CN107920535A - 用于控制节肢动物侵害的复合颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在可降解于节肢动物物种的幼虫的肠中的蜡的涂层中包含杆状病毒颗粒、任选的与杀虫剂组合的复合颗粒、制备方法、其用途和控制节肢动物侵害的方法。

Description

用于控制节肢动物侵害的复合颗粒
本发明涉及组合物、颗粒及其用途、控制害虫的方法以及生产用于控制害虫的组合物和颗粒的方法。特别地，本发明涉及包含昆虫病原病毒的组合物和颗粒、它们在植物材料上的用途、用昆虫病原病毒控制害虫的方法和生产颗粒的工艺以及用于使用此种生物体控制害虫的颗粒。
世界的人口正在不断增加，预期在2030年达到大约90亿。随着人口的增加，人们越来越需要生产更多的食物来养活自己，以及随之而来的养殖动物如家畜、鱼、家禽和人类所依赖的其它动物，至少在部分上是这样。以植物和植物源物质的形式提供人类、家畜和其它养殖动物所需的大多数食物来源，所述植物源物质来自耕种的谷类、蔬菜、产果实的植物如灌木、草莓、树莓、醋栗、酒如葡萄酒、百香果和奇异果等，以及坚果树例如榛子树、杏仁树、核桃树、巴西坚果树、腰果树等；产自树木的油如棕榈油、坚果油等；产自树木的水果如柑橘、苹果、梨、桃子、李子、芒果、木瓜等。使用的和/或人类种植的其它植物资源包括木本植物如用于木材例如如用于建筑施工、造船、家具制造与围栏的树木；用于生产衣服材料而耕种的植物，如棉花、麻和亚麻等。
对人类有重要农艺意义的植物不断受到害虫，如将卵产在植物的地上部分地下部分的节肢动物，的侵袭。卵孵化成幼虫，然后幼虫以植物为食，从而导致每单位面积的农田的产量降低以及新生成的节肢动物数量增加。如果任由发展，造成的经济损失是显著的，并可能变成实质性损失，或者在主要的农作物侵害下会导致整个农作物的损失。
在保持节肢动物的进化前的一步和/或维持或改善节肢动物控制活动是一场持续的战斗，但化学药品的长时间使用也显示出节肢动物种正在产生抗药性。
与液体形式提供的抗田间节肢动物的化学试剂的常规使用相关的一个问题是，虽然提供的化学试剂在施用后短期内是有效的，但是在更长时间使用后，活性水平往往会下降和/或目标害虫会产生抗药性。结果，为保持对节肢动物侵害的控制，使用者不得不更频繁地施用化学药剂。进而，这也意味着施用化学药剂的四周将常常会含有高化学药剂载量并且这可对环境、特别是对动如包括人类的哺乳动物以及其它物种如鸟、两栖动物和有益节肢动物如蜜蜂、食蚜虫瓢虫、蜘蛛和蝴蝶有副作用。
过去已经在使用生物试剂并且现今也在使用生物试剂来控制昆虫害虫。
已被证明在控制农作物上的节肢动物中有用的某些生物试剂包括无脊椎动物特异性杆状病毒。杆状病毒是环状DNA病毒，其可分为四个种类：α杆状病毒(鳞翅类特异性昆虫核型多角体病毒[NPVs])、β杆状病毒(鳞翅类特异性颗粒体病毒[GVs])、γ杆状病毒(膜翅目昆虫特异性昆虫核型多角体病毒)和δ杆状病毒(双翅类昆虫特异性昆虫核型多角体病毒)。在这些种类中，对于本发明的目的来说最重要的有两类：昆虫核型多角体病毒(NPVs)和颗粒体病毒(GVs)。
GVs每个包膜仅含有一个核壳体，NPVs每个包膜含有单个(SNPV)核壳体或者含有多个(MNPV)核壳体。被包裹的病毒体进一步被包含在颗粒体蛋白基质(GVs)中或多角体蛋白基质(NPVs)中。而且，GVs每个颗粒体蛋白包涵体仅有单个病毒体，而多角体可包含多个嵌合的病毒体。
杆状病毒往往具有窄的宿主节肢动物范围，即，昆虫范围，传染性限于原始宿主属或族。杆状病毒具有额外的对脊椎动物如包括人类的哺乳动物基本上没有毒性的优点，但通常不知道其对有益昆虫、鸟或者对水生生物体有毒。
本领域已知包含用于控制害虫的杆状病毒的组合物。US 6521454提供了一种杀虫组合物，包含(a)有效地在昆虫内产生致死或使衰弱的感染的杆状病毒和(b)至少1mM的二价阳离子。
然而，使用杆状病毒特别是NPVs和GVs并且基于本发明的目的遇到的其中一个问题是它们易受UV降解的影响，当以常规的商品制剂施用时，通常会在施用后2-7天的农作物上显示出田间抗性。这个问题在US2014/086969中也有部分表述，该文献公开了抗-UV明胶/二氧化硅涂覆的病毒颗粒和使用其控制农业害虫的方法。
还已知杆状病毒是温度敏感性的。某些杆状病毒如桑葚的NPV已经显示出易受50℃的温度的影响，在该温度下，它们会失活且不再能感染和杀死目标节肢动物(Priyadharshini&Narayanaswamy(2012)EJBS 5(1)pp22-26.其它杆状病毒已显示出易受60℃或以上的温度的影响，如苹果蠹蛾病毒(Pemsel M.等(2010)The Journal ofSupercritical Fluids,53,174–178)。本发明中使用的病毒的热敏感性致使在现有技术中创造了病毒包膜方法，所述病毒包膜方法导致产生采用温度保持较低即低于60℃的气体饱和溶液(Pemsel等如上)的颗粒。WO96/01055记载了一般的包膜方法及其用于制备食物产品得到的产品。更详细地，公开了包含具有分散在其内的包涵体的纤维基质的食物产品。
与常规商业制剂相关的另一个问题是选择的病毒通常以裸露的形式悬浮于含水制剂中，这易于使病毒的寿命在氧化作用下受到限制或缩短。
还需要提供更多的选择用在农作物植株上的病毒试剂的UV稳定性制剂。还需要提供其中所选择的病毒不易受氧化作用影响的制剂。
还需要提供含有选择的用于田间即正在生长的农作物和/或收获的或“切割”的产品以及包括加工的干制品、谷类和源自其的加工产品的食物的存储中的病毒试剂的改进的制剂。
本发明的一个明显的优点在于提供了比目前已知的包含杆状病毒的制剂在田间和/或储存中的存留时间更长的农药制剂。
本发明的另一个明显优点在于提供了包含选择的能够控制在其地上结构分泌作为防御植物病毒的植物化学物质的植物(如豆类如鹰嘴豆)上的害虫幼虫的杆状病毒的改进的农药制剂。如果其采用常规制剂来施用，此类植物分泌物能够降低选择的生物试剂的有效性(Stevenson,D’Cunha&Grzywacz,化学生态学杂志.2010年2月；36(2):227-35.doi:10.1007/s10886-010-9748-8.电子版2010年2月10日)。
通过以下描述和示例，可使这些和其它需要及优点变得显而易见。
作为发明的第一方面，提供了一种组合物颗粒，包含：
i)至少一种杆状病毒颗粒；和
ii)用于i)的杆状病毒的蜡质包膜涂层，所述蜡质包膜涂层由至少一种可在节肢动物物种的幼虫的肠中降解和/或溶解的蜡组成；以及
iii)可选地，一种可被昆虫幼虫摄取的杀虫剂，如拟除虫菊酯和/或有机磷酸酯。
自然地，本领域技术人员将理解基于本发明的目的，“复合颗粒”是指个体颗粒。此类个体颗粒可聚集在一起形成施用于农作物和/或食物产品的颗粒群。根据本文所概括的最终目的，此类颗粒群可以是液体或干粉形式。
病毒颗粒可选自目的物种的杆状病毒颗粒，如选自α杆状病毒和/或β杆状病毒，即，核型多角体病病毒(NPVs)和/或颗粒体病病毒(GVs)。优选地，杆状病毒颗粒是NPV或GV杆状病毒包涵体的形式。本发明中使用的适宜病毒颗粒包括NPVs或GVs的杆状病毒包涵体，如选自玉米夜蛾NPV、棉铃虫NPV、甜菜夜蛾NPV、棉贪夜蛾NPV、莎草黏虫NPV、黎豆夜蛾NPV、舞毒夜蛾MNPV、冷杉锯角叶峰NPV、黄杉合毒蛾NPV、红头新松叶枫NPV、粉蚊夜蛾NPV、苜蓿丫纹夜蛾NPV、斜纹夜蛾细胞NPV、斜纹夜蛾NPV、苹果蠹蛾GV、小菜蛾GV、苹果异形小卷蛾GV、马铃薯麦蛾GV、黄小卷叶蛾GV、长卷蛾GV、印度谷螟GV、茶小卷叶蛾GV等。优选地，根据目的和所述的用于田间的应用，病毒生物试剂选自玉米夜蛾NPV、棉铃虫NPV、甜菜夜蛾NPV、棉贪夜蛾NPV、莎草黏虫NPV、黎豆夜蛾NPV、苹果蠹蛾GV和印度谷螟GV。根据物种，NPV杆状病毒的包涵体的长度为0.15μm至15μm级，GV杆状病毒的包涵体的大小是170-500nm级。NPV物种的病毒体的长度是230-420nm级，而GV物种的病毒体的长度是260-500级。
病毒颗粒被至少部分地包裹或封装于蜡中。人们认为通过适宜的含蜡材料对本发明中使用的个体病毒颗粒进行包裹或封装的程度最小应为至少30％，优选的至少50％，仍优选的至少大约80％、90％或95％。最优选地，选择用于本发明的病毒颗粒被完全包封于蜡或者是能够在目标害虫幼虫和/或幼体的肠中破碎或降解和/或溶解的蜡的掺混物中。基于本发明的目的，本文使用的词“幼虫”和“幼体”是指捕食国产农作物、对人类有商业益处的植物和无论加工与否的源自植物如木材、干制品以及包括本文涉及的那些的衣着材料的植物产品的昆虫幼虫。词“幼虫”和“幼体”可替换使用，除非上下文有不同要求。由蜡进行包裹保护选择的病毒颗粒不暴露于UV和其它环境危害如氧化条件中。适宜的蜡包括能充分溶解或降解或表面腐蚀以在幼虫的肠环境中例如在碱性pH中释放至少一个有活力的病毒颗粒的那些。此类蜡通常选自可被幼虫摄取的天然蜡如巴西棕榈蜡、米糠蜡、小烛树蜡、甘蔗蜡、欧里克里蜡(ouricouri wax)、可被幼虫摄取的合成蜡如酰胺蜡、聚乙烯蜡、功能化聚乙烯蜡、氧化聚乙烯蜡等或其两种或多种的混合物或掺合物。如果使用蜡的掺合物，那么所述蜡可以1:99至99:1的比例、优选的5:95至95:5的比例或其中任意适宜的比例使用，如天然蜡的50:50掺合物，例如米糠蜡和小烛树蜡。在某些情况下，可摄取的蜡可由硬蜡(例如巴西棕榈蜡或蒙坦蜡)和至少一种可被目的物种的幼虫摄取的软蜡如本文描述的天然或合成蜡(例如小烛树蜡、米糠蜡或其掺混物可进一步掺混在一起)组成。在本发明中使用的蜡的掺混物中，将硬蜡添加至软蜡中的目的是使研磨过程最优化。蜡还可包括添加的喂养兴奋剂如糖，例如以微粒或液体形式混合于其中的蔗糖、果糖、棕榈糖、金色甘蔗糖浆等、糖蜜、蜂蜜、山梨糖醇或者其它人工或有机诱饵(Ballard J等,生物科学技术,卷10,第5期，第627–640页2000DOI:10.1080/095831500750016424)，包括选自醇类、脂类和芳香化合物的挥发物，如乙酸乙酯、3-甲基丁醇、己酸乙酯、2-苯基乙醇、碘苯腈辛酸乙酯、(E)-4葵烯酸乙酯、葵烯酸乙酯、十二烷酸乙酯等(El-Sayed A.M.,农业食品科学，2005,53(4),第953–958页DOI:10.1021/jf048521j)，或者其它植物提取物或幼虫引诱剂，如幼虫聚集信息素，例如苹果蠹蛾的幼虫聚集信息素(Jumean等(2004),加拿大昆虫学家,卷136,第871-873页)。可添加至或包含在本发明的复合颗粒中的另外的助剂包括印楝油和/或可与病毒协同作用的印楝素(Nathan and Kalaivani,(2005),生物防治,34(1)pp.93-98)。
此外，可在本发明中使用的蜡可由几种不同的蜡组成，这些不同的蜡可熔融为液体或者采用足以使蜡软化的温度在压力或热的作用下熔化在一起，使得选择的杆状病毒颗粒可添加至并且至少部分封装于其内。一旦选择的杆状病毒试剂添加至蜡中，蜡便被迅速冷却至固态，然后采用常规的设备和本领域已知的工序粗磨、粉碎和/或空气喷射研磨至所需的颗粒大小。
此类附加的蜡可选自矿物蜡和合成蜡，条件是可在幼虫的肠中降解和/或消化(如，通过酶解和/或在目的幼虫的肠中溶解于pH 8至12的幼虫肠环境中)的至少一种蜡、优选的本文所述的天然蜡或天然蜡的掺混物是熔化或混合物形式，杆状病毒试剂能够在幼虫的肠中从蜡掺混物中释放出来。通常，根据设计，本发明中使用的天然蜡具有≥40℃的熔化温度。本发明中使用的适宜的天然蜡包括具有优选≥50℃的熔点的蜡，最优选的由具有≥70℃的熔点的硬蜡组成。本发明中使用的天然蜡的示例包括巴西棕榈蜡、蜂蜡、中国蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡、羊毛蜡、甘蔗蜡、阿根廷波西尼亚灌木蜡等。
与可溶解于在目标幼虫的肠中的天然蜡一起熔化或在压力下与可溶解于在目标幼虫的肠中的天然蜡熔化的合成蜡包括选自固体石蜡、微晶蜡、乙烯蜡、费托蜡(Fischer-Tropsch)、取代酰胺蜡、聚合α-烯烃等的蜡，只要目标幼虫能够摄取此类合成蜡。进一步地，可与降解于目标幼虫的肠中的天然蜡一起熔化或在压力下与可降解于目标幼虫的肠中的天然蜡熔化的蜡包括选自蒙坦蜡(例如，Bayer)、纯地蜡、天然地蜡、泥煤蜡等的矿物蜡，只要目标幼虫能够摄取此类矿物蜡和/或合成蜡并且只要选择的部分封装或全部封装的病毒颗粒可从其中释放出来。
可将拟除虫菊酯或有机磷酸酯杀虫剂形式的任选的成分添加至本发明的复合颗粒中以提高对目标昆虫物种如目标鳞翅类物种的病毒控制的功效。可添加至本发明的含有目标杆状病毒颗粒的复合颗粒中的适宜杀虫剂包括α-氯氰菊酯、γ-三氟氯氰菊酯、[氰基-(3-氧基苯基)-甲基]-3-(2,2-二溴乙烯基)-2,2-二甲基环丙烷-1-羧酸酯(溴氰菊酯)、τ-氟胺氰菊酯、嘧啶磷、甲基、毒死蜱、马拉松、特丁磷、亚胺硫磷、噻虫嗪、噻虫、啶虫脒、多杀菌素、绿虫酰胺等。
本发明的复合颗粒所靶向的节肢动物物种包括鳞翅目的农作物害虫物种、双翅目的害虫物种、鞘翅目如金龟子科的害虫物种。可使用本发明的复合颗粒靶向的昆虫害虫通常为鳞翅目的成员且包括在食物加工和食物存储地点滋生的鳞翅目物种的幼虫，如也被称为仓鼠蛾的烟叶螟(Ephestia elutella)、地中海粉斑螟(Ephestia Kuehniella)[也称为“印度粉斑螟”和“磨蛾”]、葡萄干斑螟(Cadra figulilella)、粉斑螟(Cadra cautella)和印度谷螟(Plodia interpunctella)。其它在正在生长的农作物上滋生的、可使用本发明的复合颗粒靶向的昆虫害虫包括也称为西红柿果虫或烟草蚜虫[Helicoverpa zea]的玉米穗虫、棉花螟蛉虫、豆荚蛀虫[Helicoverpa armigera]、甜菜夜蛾[Spodoptera exigua]、埃及斜纹夜蛾[Spodoptera littoralis]、非洲甜菜夜蛾、绒毛豆毛毛虫[Anticarsiagemmatalis]、舞毒蛾[Lymantria dispar]、苹果蠹蛾[Cydia pomonella]、小菜蛾[Plutella xylostella]、假苹果蠹蛾[Thaumatotibia leucotreta]、马铃薯茎蛾[Phthorimaea operculella]、棉褐带卷蛾[Adoxphyes orana]、东方茶卷叶蛾[Homonamagnanima]和茶小卷叶蛾[Adoxophyes honmai]的幼虫。
在本发明的另一方面，提供了一种生产本发明的复合颗粒的方法，步骤如下：
i)熔化至少一种蜡；
ii)将杆状病毒颗粒添加至i)的熔化的蜡中并与之混合足够时长使其至少部分包覆该病毒颗粒；
iii)将ii)的产物快速冷却至固体；以及
iv)将iii)的产物粗磨并粉碎至可被幼虫摄取的颗粒大小。
在步骤i)中，蜡可以是本文所述的单一的蜡或蜡的混合物。i)的蜡可被熔化，形成液相，选择的病毒颗粒例如杆状病毒颗粒如包涵体随后可添加至该液相并在步骤ii)中与之混合以在快速将ii)的产物冷却至固体形式之前使用高能混合器形成均相混合物。例如，通过以下步骤快速实现冷却步骤iii)：将ii)的液体掺合物倒入大的浅盘中或其他适宜容器中，然后置于适宜的冷冻装置如冷冻箱内，并保持在大约-5℃至-30℃范围内的温度如-24℃下。进一步地，实现i)中的快速熔化和步骤iii)中ii)的产物的冷却的手段包括使用商业上可获得的带盖容器，如从Lee工业,菲利普堡,美国可获得的具有超级护套的D型反应釜，该带盖容器能够将本发明的掺合物加热至高液化温度，然后将其快速冷却至之间温度如掺混物的熔化温度，之后将冷却的液体倒入容器如托盘中，进一步冷冻，形成蜡的固体。出人意料地，人们发现杆状病毒如杆状病毒包涵体能够耐受极高的温度较短时间，而活力却没有显著损失。发明人已示出杆状病毒颗粒能耐受最高140℃的加热温度较短时间例如长达5分钟并存活，而活力没有显著损伤。而且，发明人发现病毒能够耐受低温并存活，例如耐受并存活于低至大约-25℃、长达12小时左右的较短时间，优选的1至5小时的时间段，例如1至2小时，之后仍保持活力。令人意想不到的发现是，杆状病毒颗粒令人惊讶地对极端温度具有适应性，所述极端温度使得本发明成为可能，因为制备本发明之前，人们认为杆状病毒不能耐受50℃以上的温度，所以使用液体蜡基的制剂来包裹杆状病毒被认为是不可行的。
一旦完成iii)的冷却步骤，将所得到的蜡块粗磨、粉碎和微粒化至所需体积平均直径如在1μm至200μm、优选的1μm至100μm、更有选的1μm至50μm、更有选的2μm至40μm例如5至30μm、8至15μm以及最优选的10至15μm范围内的颗粒大小，如本文所概括。
使用本领域标准所公认的方法和装置来适宜地测量颗粒大小。分散体中颗粒的测量可使用多种技术来完成，包括激光衍射、动态光散射(DLS)、光盘分离和光学显微镜学。所有这些技术都有其优点和限制。激光衍射依赖于样本对测量区域的良好控制的呈现并限制为具有窄的颗粒浓度范围的样本。通常要求稀释，这可影响尤其是具有高溶解度的化合物中的颗粒大小。定尺寸的设备由马尔文仪器公司(英国)使用激光衍射方法制造的。对于高度不规则颗粒，直径为任意尺寸中的最佳直径，即使该颗粒是相对非球形的。
本领技术人员将认识到如果根据本发明的该方面来生产本发明的复合颗粒，可将化学农药添加至步骤i)的熔化的蜡中，如上所述。适宜的化学农药包括选自有机磷酸酯和拟除虫菊酯如α-氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、[氰基-(3-氧基苯基)-甲基]-3-(2,2-二溴乙基)-2,2-二甲基-环丙烷-1-羧酸酯(溴氰菊酯)、τ-氟胺氰菊酯、甲基嘧啶磷、毒死蜱、马拉松、特丁磷、亚胺硫磷、噻虫嗪、噻虫胺、啶虫脒、多杀菌素、氯虫酰胺等的那些。
在本发明的另一方面中，提供了本文所限定的复合颗粒在控制对田间农作物植株的幼虫侵害、优选的在减少农作物植株上的幼虫存活数目方面的用途。田间农作物植株上的用途包括在果树如苹果树、梨树、樱桃树和桃树，十字花科蔬菜如卷心菜、花椰菜、布鲁塞尔豆芽和羽衣甘蓝，谷物如玉米作物(玉米)、小麦、黑麦、大麦和高粱、大米，坚果树如杏仁树、山胡桃树、榛子树、巴西木和腰果树，葡萄藤、常青树如道格拉斯冷杉、火炬松、棉花、豆类如藜豆，茄属物种如土豆、西红柿、茄子、辣椒、烟草和壁冬茄属的农作物植株上的用途。
本发明的复合颗粒可预防地用在收获的和/或已加工的农作物产品上或内以鳞翅类害虫侵害的风险降至最低。收获的和/或已加工的干制农作物产品可置于存储区如谷粒存储区，包括收获后或已加工前谷粒立即存储其内的谷粒粮仓和谷粒箱柜。其它干制食物和谷谷粒存储区包括装运前干制食物和谷粒存储其内的仓库和运输设施如船运集装箱、船坐、卡车等。在收获的和/或已加工的农作物产品上的用途包括在包括全谷粒如小麦、稻米、大麦和玉米作物(玉米)、干豆、黄豆和扁豆的干制品和源自或由干制品如包括意大利面、谷物粉、蒸粗麦粉、早餐谷物的加工食品、干制草药、国产牲畜饲料如猪、牛、羊和马饲料、粗粒小麦粉、面包、坚果(研磨的、薄片状和/或完整的坚果)、零食例如包括饼干、薯片、蔬菜片、脆饼干、芝士饼干和干煎饼的甜且开胃的物品制成的产品上的用途。
在本发明的另一方面，提供了应用于包含本文所述的复合颗粒的农作物植株中的组合物。此类组合物可由液体介质中即悬浮液形式的颗粒组成。因此，作为一种选择，提供了用于控制对植物的节肢动物侵害的包含复合颗粒的液体制剂，其中，所述液体制剂由以下组成：
i)悬浮于液体液体制剂内的可在至少一种目标节肢动物物种的幼虫的肠中降解和/或溶解的蜡质颗粒；和
ii)至少部分被包裹于i)的蜡质颗粒内的至少一种杆状病毒颗粒形式的杆状病毒物种，所述至少一种杆状病毒物种具有抗i)的目标节肢动物物种的幼虫的活性；以及
iii)任选地，选自本文所限定的拟除虫菊酯和/或有机磷酸酯的一种杀虫剂。本发明的液体制剂通常具有1μm至200μm、优选的1μm至100μm、更优选的1μm至50μm、更优选的2μm至40μm例如5至30μm、8至15μm以及最优选的10至15μm的范围内的体积平均直径，如本文概括。
在本发明的液体制剂中使用的病毒颗粒至少部分被包裹或封装在选择的蜡中，如本文概括。人们认为，通过在本发明的液体制剂中使用的适宜的含蜡材料来包裹或封装个体病毒颗粒的程度最小应为至少30％、优选的至少50％以及更优选的至少大约80％、90％或95％。最优选的，本发明中使用的选择的病毒颗粒被完全包裹于能够在目标害虫幼虫和/或幼体的肠中破碎或者降解和/或溶解的蜡或蜡的掺合物中。
本发明的颗粒可采用含水液体或含油液体形式来施用。在任意形式中，本领域技术人员将认识到本发明的液体组合物包含至少部分被包裹并保护病毒颗粒免受环境因素如UV光和氧化作用影响的复合颗粒。优选地，病毒颗粒被复合颗粒的蜡或蜡的掺合物完全包裹。
根据设计，本发明的液体制剂可被制为含水制剂或含油制剂。含水制剂可包括表面活性剂，所述表面活性剂选自商业上可获得的以商标如Libsorb、Silwet、Tween、Span、Tensiofix、Brij、Torpedo、Newmans、Lansurf、Atplus、Atlox、Synperonic、Fortune、Guard、Rhino、Biopower等售卖的表面活性剂。这些表面活性剂中，Tensiofix和Span是最优选的。
根据本发明该方面的液体制剂可包括液体或固体形式的额外的喂养刺激剂，如上文所述。
根据本发明该方面的液体制剂可应用于选自植物组织如叶子、茎、果实主体和花朵的真核生物组织。
含油制剂即油分散(OD)制剂可含有适于在本发明中使用的任意油，所述油选自石油油料如本领域已知的石蜡油、夏季喷雾油、范围的芳烃油溶剂、溶剂汽油和冬季喷雾油，以及蔬菜油如菜籽油、豆油、葵花籽油、棕榈油等。
由于组合物的含水元素会蒸发或者在含油元素存在的情况下，油会分散，所以一旦被递送至目标表面，本发明的复合颗粒即能够附着其上，并且能被喂养的目标幼虫摄取。选择的生物试剂的包裹或封装程度应能保护所述生物试剂免受本文提及的环境因素的影响。目标真核细胞表面包括活的植物组织如正在生长的植物和收获的或“切割”的材料的植物表面，例如其上可发现目标昆虫幼虫的叶子、茎和花朵。
以液体组合物形式施用的本发明的复合颗粒应通过被目标幼虫摄取而有效得控制侵害植物的目标昆虫幼虫种群。在本发明中使用的杆状病毒颗粒必须能够从处于目标幼虫的肠的内部的本发明的复合颗粒中释放出来，一旦被释放出来即能够杀死幼虫。
本发明的液体组合物可包括一种以上的杆状病毒颗粒，例如上文所述的目标幼虫特异性杆状病毒和另一杆状病毒颗粒，二者都具有控制目标害虫幼虫的侵害种群的能力。因此，本发明的包含携带两种不同的选择的杆状病毒颗粒的本发明复合颗粒的组合物可以更有效地杀死的目标幼虫。因此，本发明的单一液体组合物可包含负载有能够靶向目标害虫幼虫的选择的相同或不同物种的至少两种杆状病毒颗粒的本发明复合颗粒。或者，本发明的液体组合物可包括两个或更多个复合颗粒，其中每个复合颗粒进一步负载有选自能够靶向害虫幼虫的有机磷酸酯和拟除虫菊酯的不同的化学农药。如果存在的话，通常在蜡与杆状病毒颗粒一起处于熔化状态的同时添加化学农药。
在本发明的另一方面，提供了干粉组合物，所述干粉组合物能有效地控制存储产品中的节肢动物侵害，包含复合颗粒，其中所述干粉组合物由以下组成：
i)可在至少一种目标节肢动物物种的幼虫的肠中降解或溶解的蜡质颗粒；和
ii)至少部分包封于i)的蜡质颗粒内的至少一种杆状病毒颗粒形式的杆状病毒物种，所述至少一种杆状病毒物种具有抗所述节肢动物幼虫的活性；以及
iii)任选地，选自本文所限定的拟除虫菊酯和/或有机磷酸酯的一种杀虫剂。
本发明的干粉组合物中的蜡质颗粒通常具有1μm至200μm、优选的1μm至100μm、更优选的1μm至50μm、还更优选的2μm至40μm例如5至30μm、8至15μm以及最优选的10至15μm的范围内的体积平均直径，如本文概括。
本发明的干粉组合物中使用的病毒颗粒至少部分被包裹或封装于选择的蜡中，如本文概括。人们认为，通过本发明的干粉组合物中使用的适宜的含蜡材料来包裹或封装个体病毒颗粒的程度最低应为至少30％、优选的至少50％和更优选的至少大约80％、90％或95％。最优选地，选择在本发明的干粉组合物中使用的病毒颗粒被完全包裹于能够在目标害虫幼虫和/或幼体的肠中破碎或降解和/或溶解的蜡或蜡的掺混物中。
本领域技术人员将认识到，无论是作为干粉还是作为液体制剂来施用，本发明的复合颗粒都可含有其它所需的成分，如选自UV阻滞剂如氧基甲氧基肉桂酸酯、改性豆油、氧化锌纳米颗粒、β-胡萝卜素或p-氨基苯甲酸、着色剂如荧光增白剂和商业上可获得的着色剂如食品着色剂、增塑剂如甘油或大豆油、抗氧化剂如维生素E、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化苯甲醇(BHT)以及其它存在的抗氧化剂或其还混合物。本领域技术人员将认识到将根据最终目的来选择此类通常包含的助剂。本领域技术人员还将认识到本发明的复合颗粒中的任何助剂都应是不会显著受到摄取所述颗粒的目标幼虫的能力的干扰的助剂。
在备选中，本发明的复合颗粒可作为干粉存出现在农作物植株或收获的和/或加工的农作物产品中。
在本发明的另一方面，提供了一种控制节肢动物侵害、优选地降低对谷类或加工食品的节肢动物侵害的方法，其中根据本发明的干复合颗粒通过以下步骤存在于谷类或加工食品的表面上：
i)将复合颗粒收集于除尘装置中；
ii)将所述的颗粒从所述除尘装置释放到所述谷物或加工食品的表面。
在本发明的另一方面，提供了一种控制节肢动物侵害、优选地降低对谷类或加工食品的节肢动物侵害的方法，其中根据本发明的干复合颗粒与谷类或加工食品混合。
在本发明的再一方面，提供了一种控制节肢动物侵害、优选地降低选自谷类存储区和干制食物存储区的存储区内的节肢动物侵害的方法，其中根据本发明的干复合颗粒通过以下步骤存在于存储区的表面上：
i)将复合颗粒收集于除尘装置中；
ii)将i)的颗粒从所述除尘装置中释放到所述存储区的表面。
在本发明的另一方面，提供了农作物植株或包裹有本文所限定的颗粒的收获的产品。
现将举例说明本发明。要理解的是所述示例不应视为以任何方式限制本发明。
示例部分
介绍
本工作描述了配制蜡质颗粒制剂中的病毒所需的方法。
关键词：
BV：杆状病毒包涵体原材料
NPV：核型多角体病毒，一种在BV伞护种下包括的病毒的杆状病毒科家族属
GV：颗粒体病毒，一种在BV伞护种下包括的病毒的杆状病毒科家族属
EBV：通过下述方法制成颗粒的杆状病毒颗粒包涵体
EBV+:通过下述方法制成颗粒的杆状病毒颗粒包涵体，其也含有该文献中之前描述的其它类型的助剂如诱食剂和聚集信息素。
1.材料:
源于NRI小烛树蜡和米糠蜡的活性成分(所选择物种的BV-靶向海灰翅夜蛾或埃及棉叶虫的SpliNPV)
2.设备：
加热板，加热至150℃(斯图尔特科技有限公司)
精确到小数点2位的天平
冷冻箱，冷却至至少-24℃(任何品牌/模型都可以)
高剪切混合器/均质器(T18数字)
粗磨磨机(KT操作公司，型号04)
粉碎磨机(公司314s型)
空气喷射磨机(任何品牌/模型都可以)
适宜尺寸的样品罐
3.详细程序
3.1使用校准的天平称量所需数量的载体蜡-125,0g米糠蜡和125,0g小
烛树蜡。
将50:50的小烛树蜡和米糠蜡(％w/w)置于盘中并置于温度设置为120℃的加热板上。加热蜡直到完全熔化并观察到不含固体的澄清液体。
使用校准的天平称量一定数量的以1％w/w计的活性BV。
3.1.1在总共60s内快速地将BV添加至熔化的蜡中并通过高剪切混合(使用高剪切混合器T18)分散在熔化的蜡中以确保在蜡中的均匀分散。
3.2然后，将蜡转移箔衬里浅盘中并转移至设置在-24℃的冷冻箱中以在大约1-2h内快速冷却并固化。
3.3一旦配制的材料被冷冻为完全的固体块或厚片，则将其破碎为较大的块并进行研磨。将块状物(KT操作公司，型号04)在粗磨磨机中粉碎为大约2mm平均直径的颗粒。
3.4然后，将粗磨的材料在粉碎磨机(型号314s,来自公司)中粉碎为小颗粒直至形成150μm平均直径的颗粒。
3.5将粉碎的材料在喷射磨机(Alpine Jet AFG 100流化床喷磨机)中进一步微粒化以实现平均颗粒大小为10um的粒化。
3.6在4℃的冷冻条件下将含有杆状病毒颗粒(EBV)的微粒化材料存储在适宜的样品容器中，直到使用。
生物测定方法
使用两种方法-采用初孵幼虫的液滴法和采用3龄幼虫(L3)的食料給毒法来测试不同EBV制剂的功效。所有的实验都会使用埃及棉叶蛾的幼虫(Spodoptera littoralis)。
液滴法：将EBV制剂添加至含有食物染料和润湿剂(例如，1％Lankem AEP 66)的10％蔗糖溶液中。稀释系列提供了6个EBV浓度以提供不同制剂中的LC50值的可靠比较(即，实现50％死亡率所需的EBV的浓度)。作为阳性和阴性对照，EBV浓度与未配制的SpliNPV病毒和不含任何病毒的溶液(即，蔗糖溶液，只含染料和润湿剂)的LC50剂量进行比较。针对该生物测定，将挨饿的初孵幼虫置于含有EBV溶液的同心圆液滴的Petri盘的中心。30分钟饲养后，去除具有蓝色肠(表明其摄取了溶液)的幼虫并于27℃逐一地置于保温箱内的食料盆中。对幼虫的两天的检测提供了关于死亡(或蛹化)时间的数据及其原因-视觉上很容易地诊断出感染病毒的幼虫的死亡，但是要通过显微镜进行确认。生物测定在每个病毒浓度下每个处理中要使用50个幼虫，采用逻辑回归通过5次重复测定来计算每个EBV的LC50值。
食料給毒法：挨饿的3龄幼虫分别以小立方体(2mm3)的半人工食料加2ml必需的EBV溶液(或对照溶液)来处理并留在保温箱中过夜，然后在第二天早晨，丢弃没有吃完全部食料的幼虫。将剩余的幼虫移至各个食料盆中并再次死亡率/蛹化，每两天检测一次。样品量和分析方法与液滴法相同。
UV对EBV和EBV+制剂的测试效果
在日光模拟器内对试验用EBV和EBV+制剂进行初步测试以量化UV对不同EBV制剂(与非配制的病毒和目前商业化的制剂(例如LittovirTM)相比)的活力的影响。在迈勒森(mylothene)层压板-一种格林尼治大学研发的用以模拟植物叶片暴露的系统上，使EBV暴露为干的病毒悬浮液。然后，将它们暴露于产生可与日光比拟的UV光谱的Hereus CPS实验室日光模拟器中24小时。通过循环温控水在下部冷却测试样品。然后，用标准回收协议(超声处理3min，然后在0.2％十二烷基硫酸钠中冲洗1h)冲洗暴露的病毒以提取用于在LU进行的初孵生物测定的暴露的病毒。鉴定有希望的候选EBV+，在UV老化设备中进行长期(0-30天)评估，从而模拟出针对UV、温度和湿度水平的酷热的和温和的种植条件。采用液滴喷雾器进行所有的处理以模仿田间应用。将最有希望的EBV+的UV稳定性与非配制的病毒和商业上配制的病毒这两者进行比较。将目标物在昼夜周期下暴露于日光中，在0、1、2、4、8、16和32天时收获EBV+样品来回收病毒。然后，在LU对暴露的EBV+进行初孵生物测定以确定生物活性和EBV+半衰期。还可通过SEM确定暴露的EBV+的物理特性。
量化EBV和EBV+制剂对农作物的持久性
确定候选EBV和EBV+对在温室内生长的两个有代表性的农作物物种西红柿和卷心菜的持久性。
成熟的植物(每次处理30个)喷涂
用EBV+溶液的2个比率中的一者(基于商业田间施用率，通过试验研究验证)喷涂，或用单独的EBV+载体(即，水-润湿剂；阴性对照)或非配制的SpliNPV病毒溶液(+润湿剂；阳性对照)或商业SpliNPV生物农药(例如，LittovirTM)喷涂。在喷涂后立即和在之后的1、2、5、10或20天后收获一批植物用于生物测定。将来自喷涂的植物的小盘(1cm直径)叶片喂养挨饿的3龄幼虫，在保温箱(27℃)中过夜。然后，在第二天早晨，将吃了所有叶子的幼虫转移至食料盆中并两天一次检测它们的死亡率/蛹化(每个处理组、每个取样点30个幼虫)。此外，以EBV+选择期间进行的初始评估为基础，比较每个取样点处不同处理中使用的宿主植物的条件以建立UV阻滞剂是否有任何短期或长期的副作用。待量化的性状包括植物高度、植物干重(地面上和地面下)、叶片面积和叶片颜色。
当与常规的含有杆状病毒的制剂相比时，本发明的杆状病毒颗粒的持久性显示为较好。

Claims (31)

1.一种复合颗粒，包含：
i)至少一种杆状病毒颗粒；以及
ii)用于所述i)的杆状病毒的蜡质包封涂层，所述蜡质包封涂层由至少一种可降解于和/或溶解于节肢动物物种的幼虫的肠中的蜡组成。
2.根据权利要求1所述的颗粒，还包括杀虫剂，如拟除虫菊酯和/或有机磷酸酯。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的颗粒，其中，所述杆状病毒颗粒选自甲型杆状病毒颗粒和乙型杆状病毒颗粒。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的颗粒，其中，所述杆状病毒颗粒是杆状病毒包涵体的形式。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的颗粒，其中，所述杆状病毒颗粒选自玉米夜蛾核多角体病毒、棉铃虫核多角体病毒、甜菜夜蛾核多角体病毒、棉贪夜蛾核多角体病毒、莎草黏虫核多角体病毒、黎豆夜蛾核多角体病毒、舞毒夜蛾核多角体病毒、冷杉锯角叶峰核多角体病毒、黄杉合毒蛾核多角体病毒、红头新松叶枫核多角体病毒、粉纹夜蛾核多角体病毒、苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒、斜纹夜蛾细胞核多角体病毒、斜纹夜蛾核多角体病毒、苹果蠹蛾颗粒体病毒、小菜蛾颗粒体病毒、苹果异形小卷蛾颗粒体病毒、马铃薯麦蛾颗粒体病毒、黄小卷叶蛾颗粒体病毒、长卷蛾颗粒体病毒、印度谷螟颗粒体病毒和茶小卷叶蛾颗粒体病毒。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的颗粒，其中，所述杆状病毒颗粒选自玉米夜蛾核多角体病毒、棉铃虫核多角体病毒、甜菜夜蛾核多角体病毒、棉贪夜蛾核多角体病毒、莎草黏虫核多角体病毒、黎豆夜蛾核多角体病毒、苹果蠹蛾颗粒体病毒和印度谷螟颗粒体病毒。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的颗粒，其中，所述杆状病毒颗粒被所述涂层完全包覆。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的颗粒，其中，所述蜡选自可被幼虫消化吸收的蜡。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的颗粒，其中，所述蜡是可降解于和/或溶解于幼虫的肠中的天然蜡。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的颗粒，其中，所述蜡是选自矿物蜡和合成蜡的蜡与至少一种天然蜡的混合物，其中至少所述天然蜡可降解于和/或溶解于幼虫的肠中。
11.根据权利要求1至10中任意一项所述的颗粒，其中，所述天然蜡选自巴西棕榈蜡、米糠蜡和小烛树蜡及其两个或多个的混合物。
12.根据权利要求1至11中任意一项所述的颗粒，其中，所述节肢动物物种是来自鳞翅目的物种，并且所述节肢动物物种的幼虫的肠中的pH值为8-12。
13.一种生产根据权利要求1至12中任意一项所述的颗粒的方法，其步骤如下：
i)熔化根据权利要求8至11中任意一项所限定的蜡；
ii)将根据权利要求1至5中任意一项所限定的杆状病毒颗粒添加至所述i)的熔化的蜡中并混合足够时长使其至少部分包覆所述生物制剂；
iii)将所述ii)的产物快速冷却至固体；以及
iv)将所述iii)的产物粉碎并碾碎至可被幼虫摄取的粒径。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述步骤ii)的混合的时间小于等于5min。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中，所述冷却步骤的时间小于等于12h。
16.根据权利要求13至15中任意一项所述的方法，其中，所述的颗粒的体积平均直径为小于30μm、优选的在8μm至15μm的范围内、最优选的在10μm至15μm范围内。
17.根据权利要求1至12中任意一项所述的颗粒用于对田间农作物植株或在收获的和/或已加工的农作物产品中的幼虫侵害进行控制的用途，优选地用于减少在农作物植株上或在收获的和/或已加工的农作物产品内的活体幼虫的用途。
18.根据权利要求17所述的用于对田间农作物植株的用途，所述农作物植株选自果树如苹果树、梨树和桃树，十字花科蔬菜如卷心菜、花椰菜、芽甘蓝和羽衣甘蓝，谷类如玉米、小麦、黑麦、大麦和高粱，坚果树如扁桃树、山核桃树、榛树、巴西木和腰果树，葡萄藤，烟草，常绿树如道格拉斯冷杉、火炬松和棉花，豆类例如藜豆，茄属物种例如土豆、西红柿、茄子、辣椒、烟草和矮牵牛。
19.根据权利要求17所述的用于收获的和/或已加工的农作物产品的用途，所述农作物产品选自干制品以及源自或由干制品制成的产品，所述干制品包括全谷类如小麦、稻米、大麦和玉米、干豆和扁豆，所述源自或由干制品制成的产品为例如加工食品包括面食、谷物粉、蒸粗麦粉、早餐谷类食品、干制草药、用于如猪、牛、羊和马等家畜的饲料、粗粒小麦粉、面包、坚果(粉状的、薄片状和/或完整的坚果)、零食如包括饼干、薯片、蔬菜片、脆饼干、芝士饼干和干煎饼的甜味开胃食品。
20.一种应用于农作物植株的包含根据权利要求1至12中任意一项所限定的颗粒的组合物。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中，所述组合物为液体形式。
22.根据权利要求24或权利要求25所述的组合物，其中，所述液体为水性液体或油质液体。
23.一种应用于收获的和/或已加工的干制品形式的农作物产品的包含根据权利要求1至12中任意一项所限定的颗粒的组合物。
24.一种包覆有根据权利要求1至12中任意一项所限定的颗粒的农作物植株。
25.一种用于控制节肢动物侵害植物的包含根据权利要求1至12中任意一项所述的复合颗粒的液体制剂，其中，所述液体制剂由以下组成：
i)悬浮在所述液体制剂内的蜡质颗粒，所述蜡质颗粒可降解于和/或溶解于至少一种目标节肢动物物种的幼虫的肠中；以及
ii)至少部分被包封在所述i)的蜡质颗粒内的至少一种杆状病毒颗粒形式的杆状病毒物种，所述杆状病毒物种具有抗所述i)的目标节肢动物物种的幼虫的活性。
26.根据权利要求25所述的液体制剂，其中，所述液体制剂进一步由选自拟除虫菊酯和/或有机磷酸酯的杀虫剂组成。
27.一种能有效地控制存储产品中的节肢动物侵害、包含根据权利要求1至12中任意一项所述的复合颗粒的干粉组合物，其中，所述干粉组合物由以下组成：
i)可降解于和/或溶解于至少一种目标节肢动物物种的幼虫的肠中的蜡质颗粒；以及
ii)至少部分包封在所述i)的蜡质颗粒内的杆状病毒颗粒形式的至少一种杆状病毒物种，所述杆状病毒物种具有抗所述节肢动物幼虫的活性。
28.根据权利要求27所述的干粉组合物，其中，所述干粉组合物进一步由选自拟除虫菊酯和/或有机磷酸酯的杀虫剂组成。
29.一种控制节肢动物侵害、优选地降低节肢动物对谷物或对加工食品的侵害的方法，其中，根据权利要求1至12中任意一项所述的干制复合颗粒通过以下步骤存在于谷物或加工的食品的表面上：
i)将所述的复合颗粒收集于除尘装置中；
ii)将所述的颗粒从所述除尘装置释放到所述谷物或加工食品的表面。
30.一种控制节肢动物侵害、优选地降低节肢动物对谷物或对加工食品的侵害的方法，其中，根据权利要求1至12中任意一项所述的干制复合颗粒与谷物或加工食品混合。
31.一种控制节肢动物侵害、优选地降低选自谷物存储区和干制食物存储区的存储区内的节肢动物侵害的方法，其中，根据权利要求1至12中任意一项所述的干制复合颗粒通过以下步骤存在于所述存储区的表面上：
i)将所述的复合颗粒收集于除尘装置中；
ii)将所述i)的颗粒从所述除尘装置中释放到所述存储区的表面。
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