍生自已经发展出对抗其它生物体的天然防御的单细胞或者多细胞生物。对昆虫致病的微生物组是各种各样的和变化多端的。革兰氏阳性土壤菌苏云金芽孢杆菌以色列亚种是许多能够产生杀昆虫蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株的一种。在细菌芽孢形成过程的循环中表达的这些蛋白聚集成芽孢样晶状包涵体。当被包括蚊子和墨蚊的双翅目幼虫吞食时，由苏云金芽孢杆菌以色列亚种产生的芽孢样晶状物是有毒的。一旦吞食，晶状蛋白就溶于幼虫的中肠并破坏幼虫中肠区的上皮细胞。上皮细胞的膨胀和/或溶解伴随着其后幼虫的饿死。
苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.t.i.)已经被成功地用于蚊子和墨蚊控制项目多年了。苏云金芽孢杆菌以色列亚种可干净地用来温和地清洁有机饲养场所，并且对伊蚊最有效。苏云金芽孢杆菌以色列亚种的商业配方因商标VECTOBAC而知名，可从Valent BioSciences Corp.获得。从同一供应商获得的特殊商业配方是VECTOBAC G，VECTOBAC CG，VECTOBAC12AS和VECTOBAC WDG。苏云金芽孢杆菌以色列亚种可有效抵抗广范围的蚊子种属，产生低哺乳动物毒性并且容易应用。苏云金芽孢杆菌以色列亚种也极不容易产生抗性，因为它的杀幼虫活性是基于多重毒性的。在受处理种群中的个体蚊子不对所有毒素敏感的机会将是极小的。
球形芽孢杆菌(B.s.)是在土壤和其它底物中普遍发现的一种杆状的、好氧的、形成芽孢的细菌。到目前为止，至少16种菌株已经被发现表现出不同程度的灭蚊特性。几种菌株例如1593M，2362和2297显示了对幼蚊的高毒性。球形芽孢杆菌菌株2362，(VECTOLEX，来自ValentBioSciences Corp)已经在许多国家成功利用。来自同一来源的球形芽孢杆菌特殊的商业配方是VECTOLEX WDG，SPHERIMOS AS和VECTOLEX CG。而且，发现该菌株在控制不同栖息地繁殖的蚊子尤其是污水繁殖的蚊子方面表现很好。
球形芽孢杆菌对库蚊最有效。球形芽孢杆菌的活性归因于双毒素，重复使用可能导致抗性的发展形成。
然而，幼蚊对球形芽孢杆菌的不同水平的抗性已经在尖音库蚊和五带淡色库蚊中观察到。
我们现在发现B.t.i.和B.s.的混合物是有效的杀幼虫剂配方。利用的是未遗传修饰的成分，如果杀幼虫剂要在与食物源例如农作物、牛或猪的生产或收获相关的环境中利用的话，这一点是期望的。未遗传修饰的B.t.i.或B.s.可定义为天然产生的菌株，而不是来自重组DNA技术的菌株。
B.t.i.和B.s.可以通过混合每种单独菌株的粉末形式或者混合每种菌株的发酵肉汤浆，按照如后面实施例1-6列举的期望的比例而混合。B.t.i.对B.s.的比例可以从约10:1到约1:10；优选从约3:1到约1:3；更优选从约2:1到约1:2以及最优选约1:1。
上述组合物也可包括额外的成分，例如表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、食物兴奋剂、引诱剂、漂移控制剂、喷雾沉积助剂、封装剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线防护剂、缓冲液、自由流动剂，或者稳定活性成分、有助于产品处理和应用于特定目标害虫双翅目昆虫的任何其它成分。
合适的表面活性剂包括阴离子化合物例如羧酸盐，例如，长链脂肪酸的金属羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化合物的单或双酯或者这些酯的盐；脂肪醇的硫酸盐例如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或乙酰硫酸钠；乙氧基脂肪醇的硫酸盐；乙氧基烷基苯酚的硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷芳基磺酸盐例如烷基苯磺酸盐或者低级烷基萘磺酸盐，例如丁基-萘磺酸盐；萘甲醛缩合物的磺酸盐；苯酚-甲醛缩合物的磺酸盐；或者更复杂的磺酸盐例如酰氨基磺酸盐，如油酸和N-甲基牛磺酸或二烷基硫代琥珀酸的磺酸缩合产物，如磺酸钠或琥珀酸二辛酯。
非离子表面活性剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或链烯基取代的苯酚与环氧乙烷的缩合产物，多羟基醇醚的脂肪酸酯例如脱水山梨醇脂肪酸酯，该酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，乙炔二醇例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇或者乙氧基乙炔二醇。
阳离子表面活性剂的例子包括，例如，脂肪族单-、二-或者聚酰胺的醋酸盐、萘酸盐或油酸盐；含氧胺例如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；由羧酸与单-或多胺缩合制备的酰胺连接的胺；或者季铵盐。
惰性材料的例子包括无机矿物如高岭石、云母、石膏、肥料、沙、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐或者磷酸盐；有机材料如糖、淀粉或者环糊精；或者植物材料如木材制品、软木、玉米棒子粉、稻壳、花生壳以及胡桃壳。
配方中也可含有添加的控制液滴大小和有助于空中施用的漂移控制剂或者喷雾沉积助剂。适用于这些目的的化合物的例子包括聚乙烯醇聚合物溶液、聚酰胺共聚物溶液、聚丙烯酸衍生物及其混合物、植物油及其混合物、石油及其混合物、以及天然和合成的聚合物。
在配方中，超过一种的上述额外的成分可以便利地使用。
本发明的组合物可以作为液体、水悬液、乳状悬液或者固体用各自常规的应用技术加以应用。固体配方是必然优选的。通常，本发明的杀幼虫有效量混合物的应用率是提供足以控制目标害虫种群的杀虫剂的量。
固体组合物的加工可以通过分别喷雾干燥B.t.i.和B.S.菌浆并混合粉末或者通过混合菌浆并喷雾干燥混合的菌浆形成粉剂。
本发明的组合物可以以合适的形式用于直接应用，或者作为浓缩的或原组合物，需要在应用前用适量的水或其它稀释剂进行稀释。杀虫剂浓度将随特定配方的性质而变化，特别是，它是浓缩的还是直接使用的。组合物可以包含约1到98％重量的固体或液体惰性载体，以及0.1到50％重量的表面活性剂。这些组合物将以每公顷约50mg(液态的或干燥的)到20kg或更多量的标准施用。
方法
本发明的混合物可以在配制前进行处理，以便在施用到目标害虫的环境时延长杀虫活性，只要预处理对混合物是无害的。这样的处理可以用化学和/或物理方法，只要处理不会有害地影响组合物的性质。化学试剂的例子包括但不限于卤化剂；醛，如甲醛和戊二醛；抗感染剂，如氯化苄基·二甲基·烷基铵；醇，如异丙醇和乙醇；以及组织固定剂，如布安氏固定剂(Bouin′s fixative)和海利氏固定剂(Helly′s fixative)。
本发明的组合物可以直接应用到欲处理的环境。池塘、湖泊、溪流、河流、静水以及其它易遭受双翅目虫害的地区是需要这种处理的环境的例子。除此之外，组合物可以通过喷雾、撒粉、喷洒以及广播进行施用。
本发明的组合物可以有效对抗双翅目昆虫害虫，例如伊蚊属，海滨伊蚊，墨西哥按实蝇，中美按实蝇，按蚊属，骚扰阿蚊，反吐丽蝇，红头丽蝇，地中海腊实蝇，伸展摇蚊，大头金蝇，次生旋丽蝇，库蚊属，脉毛蚊属，Coquillettidia属，蟹洞蚊，橄榄实蝇，葱地种蝇，灰地种蝇，毛尾地种蝇，黑尾果蝇，直突摇蚊，刺舌蝇，须舌蝇，丝舌蝇，Haemagogusequines，刺扰血蝇，牛皮蝇，纹皮蝇，斑腹蝇，铜绿蝇，丝光绿蝇，Lutzomyialonglpaipis，Lutzomyia shannoni，尖眼覃蚊，曼蚊属，麦蝇蚊，秋家蝇，家蝇，石蝇属，Ochlerotatus属，拟杆蝇，直脚蚊属，丝光绿蝇，白蛉蚊属，伏蝇，鳞蚊属，蝗麻蝇，粪麻蝇，黄粪蝇，厩螯蝇，巨蚊，Tripteroides bambusa，兰带蚊属以及长足蚊属。然而，本发明的组合物也可有效对抗鳞翅目昆虫害虫，例如小腊螟，西部黑头长翅卷蛾，东部黑头长翅卷蛾，棉褐带卷蛾，小地老虎，棉叶夜蛾，秋尺蠖，扁毛蛾，地中海粉斑螟，桃麦条蛾，烁黄条大蚕蛾，梨豆夜蛾，黄卷蛾属，带卷蛾属，棒须委夜蛾，家蚕，棉潜蛾，葡萄干果斑螟，色卷蛾属，细卷蛾属，美洲苜蓿粉蝶，米螟，茶小卷蛾，苹果小卷蛾，核桃舟蛾，天目松毛虫，葡萄卷叶螟，甜瓜绢野螟，黄瓜绢野螟，西南玉米杆草螟，小蔗杆草螟，榆角尺蠖蛾，赤杨尺蠖，烟草粉斑螟，菩提尺蛾，茶斑蛾，棕卷蛾，Eupoecil iaambiguella，黄毒蛾，暗缘地老虎，大腊螟，梨小食心虫，葡萄叶烟翅斑蛾，织叶蛾，谷实夜蛾，烟芽夜蛾，行列大蚕蛾，向日葵同斑螟，美国白蛾，茄茎麦蛾，东方铁杉尺蠖，西方铁杉尺蠖，雪毒蛾，花翅小卷蛾，甜菜网野螟，舞毒蛾，银锭夜蛾，天幕毛虫属，甘蓝夜蛾，蓓带夜蛾，Manduca quinquemaculata，Manduca sexta，豆荚螟，白肾灰夜蛾，冬尺蠖蛾，古毒蛾属，玉米螟，春尺蠖，波纹夜蛾，红铃麦蛾，加州槲蛾，橘潜蛾，绿脉菜粉蝶，小菜粉蝶，苜蓿绿夜蛾，石竹小卷蛾，荷兰石竹小卷蛾，洋葱羽蛾，印度谷螟，菜蛾，花粉蝶，黏虫，大豆尺夜蛾，杂食尺蠖，红山背舟蛾，麦蛾，苹白小卷蛾，灰翅夜蛾属，异舟蛾，幕谷蛾，粉夜蛾，温室结网野螟，亚热带夜蛾，苹果巢蛾；鞘翅目，例如马铃薯叶甲属，菜豆象，绿豆象，墨西哥大豆瓢虫，榆黄萤叶甲，甘薯象，胡萝卜象，谷象属，北方圆头犀金龟，南方圆头犀金龟，蔷薇刺鳃角金龟，日本弧丽茇，切根鳃金龟，黑菌虫，小眼谷盗，黄粉虫，黑粉虫，黑粉谷盗，杂拟谷盗，褐拟谷盗，螨，例如草地小爪螨，苹果红蜘蛛，棉叶螨；膜翅目，例如阿根廷蚂蚁，红外来火蚁；等翅目，例如美国散白蚁，黄枝散白蚁，家白蚁，细腰湿木白蚁，茶新白蚁，西美木白蚁；蚤目，例如禽角叶蚤，飞蚤，病蚤，细蚤，犬栉首蚤，猫栉首蚤，禽角头蚤，人蚤，印鼠客蚤，短头客蚤，穿皮潜蚤；以及Tylenchida，例如Melodidogyne incognita，Pratylenchus penetrans。
在一个特别的实施例中，本发明组合物的活性是对抗双翅目的直裂亚目昆虫害虫。直裂亚目包括蚊科，蚋科，摇蚊科，毛蠓科，尖眼覃蚊科，蚤蝇科和覃蚊科。
本发明混合物抑制杀幼虫剂抗性的能力在下文实施例中详细描述。这些实施例是用来描述本发明优选的实施例和效用而不是打算限制发明，除非在所附的相关权利要求中有不同的陈述。
实施例1
本发明的组合杀幼虫剂配方为两种可商业获得的菌株的混合物：VECTOBAC CG，一种商品化的B.t.i.粒状配方，标记效力200ITU/mg，以及VECTOLEX CG，一种商品化的B.s.粒状配方，标记效力50B.s.ITU/mg。典型地，每种菌株的喷雾干燥工业浓缩物首先掺入到已知量的植物油粘合剂中。配方中植物油粘合剂的量将依赖于配方中B.t.i.或B.s.喷雾工业浓缩物的量。该典型的范围可以依赖于B.t.i.或B.s.喷雾干燥工业浓缩物的量，以及配方中使用的粒状载体的类型、大小和吸收性质而在1％到15％wt/wt之间变化。在该实施例中，使用大小分类10/14目的玉米棒子粉。不过，其它大小范围例如5/8目、10/20目、10/40目也是合适的。菌浆混合物喷到粒状载体上，同时在合适的搅拌机中混合并进一步搅拌，直到获得均一的产品。
实施例2
制备用于增强的和广谱活性的B.t.i.和B.s.粒状配方。B.t.i.和B.s.(VECTOBAC CG和VECTOLEX CG)的预配制粒状产品用于开发混合配方。所得的混合粒状产品设计为包含B.t.i.100ITU/mg和B.s.25B.s.ITU/mg。使用的载体是10/14目的玉米棒子粉。
为制备配方，VECTOLEX CG和VECTOBAC CG各5kg装料到搅拌机中并搅拌。然后回收产品混合物。
代表性的样本用于生物分析。表1显示了用于形成产品混合物的原材料的量。
表1
 
原材料 ％wt/wt Kg/批
VECTOBAC CG* 50.00 5.00
VECTOLEX CG** 50.00 5.00
总计 100.0 10.00
*商品化B.t.i.粒状配方，标记效力200ITU/mg
*商品化B.s.粒状配方，标记效力50B.s.ITU/mg
用B.t.i.和B.s.混合样品测试对抗第四龄埃及伊蚊和第三龄五带淡色库蚊的生物分析的结果显示于下面的表2。ITU代表国际毒性单位，其基于已知的特定B.t.i.效力的参考材料。
在优选的配方中，一比一的B.t.i.对B.s.重量比具有B.t.i.效力100ITU/mg以及B.s.效力B.s.25ITU/mg，其等价于效力基础上的4∶1的比例。
表2
 
样品 B.t.i.效力 B.s.效力
VECTOBAC CG 185ITU/mg 9B.s.ITU/mg
VECTOLEX CG 4ITU/mg 53B.s.ITU/mg
1∶1B.t.i.：B.s. 102ITU/mg 30B.s.ITU/mg
实施例3
杀幼虫剂混合物产品的配方也可通过在同一粘合剂液体中混合所需水平的两种B.t.i.和B.s.工业粉剂，然后注入或者喷雾到粒状载体上，例如玉米棒子粉或任何其它合适的载体上。
为制备配方，两种喷雾干燥的工业浓缩物可在植物油粘合剂液体中成浆，在合适的搅拌机中喷雾到粒状载体上并搅拌直到获得均一产品。包含B.t.i.(100ITU/mg)和B.s.(25B.s.ITU/mg)的混合配方的理论组分提供在下面的表3中。
表3
 
组分 ％wt/wt kg/批 用途
B.t.i.喷雾干燥工业浓缩物或粉剂(5000ITU/mg) 2.00 20.00 活性成分
B.s.喷雾干燥工业浓缩物或粉剂(1000B.s.ITU/mg) 2.50 25.00 活性成分
植物油粘合剂 10.00 100.00 粘合剂
粒状载体 85.5 855.00 载体
实施例4
混合配方的加工也可通过以期望的固体或效力水平预混合Bti和Bs的发酵料或菌浆浓缩物，喷雾干燥菌浆混合物以产生混合的工业喷雾干燥的粉剂浓缩物。在这样的配方中，菌浆浓缩物可包含防腐剂、稳定剂、表面活性剂、分散剂和其它粘合剂。喷雾干燥的工业浓缩物或粉剂可随后用于配方如实施例2和3的粒状产品或者作为可湿性粉剂、可水分散的粒剂、以及水性或非水性浓缩物。这些混合粉剂浓缩物也可用于丸剂和/或块剂配方。进行喷雾干燥实验来混合Bti和Bs发酵菌浆浓缩物，其不同的比例基于每种菌浆浓缩物的％固体水平。Bti菌浆浓缩物首先用0.12％wt/wt的山梨酸钾和0.06％wt/wt的对羟基苯甲酸甲酯进行防腐。防腐的Bti菌浆浓缩物中的％固体是11.3％wt/wt。类似地，Bs菌浆浓缩物用0.12％wt/wt的山梨酸钾和0.06％wt/wt的对羟基苯甲酸甲酯进行防腐。防腐的Bs菌浆浓缩物中的固体百分比是10.1％wt/wt。制备的菌浆混合物和它们的以固体计的比例列于表4。
表4 估计的Bti和Bs菌浆混合物
 
材料\以固体计的Bti与Bs比例 1:0 1:1 3:1 1:3 2:1 1:2
A B C D E F
防腐的Bti菌浆浓缩物 8.85Kg 4.42Kg 6.64Kg 2.21Kg 5.89Kg 2.95Kg
防腐的Bs菌浆浓缩物 --- 5.10Kg 2.55Kg 7.65Kg 3.41Kg 6.80Kg
去离子水 1.15Kg 0.48Kg 0.81Kg 0.14Kg 0.70Kg 0.25Kg
合计 10.0Kg 10.0Kg 10.0Kg 10.0Kg 10.0Kg 10.0Kg
表4所示的组合物使用Niro喷雾进行混合和喷雾干燥。进口温度范围在180℃到190℃之间以及干燥过程中的出口温度范围在68℃到81℃之间。工业粉剂通过100目标准筛过滤，样品对第四龄埃及伊蚊和第三龄五带淡色库蚊进行生物分析。平均效力数据表示在表5中。
表5，Bti+Bs喷雾干燥工业粉剂由它们以固体计的比例影响的效力数值。平均的Bti喷雾干燥工业粉剂的效力＝7474ITU/mg。平均的Bs喷雾干燥工业粉剂的效力＝3030Bs.ITU/mg(所有分析是初始的和5℃保存2月的样品的平均值)
 
以固体计的Bti与Bs的比例 理论Bti效力*(ITU/mg) 真实Bti效力(ITU/mg) 真实效力表示为％2栏的理论效力 理论Bs效力<sup>+</sup>(Bs.ITU/mg) 真实Bs效力(Bs.ITU/mg) 真实效力表示为％5栏的理论效力
1:1 3737 5174 138％ 1515 1624 108％
3:1 5606 6122 109％ 758 1088 144％
1:3 1869 4769 255％ 2273 2655 117％
2:1 4983 5499 110％ 1009 1479 147％
1:2 2489 3738 150％ 2020 2503 124％
平均值 3737 5060 1515 1873
表5显示的生物效力数据显示了Bti和Bs两者的真实效力对理论效力的有趣的但是协同的增加，其基于100％的Bti或Bs喷雾干燥工业粉剂的真实效力。对伊蚊和库蚊两者的活性增加的最佳混合似乎是当Bti与Bs菌浆浓缩物以固体计的1份Bti与2份Bs混合的时候。为增强Bs效力，最佳的混合是两份Bti固体与1份Bs固体混合。在该混合物中，Bs效力显示了相对于理论效力47％的增加。通过在喷雾干燥前混合Bti和Bs菌浆浓缩物，Bti效力平均值显示了相对于平均理论效力35％的增加而Bs效力显示了相对于平均理论效力24％的增加。看起来在喷雾干燥和进一步将这些粉剂配成粒剂、可湿性粉剂、可水分散的粒剂或者丸剂配方之前混合菌浆浓缩物是明显有好处的。对这些增强的效力值，最可能的解释看起来是由于每种喷雾干燥颗粒都带有Bti和Bs毒素以及芽孢的事实。换句话说，这些并不是实施例2或3显示的物理性混合物。因此，这些新颖的配制方法可能不仅导致了广谱的活性，也将发展形成抗性的可能性最小化。换句话说，抗性控制也可通过另一种新颖的配制方法而获得。
实施例5
混合杀幼虫剂配方也可以液体形式制备，通过加入期望水平的VECTOBAC WDG(3000ITU/mg)和VECTOLEX WDG(650ITU/mg)到喷雾罐的水中并混合直到获得均一的分散。这样形成的悬液可通过各种应用方法传递到目标栖息地。液体配方用于喷雾操作是理想的。
实施例6
液体配方可从每种单独菌株的液体配方制备。VECTOBAC 12AS和SPHERIMOS AS(由Valent BioSciences Corp.出售的水悬液产品形式)也可在喷雾罐的水中混合并通过各种喷雾设备使用。将B.t.i.和B.s.配成与防腐剂、稳定剂、表面活性剂、分散剂、稀释剂的水性配方仍然是另一种优选的用于传递两种毒素到蚊子栖息地的方法。
实施例7
已知对B.s.有抗性的五带淡色库蚊实验集落在应答B.t.i.和B.s.混合物选择时的敏感性改变在实验室中以下面的方式确定。选择是指低于LC100水平的处理。
抗B.s.的五带淡色库蚊集落是从采集自西部美国奶牛场的废水池的敏感性幼虫开始的。采集幼虫的场所受到每一代LC90的选择，进行四十代。在第40代，集落分别显示出对LC50和LC90水平的54.4倍和14.2倍的抗性。该集落用于后面的试验。
抗性集落是那种显示出对特定杀虫剂敏感性明显降低的集落，该杀虫剂对野生型昆虫具有预期的敏感性。通常，五倍或更多的敏感性降低表征了抗性。Rodcharoen等，Journal of Economic Entomoloav，Vol.87，No.5，1994，pp.1133-1140，更充分地探索了抗性原理。
敏感性集落是那种可被特定杀虫剂有效杀死的。例如，在五带淡色库蚊中，如果一种特定的杀虫剂，球形芽孢杆菌，具有小于0.1ppm的测定LC50值，则该集落的特征就是对那种杀虫剂敏感的。
储备悬液的制备通过在20ml蒸馏水中混合0.2g B.t.i.或B.s.以得到1％悬液；混合物的制备通过以期望的比例混合储备悬液。悬液随后按测试处理所需进行稀释。
亲代集落和第十代的生物测试通过放置20只晚期第三龄或早期第四龄的幼虫到含有100ml蒸馏水的116ml蜡纸杯中。每杯加入一勺幼虫食物(在20ml蒸馏水中的2g碾碎的兔肉小球)。杯子用一系列浓度范围的杀幼虫剂单独以及混合物处理。在每次生物测试中使用0.0001-0.1ppm范围的五到七个不同的浓度来得到死亡率。每次测试中每个浓度重复四到五次。处理的幼蚊保持在82-85℉。从用测试的杀幼虫剂处理时开始，定期计算死亡幼虫的数量，以确定LC50值。一旦所有的幼虫死亡，50％死亡的浓度就能确定了。
在LC80的水平用B.s.(球形芽孢杆菌菌株2362，ABG-6184，VECTOLEX，来自Valent BioSciences Corp.)或者B.t.i.(苏云金芽孢杆菌以色列亚种(VECTOBAC，来自Valent BioSciences Corp.)单独处理的集落与用1:2重量比的B.s.(VECTOLEX)对B.t.i.(VECTOBAC)在LC80水平处理五代，接着用1:1重量比的B.s.(VECTOLEX)对B.t.i.(VECTOBAC)在LC80水平再处理五代的集落进行比较。
在最初五代的这些处理之后，由1:2混合物进行选择的集落比由单独成分选择的任一集落获得了更低的平均B.s.LC50值，这标志着增加的敏感性和因此降低的抗性，如表6所示。在随后五代的过程中，在1:1混合物的选择下，平均B.s.LC50值继续下降。
表6
这个表显示了来自25代的原始选择研究的数据。在选择中，一个关键的变化是在10代之后，由B.t.i.选择的集落转到B.s.选择，以估测集落中敏感性的稳定性。
表6B.s.抗性集落在应答B.t.i.，B.s.以及混合物的选择中以ppm表示的B.s.敏感性的变化
 
处理 亲代集落的LC<sub>50</sub> 第5代的LC<sub>50</sub> 第10代的LC<sub>50</sub> 第15代的LC<sub>50</sub> 第20代的LC<sub>50</sub> 第25代的LC<sub>50</sub>
B.t.i. 0.49 0.351 0.205 *0.315 *0.366 *0.308
B.s. 0.49 0.452 0.42 0.42 0.554 0.464
B.t.i.和B.s. 0.33 0.273 0.103 0.153 0.035 0.04
*从10到25代转回到B.s.选择。
实施例8
使用实施例7描述的生物分析程序来估测B.s.抗性的和敏感的五带淡色库蚊集落。
确定每次处理的平均LC50值。更低的平均LC50值表征着特定的处理可以在更低的浓度有效使用，这表明生物对处理更敏感了。
结果提供在下面的表7中。正如预料的，B.s.处理给出了最高的B.s.抗性集落平均LC50。然而，2:1比例的混合物表现出比B.t.i.和B.s.单独使用的结果更好的结果，在敏感的和抗性的集落中都是，这表明了组分混合时的更高敏感性和可能的协同性。
表7
两种实验性五带淡色库蚊集落对B.t.i.，B.s.以及B.t.i.与B.s的2:1混合物的以ppm表示的敏感性
 
处理 抗性集落的平均LC<sub>50</sub> 敏感集落的平均LC<sub>50</sub>
B.t.i. 0.025 0.017
B.s. 0.330 0.009
2：1，B.t.i.比B.s 0.011 0.004
实施例9
B.t.i.与B.s.的2:1混合物对确定为B.s.敏感的五带淡色库蚊集落的效力如下进行测试。
五带淡色库蚊混合性敏感集落来自于从西部美国地区采集的卵筏混合物。采集的卵筏各自转移到230ml的蜡纸杯中，每个杯子有200ml自来水以及0.5g兔肉小球作为幼虫食物。幼虫被孵化出来。将虫蛹用水移到杯子中并置于筛笼中形成成虫。提供给成虫10％蔗糖溶液，并在成虫后第五天给雌蚊喂食有限的小鸡。在该血液喂食后第5天，产卵的杯子放入笼子中以采集卵。为在实验室中培养集落，将4-5个卵筏放在含有2升自来水和2g兔肉小球作为食物的搪瓷盘子中。
样品制备条件、生物分析方法以及LC50的确定与实施例7所述相同。结果提供在下面的表8中。结果显示，随着时间的过去，B.s.敏感的测试集落到应答B.s.单独处理的第五代时，变得不够敏感了，因为LC50值增加了。相反，2:1混合物没有显示出相同程度的同样趋势。该事实是数据表明的，其在显示出比亲代菌株增加的LC50的同时，也显示出比用B.s.单独处理时更少的增加。因此，2:1 B.t.i.与B.s.混合物的使用减慢了随时间的抗性。
表8
表8也显示了来自通过20代的原始选择研究的数据。在选择中，一个关键的变化是在5代之后，混合物选择的集落由2:1 B.t.i./B.s.混合物(VectoBac WDG/VectoLex WDG)转到1:1混合物选择。
表8  B.s.敏感集落在应答B.t.i.和B.s.混合物时敏感性的变化
 
处理 亲代集落的LC<sub>50</sub> 第5代的LC<sub>50</sub> 第10代的LC<sub>50</sub> 第15代的LC<sub>50</sub> 第20代的LC<sub>50</sub>
B.s. 0.009 0.035 0.066 0.194 0.124
B.t.i.和B.s. 0.009 0.024 0.028 0.013 0.044
实施例10
进行下面的实验来证实混合物用于控制不同种属蚊子的效用。在该实施例中，混合物以及单独的杀幼虫剂的效力是在五带淡色库蚊和埃及伊蚊的混合种群上确定的。
二十个塑料培养盆放在美国中西部地区的室外。这些盆充满了去离子水并添加2.4g碾碎的豚鼠食物为营养物。然后盆中滋生100只第三龄五带淡色库蚊和100只第三龄埃及伊蚊。滋生后一小时，就在处理之前，对盆子取样，计算每个盆子的测试样品中幼虫的数目以获得对照值。
测试的杀幼虫剂包括VECTOLEX CG(50B.s.ITU/mg，在玉米棒子粉上)，VECTOBAC CG(200ITU/mg，在玉米棒子粉上)以及VECTOLEX CG和VECTOBAC CG的1:1混合物，如实施例2所述。每个盆子用适量的三种测试杀幼虫剂中的一种进行处理，相当于单独处理的标准5、10或20磅/英亩。
在处理后第五天和第十二天，100只第三龄五带淡色库蚊和100只第三龄埃及伊蚊被加入到每个盆子中。
在处理后第二天、第七天和第十四天从盆中对幼虫取样，以确定有多少还活着。得到的数目与处理前的幼虫存活数进行比较。100％的减少就表示所有幼虫都被杀死了。正数值的减少百分比就表示杀幼虫剂确实杀死了幼虫。结果提供在下面的表9中，表明B.t.i.与B.s.的1:1混合物在测试的每个应用标准下都能够控制五带淡色库蚊和埃及伊蚊的幼虫，即使是经过了几天的时期。
表9
平均的减少百分比
 
处理 应用标准(磅/英亩) 幼虫减少％-第2天 幼虫减少％-第7天 幼虫减少％-第14天
1：1B.t.：B.s. 5 100 55 56
B.s. 5 95 77 34
B.t.i. 5 100 84 73
1：1B.t.：B.s. 10 100 98 91
B.s. 10 81 44 50
B.t.i. 10 100 92 78
1：1B.t.：B.s. 20 100 97 90
B.s. 20 88 82 64
B.t.i. 20 100 100 76
实施例11
进行另一个实验来证实混合物用于杀灭不同种属蚊子的效用。在该实施例中，混合物以及每种单独的杀幼虫剂的效力是在环喙库蚊上确定的。
测试是在西部美国的一个废水处理厂的废水池中的蚊子上进行的。这个池子被极度污染，标准测试表明存在环喙库蚊。高高的芦苇覆盖了80％的水面。池子边缘划分为大小在0.1到0.2英亩范围的六块地区，以用于测试。
就在处理前，每个测试地区取样，计算每个地区的测试样品中幼虫的数目以获得对照值。
测试杀幼虫剂是实施例10所述的配方，然后每个地区用适量的三种测试杀幼虫剂中的一种进行处理，相当于单独处理的标准5、或10磅/英亩。
在处理后第二天、第七天和第十四天从测试地区对幼虫取样，以确定有多少还活着。得到的数目与处理前的幼虫存活数进行比较。100％的减少就表示所有幼虫都被杀死了。正数值的减少百分比就表示杀幼虫剂确实杀死了幼虫。结果提供在下面的表10中，表明B.t.i.与B.s.的1:1混合物能够控制环喙库蚊幼虫。
表10
平均的减少百公比
 
处理 应用标准(磅/英亩) 幼虫减少％-第2天 幼虫减少％-第7天 幼虫减少％-第14天
1：1B.t.：B.s. 5 9 93 6
B.s. 5 90 100 100
B.t.i. 5 -25 47 28
1：1B.t.：B.s. 10 88 96 65
B.s. 10 83 98 65
实施例12
进行另一个实验来证实混合物用于杀灭不同种属蚊子的效用。在该实施例中，混合物以及每种单独的杀幼虫剂的效力是在路边沟渠的野外尖音库蚊和脉毛蚊上确定的。
西部美国的一个由公路分隔的路边沟渠的两个部分是研究的地点。沟渠生长着草和水生植物，并容纳来自腐烂机体和降雨的渗流物。一个具有类似的水文地理和植被的排水洼地选择为未处理的对照。每个地区在处理的时候都繁殖了尖音库蚊以及脉毛蚊。
就在处理前，每个测试地区取样，计算每个地区的测试样品中幼虫的数目以获得对照值。
测试杀幼虫剂是实施例10所述的配方，然后测试地点的两个用适量的两种测试杀幼虫剂中的一种进行处理，相当于单独处理的标准20磅/英亩。余下的测试地点不处理以作为对照。
在处理后第四天和第七天从测试地区对幼虫取样。得到的数目与处理前的幼虫存活数进行比较。100％的减少就表示所有幼虫都被杀死了。正数值的减少百分比就表示杀幼虫剂确实杀死了幼虫。结果提供在下面的表11中，表明B.t.i.与B.s.的1:1混合物能够控制尖音库蚊和脉毛蚊的幼虫。
表11
平均的减少百分比
 
处理 幼虫减少％-第4天 幼虫减少％-第7天
1:1B.t.:B.s. 100 98
B.s. 100 100
实施例13
B.s.(VECTOLEX)与B.t.i.(VECTOBAC)的2:1混合物的效力以下面的方式在田间确定。
测试地区是西部美国的一块稻田，测量为156英亩。在测试地区之间用堤作为缓冲区。在处理时，根据标准滴定测试，按蚊幼虫存在的密度为每勺0.5-3.0只。每种单独的杀幼虫剂以及杀幼虫剂混合物以12磅/英亩的标准由飞机施用，其以每小时85英里的速度和60英尺的扫描宽度施用粒剂。
在处理后第2、6和15天进行幼虫计数，并与未处理的对照测试地区的幼虫数比较。结果显示在下面的表12中，证实2∶1混合物能够有效杀灭幼虫，因为正数值的幼虫控制百分比表示杀幼虫剂确实杀死了幼虫。
表12
平均的减少百分比
 
处理 幼虫控制％-第2天 幼虫控制％-第6天 幼虫控制％-第15天
2:1B.t.i.与B.s. 50 100 0
B.s. 81 87 93
B.t.i. 100 100 90
实施例14
下面的研究证实了不同B.s.敏感的和不敏感的蚊子对混合物的敏感性。它们支持混合物作为一种控制蚊子以及控制B.s.抗性蚊子的方法的权利要求。三个研究也支持了在粒剂配方之前混合工业粉剂的方法。
B.t.i.和B.s.的1:1混合物配方用于控制B.s.抗性五带淡色库蚊田间种群的效力与每种配方分别进行比较。
材料与方法
一种高抗性的五带淡色库蚊种群是在泰国Nonthaburi省Bang Yai区的Wat Pikul鉴别的。该种群在2001年一月到九月之间用不同剂量的VectoBac WDG(3000 Bti ITU)和VectoLex WDG(650 Bs ITU)以及两者的1:1混合物进行处理。在每次处理后，种群变化通过滴定随时间进行估测，并计算处理后的晚龄幼虫和蛹的控制百分比。
结果
VectoLex WDG高达200mg/m2的剂量对该种群产生了很少或者没有控制。发现VectoBac WDG提供控制的剂量低至20mg/m2。发现两种产品的1:1混合物在20mg/m2的剂量下比单独的任一种产品都更有效。
表13
B.s.抗性五带淡色库蚊田间种群在用B.s.，B.t.i.，以及B.t.i和B.s.的混合物处理后的减少百分比
 
处理 第2天 第7天 第14天
B.s.650 ITU @ 200mg/m<sup>2</sup> 13 无 无
B.t.i.3000 ITU @ 20mg/m<sup>2</sup> 87 46 -53
1∶1混合物(B.s.325ITU+B.t.i.1500ITU)@20mg/m<sup>2</sup> 97 50 22
两种B.t.i./B.s.混合物配方用于控制尖音库蚊和脉毛蚊，在人工地区中与标准B.s.配方进行效力比较
材料与方法
2001年7月27日，在位于OR.，波特兰，5235N.Columbia Blvd的Multonomah郡蚊控区研究室所在地，使用浅水池建立了二十八个人工测试区。池子布置成四排，每排七个池子。每排指定为一个测试系列。池子用来自该区水源的自来水注入到大约8英寸的深度。该深度在整个研究过程中维持。每个池子具有大约0.785M2的表面积。每个池子富集稻草和兔肉食物(100gr.)用于提供幼蚊的栖息地和食物。
池子留给干草/兔肉食物混合物进行适应，并使本地蚊子的天然种群开始落户。在本地蚊子种群无法在研究池子中产生足够的种群后，对试验池子进行人工繁殖。在该初始繁殖之后，尖音库蚊和脉毛蚊种群通过天然再繁殖维持自身。
在研究中比较了标记为ABG6185、VBC60015和VBC60019的三种配方。ABG-6185包含形成在玉米棒子粉上的B.s.工业粉剂，具有50B.s.ITU的效力。VBC-60015和VBC-60019是形成在玉米棒子粉上的B.t.i.和B.s.工业粉剂的混合物，分别具有200B.t.i./50B.s.ITU和100B.t.i./50B.s.ITU的理论效力。配方以2.5kg/公顷和5kg/公顷的施用标准与未处理的对照比较进行测试。每个施用标准和对照组在测试系列中以任意方式进行四次重复。
使用标准蚊勺在每池取5勺进行取样，并用精密网孔过滤器浓缩幼虫捕获物。混合样品保存在乙醇中用于计数和种属鉴别。幼虫计数记录为第一龄-第二龄，第三龄-第四龄以及蛹。
处理前的计数和测试产品的应用在2001年8月20日进行。初始的处理后幼虫计数在处理后大约64小时的2001年8月23日进行。继续计数在8月27日、8月31日进行，最后计数在2001年9月6日。
控制成功通过计算每次测试的四次重复的第3和第4阶段幼虫平均数以及处理前后的蛹计数来确定。控制百分比通过并将Mulla′s公式应用到每次处理的总体种群平均值来计算。
结果
在处理后，所有处理过的地区的平均种群数相对于未处理的对照地区减少了，在处理后7天比对照组具有显著的降低(P＝0.05，Student-Newman-Keuls)。在处理个体之间具有数字差异，但是没有统计学上显著的差别。最初的减少(处理后第3天)对混合配方整体来说是最高的，类似的控制在整个研究期间都可以在配方中看到。来自2.5kg/公顷处理的减少百分比显示于表14。
表12修正了在2.5kg/公顷处理应用之后，人工地区的L3-L4库蚊和脉毛蚊幼虫的减少百分比。*
表14
 
处理 第3天 第7天 第11天 第17天
B.s.50 ITU 33.1 55.1 71 74.6
VBC 60015(B.t.i.200ITU/B.S.50ITU) 65.1 97.2 97.2 81.2
VBC 60019(B.t.i.100ITU/B.s.50ITU) 82.5 94.1 85.8 65.7
*相对于基于5次重复种群平均值的对照的修正
两种B.t.i./B.s.混合物配方用于控制环喙库蚊和尖音库蚊，在小田地区中与标准B.s.配方进行效力比较
材料与方法
测试地点是一个沼泽，小溪流在这里进入华盛顿Yakima附近的Yakima河。存在环喙库蚊和尖音库蚊的天然种群。水流基本上是停滞的。深度是6-12英寸并在试验期间保持恒定。水温在试验期间为72到77℉范围。植被主要是分散着阔叶草的草，覆盖80％的表面。植物高度是6-15英寸高。有时候牛在这个地方吃草，但是在试验期间没有出现。这个地方有机物质含量非常高。这个地区的食肉种群一般很少。
试验是一种每次处理用三个1000平方英尺的地区进行的随机化完全抑制实验。这些地区在2001年7月19日进行施用之前立即取样，并在施用后48小时、7天和14天再次取样。在每个地区用标准蚊勺取二十勺。在每勺中计数第一龄-第二龄幼虫，第三龄-第四龄幼虫以及蛹。
在研究中比较了标记为ABG6185、VBC60015和VBC60019的三种配方。ABG-6185包含形成在玉米棒子粉上的B.s.工业粉剂，具有50B.s.ITU的效力，VBC-60015和VBC-60019是形成在玉米棒子粉上的B.t.i.和B.s.工业粉剂的混合物，分别具有200B.t.i./50B.s.ITU和100B.t.i./50B.s.ITU的理论效力。配方以5磅/英亩的施用标准与未处理的对照比较进行测试。数据通过变量分析进行分析。减少百分比的计算用Mulla′s公式，仅在大幼虫和蛹的基础上进行。每次处理的总体种群平均值用于该计算。
结果
在处理后两天，所有三种配方都提供了明显的尽管并不突出的控制。5磅/英亩的标准可能对该地区来说是相当低的。在第7天和14天的控制并不是很显著，因为对照组中复制两代的幼虫种群只有很低的种群数。不过，所有的处理过的地区都比未处理的地区在第7天和14天具有更高的控制百分比。比较配方，似乎处理组之间在第2天没有任何差别，但是在第7天两种VBC配方都比ABG-6185好。使用L3-蛹的总体种群平均值计算的修正减少百分比显示于表15。
表15修正了以5磅/英亩处理应用之后，小田地区的第三龄-第四龄库蚊幼虫和蛹的减少百分比。*
表15
 
处理 第2天 第7天 第14天
B.s.50ITU 50.0 52.3 17.3
VBC 60015(B.t.i.200ITU/B.S.50ITU) 58.0 73.4 64.0
VBC 60019(B.t.i.100ITU/B.s.50ITU) 59.4 81.7 38.4
四种B.t.i./B.s.混合物配方用于控制Ochlerotatustaeniorhynchus，在人工地区与标准B.t.i.配方进行效力比较
材料与方法
在该研究中使用二十四个人工测试地区，其位于佛罗里达巴拿马市公共卫生昆虫研究与教育中心的John A.Mulrenan，Sr.。这些地区用3-5ppt盐水填充到大约6英寸的深度。该深度在研究期间维持。每个地区具有大约8英尺的表面面积。浮草和沙土底层存在于这些地区。在研究期间，水温平均为75华氏度。
测试地区的人工繁殖在初始处理之前以及处理后每隔一天进行。在每个繁殖日，大约1000只第三龄Ochlerotatus taeniorhynchus幼虫被加入到每个地区。
在研究中比较了标记为ABG6138s、VBC60015、VBC60016、VBC60018和VBC60019的五种配方。ABG6138s包含形成在玉米棒子粉上的B.t.i.工业粉剂，具有200B.t.i.ITU的效力。VBC60015、VBC60016、VBC60018和VBC60019是形成在玉米棒子粉上的B.t.i.和B.s.工业粉剂的混合物，分别具有200B.t.i./50B.s.ITU、100B.t.i./25B.s.ITU、200B.t.i./25B.s.ITU和100B.t.i./50B.s.ITU的理论效力。配方以2.8kg/公顷的施用标准与未处理的对照比较进行测试。数据通过变量分析进行分析。每个施用标准和对照组在测试系列中以任意方式进行四次重复。
取样使用标准蚊勺在每个地区取8勺。记录每个地区采集的幼虫数。初次取样在初始繁殖和处理后第1天进行，并在处理后第2、3、5、7、10和13天重复。
控制成功通过比较在处理过的地区采集的幼虫数与在对照地区采集的数目来确定。每次处理的死亡百分比使用下面的公式计算。
％死亡＝(#对照的幼虫数-#处理的幼虫数)/#对照的幼虫数
结果
在处理后一天，所有处理过的地区的种群数比未处理的对照地区明显降低。在第一天的平均减少百分数对于VBC60015为79.7％，对于VBC60018为98.5％。在这天处理组之间没有显著的差别。到研究的第7天，这些材料继续显示出效力，在此之后，控制百分比迅速降低。三种混合物处理，VBC60015、VBC60018和VBC60019，在13天的研究过程中提供了明显更高的总体减少百分比(LSMEANSSS多项比较测试，p＝0.05)。以2.8kg/公顷处理7天中的减少百分比显示于表16。
表16.以2.8kg/公顷处理7天中的减少百分比
表16
 
处理 第1天 第2天 第3天 第5天 第7天
B.s.50 ITU 84.9 58.8 51.6 71.7 14.8
VBC 60015(B.t.i.200ITU/B.s.50 ITU) 79.7 71.9 76.5 67.3 43.5
VBC 60016(B.ti.100ITU/B.S.25ITU) 84.2 75 19.3 63.8 20.5
VBC 60018(B.t.i.200ITU/B.s.25 ITU) 98.5 65.7 64.2 70.3 38
VBC 60019(B.t.i.100ITU/B.s.50 ITU) 91.3 67.1 62.7 60.4 28.1
所有引用的参考文献在此引入作为参考。
本发明通过前面的说明书和实施例阐明。前面的说明书打算作为非限制性的例证，因为根据这些，许多改变对本领域技术人员来说将成为显而易见的。因此打算将所有这些在所附权利要求的范围和精神之内的改变包括在内。
在不违背如下面权利要求所限定的发明原理和范围时，所述的本发明的方法、组合物、实施和安排可以改变。

Claims (3)

1.用于控制双翅目幼虫的组合物的制备方法，包括以期望的固体或效力水平预混合苏云金芽孢杆菌以色列亚种菌株和球形芽孢杆菌菌株的发酵料或菌浆浓缩物，喷雾干燥菌浆混合物以产生混合的工业喷雾干燥的粉剂浓缩物。
2.权利要求1的方法，其中所述组合物被配制成粉剂、粒剂、丸剂、块剂、可湿性粉剂、可水分散的粒剂、或者水性或非水性浓缩物。
3.权利要求1的方法，还包括向该组合物中加入选自以下的组分：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、食物兴奋剂、引诱剂、封装剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外线防护剂、缓冲液、漂移控制剂、喷雾沉积助剂、自由流动剂或者它们的组合。
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