CN104630075A

CN104630075A - 一株对星天牛幼虫具有高致病力的球孢白僵菌及其应用

Info

Publication number: CN104630075A
Application number: CN201510055116.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡守平; 何学友; 黄金水; 曾丽琼
Original assignee: FUJIAN ACADEMY OF FORESTRY
Current assignee: FUJIAN ACADEMY OF FORESTRY
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2015-05-20

Abstract

本发明公开一株对星天牛幼虫具有高致病力的球孢白僵菌及其应用。本发明所提供的球孢白僵菌菌株命名为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023，已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9851。该菌株生长速度快、产孢能力强，同时对星天牛幼虫的致病力高，以10⁷孢子/mL的孢子悬浮液接种后对星天牛幼虫的LT₅₀（致死中时）为5.38天。利用该菌株生产的真菌制剂，对星天牛的防治效果好，能有效降低星天牛林间虫口密度，是一株在星天牛的防治上具有潜在价值的生防菌株，对减轻星天牛危害具有积极的意义。

Description

一株对星天牛幼虫具有高致病力的球孢白僵菌及其应用

技术领域

本发明属于害虫生物防治领域，涉及一株球孢白僵菌及其应用，具体涉及一株对星天牛幼虫具有高致病力的球孢白僵菌及其应用。

背景技术

星天牛(Anoplophora chinensis Forster)，属鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)，寄主范围广泛，达26科40属超过100种植物，不仅可以危害阔叶树，甚至还可危害日本柳杉Cryptomeria japonica等针叶树，以幼虫蛀食近地的主干或主根，破坏树体养分和水分的运输，以致树势衰弱，重者整株枯死，是重要的林木蛀干害虫；在我国柑橘产区以及林业、绿化树种上，星天牛危害十分严重，给林业生产带来了巨大的损失。同时，星天牛也是东南沿海防护林主要树种——木麻黄（Casuarina spp.）的主要蛀干害虫，在发生严重的林分中虫株率达50%以上，严重影响了沿海防护林的防护效益。

星天牛幼虫蛀入树干木质部中，生活隐蔽，防治困难。传统的化学药剂难以到达危害部位导致防治效果不理想，且大量使用化学农药带来对环境的影响，已经日益受到人们的关注。生物防治是害虫防治的有效方法之一，也是防治害虫的方向。前人利用线虫Steinernema spp.、川硬皮肿腿蜂Scleroderma sichuanensis、白僵菌Beauveria bassiana粘膏防治星天牛幼虫，均取得了一定的效果。

球孢白僵菌Beauveria bassiana (Bals.) Vuill是应用最为广泛的杀虫真菌之一，因其具有致病力强、不污染环境、能有效地在林间宿存和流行等特点，已在多种农林害虫生物防治中取得了明显成效，也被认为是在蛀干害虫生物防治中最为有效的资源之一。

发明内容

本发明的目的是提供一株球孢白僵菌及其应用，具体为一株对星天牛幼虫具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株球孢白僵菌，命名为球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）FJBb201023，已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC No.9851。

该球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023具有以下特征：

在PPDA培养基上25±1℃下生长5天，菌落直径19mm，15天达62mm。菌落白色至乳白色初为疏茸状或棉絮状，后期形成乳粉状的孢子层，孢子层厚且均匀，中心凸起。菌丝分枝，有格，无色光滑，有时成簇生长；产孢细胞（瓶梗）浓密簇生于短而膨大的柄细胞上，瓶形，产孢细胞上部“之”字形，顶端变细长。分生孢子为近球形，单细胞，透明，光滑，1.8-2.8×2-2.7μm。最佳生长温度为23~28℃。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供用于防治星天牛幼虫的菌剂。

本发明所提供的菌剂具体为孢子悬浮液。其中孢子悬浮液的浓度为10⁷孢子/ml。

本发明所提供的菌剂的有效成分是上述球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）FJBb201023的分生孢子。

本发明所提供的或所述菌剂可用于防治星天牛幼虫。

本发明提供的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023具有如下有益效果：

生产形状好，产孢能力强，同时对星天牛幼虫的致病力强，采用浓度为10⁷孢子/ml的孢子悬浮液浸渍法接种LT₅₀为5.6 d，感染率为90.0%。利用该菌株生产的菌剂用于防治，能显著降低星天牛幼虫林间种群数量。同时该菌株能在林间中长期宿存，具有较强的二次侵染能力，适合在星天牛发生林分中应用。

本发明的优点在于：本发明提供了一株对星天牛幼虫具有高致病力的球孢白僵菌菌株及菌剂，为生产上星天牛幼虫防治提供了生物防治资源。同时，白僵菌生物防治具有持效期长、高效、对环境友好等特点，利用白僵菌防治星天牛幼虫，解决了以往星天牛采用化学防治时产生的环境污染、农药残留等问题。本发明具有良好的应用前景。

附图说明

图1 为FJBb201023菌株在PPDA培养基上25±1℃下培养15天的菌落形态图。

图2 为星天牛幼虫被球孢白僵菌（Beauveria bassiana ）FJBb201023感染状。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中的PPDA培养基是指蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基的英文缩写，其具体配方为每1000ml水中含有马铃薯200g（切块煮熟后过滤，取滤液），葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂20g。

实施例1

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023的鉴定

形态学鉴定：

将分离纯化的球孢白僵菌菌株在直径为90mm的平板PPDA培养基上于25±1℃条件下培养，4-5天后挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10-12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特征。该菌株菌落白色至乳白色初为疏茸状或棉絮状，后期形成乳粉状的孢子层，孢子层厚且均匀，中心凸起。菌丝分枝，有格，无色光滑，有时成簇生长；产孢细胞（瓶梗）浓密簇生于短而膨大的柄细胞上，瓶形，产孢细胞上部“之”字形，顶端变细长。分生孢子为近球形，单细胞，透明，光滑，1.8-2.8×2-2.7μm。

菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定：

利用球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023的菌丝体提取总DNA，然后以所提取的DNA为模板，以真菌ITS区通用引物ITS-4和ITS-5（由上海生工生物工程股份有限公司合成）进行PCR扩增，2×Taq PCR MasterMix（含染料） 12.5μL；引物ITS4/ITS5 (10 μmol/L)各1μL；ddH₂O 9.5μL；模板DNA 1μL。PCR反应程序：95℃预变性4min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后72℃延伸7min，用无菌水代替模板作阴性对照。PCR产物经过电泳条带检测后确认样品DNA -ITS区域PCR扩增产物符合测序要求后，将PCR扩增产物进行连接、转化之后，送至铂尚生物技术（上海）有限公司进行序列测定。将测序结果与NCBI基因数据库的白僵菌菌株序列进行比对。

扩增引物序列：

ITS4: 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3' 。

ITS5: 5'-GGAA GTAA AAGT CGTA ACAAGG-3' 。

本发明球孢白僵菌菌株的ITS的序列如SEQ ID NO.3所示，序列长度595bp。通过NCBI/blast比对后发现与球孢白僵菌Beauveria bassiana（AB237657）同源性最高，达99.83%，可以确认该菌株为为球孢白僵菌。

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），登记入册编号为CGMCC No.9851。

实施例2

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023的生物学特性

用点滴法将球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株FJBb201023接种于PPDA平板培养基中央，置于25±1℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个重复，共观察15d。同时记录开始产孢时间，第15d（产孢基本结束）用直径为1.5cm的打孔器，于菌落中心至边缘1/2处打取小菌碟，取出菌碟置于含30 mL的0.3‰吐温-80无菌水的锥形瓶内，振荡使孢子充分分散并适当稀释，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定，取其平均值作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。

表1 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株FJBb201023生物学特性

由表1可见，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株FJBb201023菌落生长较快，5天菌落直径为19mm，15天菌落直径达62mm，生长3天后菌落上开始出现白色孢子，产孢量为1.06×10⁸孢子/cm²。

实施例3

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023对星天牛幼虫的致病力测定

从PPDA平板上刮取一定量球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023孢子置于灭菌的0.3‰ 吐温-80溶液中，配制成10⁷孢子/mL的孢子悬浮液（该悬浮液即为球孢白僵菌FJBb201023菌剂）；将健康的3龄星天牛幼虫在孢悬液中浸渍10s，然后重新放入空养虫管内，接种30头星天牛幼虫，重复3次；以浸渍0.3‰吐温-80无菌水溶液处理作为对照。处理后将养虫盒放置于黑暗的25±1℃恒温培养箱中，每天观察记载星天牛幼虫死亡情况，死虫保湿培养观察菌丝生长及产孢情况（虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子），并挑片在显微镜下观察是否为白僵菌感染致死，统计死亡率及感染率（僵虫率）。

表2 星天牛幼虫接种球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023后累计死亡率

表3 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023对星天牛幼虫幼虫致病力

采用10⁷孢子/mL的孢子悬浮液接种星天牛幼虫10天后，星天牛幼虫死亡率达100%，死亡高峰在4~7天。对照组15天后死亡率为3.3%。死亡的幼虫经保湿培养后发现，感染率为90%。对照组未出现感染。经计算，孢子悬浮液浸渍法接种后，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023菌株对星天牛幼虫的致病力回归方程为y=-0.6922+7.7877x，致死中时（LT₅₀）为3.38天。

实施例4

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023对星天牛幼虫防治效果

1、将直径为6~8cm的木麻黄木段放入养虫笼，然后在养虫笼中放入5对星天牛成虫，并用水培木麻黄小枝条供星天牛成虫取食。让星天牛成虫在木麻黄木段上自由产卵，每3天换1批木段。将取出的木段插入水中培养，待星天牛幼虫基本孵化后进行试验。

2、待幼虫孵化约10天后进行喷菌处理，取球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023菌粉，置于0.5%的吐温-80溶液中，然后用双层纱布过滤，稀释至10⁸孢子/ml的浓度，即配制成孢子悬浮液。用压力喷雾器将菌液喷至带虫木段表面，以喷湿木段为准，共处理15根木段。同时取另外9根带虫木段，以喷清水作为对照。

3、木段喷菌液后，每隔5天对5根木段进行剥皮调查，统计星天牛死亡率；同时检查3根对照木段上幼虫的死亡情况。

4、结果见表4，从表中可以看出，白僵菌孢子悬浮液喷木段后，随着时间的推移，木段内星天牛幼虫死亡率逐渐增高，而对照则基本不死亡，喷菌15天后，星天牛幼虫死亡率平均为93.1%，虫尸经保湿后发现，白僵菌感染率为91.6%，对照组的星天牛幼虫死亡率为3.3%，没有出现感染情况。。

表4 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023对星天牛幼虫防治效果

实施例5

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023对星天牛林间防治效果

1、试验在福建省惠安赤湖国有防护林场二中工区进行。

2、处理设置：共设置2个处理， 10⁷孢子/ml白僵菌孢子悬浮液喷树干基部和涂白剂涂干（树干基部涂涂白剂，生产上常用方法，涂白剂配制方法：一般是50公斤水中，加生石灰10至15公斤、食盐1至1.5公斤），同时设置一个对照（喷清水）。处理前，将试验林分随机划1亩的小区若干个，然后以随机排列的方式确定每个小区的处理方法，每个小区的株数均在50株木麻黄以上。每个处理重复三次。在5月上旬和中旬星天牛羽化高峰期进行处理。白僵菌孢子悬浮液于六月上旬补充处理1次。在9月底至10月初，调查每试验小区木麻黄的星天牛发生情况，计算有虫株率，然后统计虫口减退率。

3、结果见表5，不同防治措施处理后，木麻黄受害率均较对照低，其中以白僵菌孢子悬浮液处理的有虫株率最低，平均为10.0%，虫口减退率为74.4%。而涂白剂刷干处理的有虫株率为16.9%，虫口减退率为56.7%。结果表明，使用白僵菌孢子悬浮液处理后，可显著降低林间星天牛幼虫的虫口密度。

表5 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023林间防治星天牛的效果

实施例3、4、5结果表明，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023菌株对星天牛幼虫具有较强的致病力，杀虫效果好，可以有效控制林间星天牛种群数量，减轻星天牛带来的危害，是一株在星天牛的防治上具有潜在意义的生防菌株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要说明的是，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省林业科学研究院

<120> 一株对星天牛幼虫具有高致病力的球孢白僵菌及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 3

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtctccgtt ggtgaaccag cggagggatc attaccgagt 60

tttcaactcc ctaacccttc tgtgaaccta cctatcgttg cttcggcgga cccgccccag 120

cccggacgcg gactggacca gcggcccgcc ggggacctca aactcttgta ttccagcatc 180

ttctgaatac gccgcaaggc aaaacaaatg aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 240

ctctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaatccag 300

tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagc attctggcgg gcatgcctgt 360

tcgagcgtca tttcaaccct cgacctcccc ttggggaggt cggcgttggg gaccggcagc 420

acaccgccgg ccctgaaatg gagtggcggc ccgtccgcgg cgacctctgc gtagtaatac 480

agctcgcacc ggaaccccga cgcggccacg ccgtaaaaca cccaacttct gaacgttgac 540

ctcgaatcag gtaggactac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga ggaaa 595

Claims

1.一株球孢白僵菌，其特征在于：所述菌株为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023，该菌株已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9851。

2.一种杀虫菌剂，其特征在于所述的杀虫菌剂含有权利要求1所述的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）FJBb201023所产生的分生孢子。

3. 按照权利要求2所述的杀虫菌剂，其特征在于其剂型为分生孢子悬浮液。

4. 如权利要求1所述的一株球孢白僵菌在防治星天牛幼虫中的应用。