CN112920956B - 一株球孢白僵菌bd01菌株及其发酵方法和应用 - Google Patents

一株球孢白僵菌bd01菌株及其发酵方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株球孢白僵菌BD01菌株及其发酵方法和应用，涉及害虫生物防治技术领域。本发明所述菌株已进行生物保藏，保藏编号为CGMCCNo.21463。本发明所述球孢白僵菌BD01的杀虫谱广泛，对落叶松八齿小蠹、榆小蠹、松大蚜、美国白蛾、落叶松毛虫、双条杉天牛及光肩星天牛都有较显著的杀伤效果。本发明还提供了一种包含所述球孢白僵菌BD01菌株的孢子粉的制剂，达到国家标准GB/T25864‑2010要求。

Description

一株球孢白僵菌BD01菌株及其发酵方法和应用
技术领域
本发明属于害虫生物防治技术领域，具体涉及一株球孢白僵菌BD01菌株及其发酵方法和应用。
背景技术
华北落叶松隶属松科(Pinaceae Lindl.)，落叶松属(LarixMill.)，是我国华北地区的主要高山树种，分布在海拔1600～2800米，其优点为生长迅速，木质坚韧，对不良气候的抵抗力强。这种木材呈淡褐色或淡黄色，可作为桥梁，建筑，家具以及木材工业原料使用，树干部分可采集树脂，树皮部分可提炼栲胶。同时，因其生长特性可作为高山地区的林分更新和荒山造林树种，在燕山北部山地作为人工造林的主要树种被大量种植，其种植面积占所有人工林总面积的90％，具有珍贵的原料价值，重要的经济价值以及多样的生态价值。
落叶松八齿小蠹通过在树皮下筑道，危害树木韧皮部，导致树势削弱，严重时树木枯死，是华北落叶松的主要害虫之一。其主要危害伐倒木和濒死木，在大爆发时期对健康木和半健康木也造成危害。目前针对落叶松八齿小蠹的防治主要以物理方法和化学方法为主，既费时费力又易对环境产生破坏，开发环境友好型的生物防治药剂迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BD01菌株及其发酵方法和应用，所述菌株经发酵后获得的孢子粉杀虫谱广，可用于绿色防控落叶松八齿小蠹和其他多种害虫。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BD01菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.21463。
优选的，所述BD01菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述BD01菌株的发酵方法，包括以下步骤：(1)将所述BD01菌株的孢子接种到PDB液体培养基上进行液体发酵12～48h，得液体发酵液；所述液体发酵的温度为26℃；
(2)将所述液体发酵液接种到大米固体培养基上，以KNO3为氮源进行26℃恒温发酵10～25d，对发酵产生的菌米进行分离纯化，得孢子粉；
所述大米固体培养基中包括大米和大豆色拉油所述大豆色拉油的质量为大米质量的0.5％。
优选的，步骤(1)所述液体发酵时，孢子接种量为107个/ml，且在进行所述液体发酵时伴随震荡，震荡频率为100～200r/min。
优选的，步骤(1)所述PDB液体培养基的体积为进行液体发酵装置体积的20～44％。
优选的，步骤(2)所述接种的液体发酵液体积为所述大米固体培养基体积的5～25％；
所述KNO3的质量为所述大米固体培养基质量的0.1～0.4％。
本发明还提供了上述BD01菌株或利用上述发酵方法得到的孢子粉在防控林业常见害虫中的应用。
优选的，所述林业常见害虫包括落叶松八齿小蠹(Ips subelongatus)、榆小蠹(Scolytus multistriatus)、松大蚜(Cinara pinitabulaeformis)、美国白蛾(Hyphantriacunea)、落叶松毛虫(Dendrolimus superans)、双条杉天牛(Semunotus bifasliatus)和光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)。
本发明还提供了一种防治林业常见害虫的制剂，其特征在于，所述制剂的有效成分包括利用上述发酵方法得到的孢子粉，且所述孢子粉的质量为所述制剂质量的30％。
优选的，所述制剂的剂型包括可湿性粉剂。
本发明提供了一株球孢白僵菌BD01菌株，所述菌株分离自野外采集的落叶松八齿小蠹僵虫体上，经形态学鉴定和ITS序列分析，确定从落叶松八齿小蠹僵虫体上分离的真菌为球孢白僵菌。本发明实施例中，采用浸渍法与喷雾法测定球孢白僵菌BD01的杀虫谱，首先采用浸渍法测定球孢白僵菌BD01不同浓度的孢子悬浮液对落叶松八齿小蠹的致病性，发现接种7d后不同浓度的孢子悬浮液(浓度为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104个/mL)处理下落叶松八齿小蠹的校正死亡率分别为98.19％、94.28％、85.34％、82.06％、68.08％；接种最高浓度1×107个/mL孢子悬浮液各试虫7d的校正死亡率为：榆小蠹(成虫)89.25％，松大蚜(成虫)69.12％，美国白蛾(幼虫)63.74％，落叶松毛虫(幼虫)57.45％，双条杉天牛(幼虫)73.86％，光肩星天牛(成虫)10.26％。
本发明通过测定孢子粉与不同种类及含量载体、润湿剂、分散剂混合后的产孢量、萌发率、溶解时间和悬浮率，得到球孢白僵菌BD01可湿性粉剂配方为孢子粉30％，剂型达到国家标准GB/T25864-2010要求。
生物保藏信息
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BD01菌株，于2021年01月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21463。
附图说明
图1为BD01菌株的形态特征，其中a表示菌落形态，b表示分生孢子结构，c表示菌丝形态。
具体实施方式
本发明提供了一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BD01菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.21463。
本发明所述BD01菌株在PDA培养基上的菌落形态如图1所示，在生长10d后菌株正面呈乳白色，绒毛状，背面呈浅黄色，菌株产孢结构为“之”字形，分生孢子近似圆球状，根据真菌鉴定手册初步鉴定该菌株为球孢白僵菌；且所述BD01菌株的ITS序列优选如SEQ IDNO.1所示，该菌株与球孢白僵菌具有较高同源性，相似度高达99.62％，结合形态学鉴定结果，最终确定BD01菌株为球孢白僵菌。
本发明所述BD01菌株的菌丝可在PDA、PPDA、SDAY和SMAY四种培养基上生长，菌丝的直径随时间延长而逐渐增大，但白僵菌在不同培养基上的生长情况有所不同。菌丝在PDA培养基上生长情况较好，在10d时菌丝长度与PPDA培养基、SDAY培养基和SMAY培养基相比差异显著，在SMAY培养基上生长情况最差；所述白僵菌BD01菌株的菌丝在15～30℃范围内均可生长，在20～25℃区间内，白僵菌菌丝的生长量随温度的升高而增加，最佳的生长温度为25℃，10d时的菌丝直径与其他温度相比差异显著，35℃时未见白僵菌菌丝生长；所述白僵菌BD01菌株的菌丝在光照、黑暗、光暗交替条件下均可生长，但不同光照条件对菌丝的生长有所影响，菌丝在黑暗条件下生长最好，10d时的菌丝直径与光照及光暗交替下的菌丝直径存在显著性差异，黑暗条件能够促进白僵菌菌丝的生长；所述白僵菌BD01菌株的菌丝在pH为5～9范围内均可生长，适应范围较广，pH值为7时生长最好，10d时pH为7条件下的菌丝直径与其他pH值条件下的菌丝直径存在显著性差异，中性条件最适宜球孢白僵菌BD01菌丝生长。
本发明所述白僵菌BD01菌株的孢子在15～30℃均可萌发，在15～25℃区间内，白僵菌孢子的萌发率随温度的升高而增长，其中最佳的萌发温度为25℃，在20h时孢子的萌发率为97.45％，与其他温度条件下孢子萌发率存在显著性差异，在35℃时未见白僵菌孢子萌发；在相对湿度65～100％范围内均可萌发，且萌发率随相对湿度的升高而增长，相对湿度为100％时萌发率达到最高，20h时的萌发率为98.58％，是65％相对湿度下20h时萌发率的8.5倍，与其他相对湿度下的孢子萌发率存在显著差异；光照、黑暗、光暗交替均可使所述白僵菌孢子进行萌发，且孢子萌发率随时间的延长而上升，黑暗条件下的孢子萌发率最高，20h的萌发率与光照条件、光暗交替条件下的萌发率存在显著性差异，所以黑暗条件最适宜球孢白僵菌BD01孢子萌发；所述白僵菌孢子在pH为5～9范围内均可萌发，适应范围较广，pH值为7时萌发率最高，20h时萌发率与其他pH值条件下孢子萌发率存在显著性差异，pH为9时，孢子萌发率最差，20h时的孢子萌发率是pH为7时20h萌发率的0.9倍。
本发明还提供了上述BD01菌株的发酵方法，包括以下步骤：(1)将所述BD01菌株的孢子接种到PDB液体培养基上进行液体发酵12～48h，得液体发酵液；所述液体发酵的温度为26℃；
(2)将所述液体发酵液接种到大米固体培养基上，以KNO3为氮源进行26℃恒温发酵10～25d，对发酵产生的菌米进行分离纯化，得孢子粉；
所述大米固体培养基中包括大米和大豆色拉油，所述大豆色拉油的质量为大米质量的0.5％。
本发明将所述BD01菌株的孢子接种到PDB液体培养基上进行液体发酵12～48h，得液体发酵液；所述液体发酵的温度为26℃。本发明在进行所述液体发酵时，孢子接种量优选为107个/ml，且在进行所述液体发酵时伴随震荡，震荡频率优选为100～200r/min，更优选为150r/min。本发明所述PDB液体培养基的体积优选为进行液体发酵装置体积的20～44％，在本发明实施例中，优选在250ml的三角瓶中添加80ml所述PDB液体培养基。本发明对所述PDB液体培养基的来源和制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规市售培养基即可。
得液体发酵液后，本发明优选将所述液体发酵液接种到大米固体培养基上，以KNO3为氮源进行26℃恒温发酵10～25d，对发酵产生的菌米进行分离纯化，得孢子粉；所述大米固体培养基中包括大米和大豆色拉油，所述大豆色拉油的质量为大米质量的0.5％。本发明所述大米固体培养的制备方法，优选包括：将大米与沸水混合浸泡30min，取出大米与大豆色拉油混合，灭菌后得大米固体培养基；
本发明所述KNO3的质量优选为所述大米固体培养基质量的0.1～0.4％，更优选为0.4％，在此浓度下，可使孢子的萌发率保持在90％以上。
本发明所述接种的液体发酵液体积优选为所述大米固体培养基体积的5～25％，更优选为20％，此时的接种量可使孢子萌发率均保持在90％以上。本发明在所述发酵条件下：初始接种量20％，培养天数20d，KNO3浓度0.4％，培养温度26℃，培养湿度85％，得到的孢子粉含孢量为1.33×1011个/g，孢子粉萌发率为97.25％，孢子粉含水率为8.78％。
本发明还提供了上述BD01菌株或利用上述发酵方法得到的孢子粉在防控林业常见害虫中的应用。
本发明所述林业常见害虫优选包括蛀干和/或叶片害虫，更优选包括落叶松八齿小蠹(Ips subelongatus)、榆小蠹(Scolytus multistriatus)、松大蚜(Cinarapinitabulaeformis)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、落叶松毛虫(Dendrolimussuperans)、双条杉天牛(Semunotus bifasliatus)和光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)。
本发明还提供了一种防治林业常见害虫的制剂，其特征在于，所述制剂的有效成分包括利用上述发酵方法得到的孢子粉，且所述孢子粉的质量为所述药剂质量的30％。
本发明所述制剂的剂型优选包括可湿性粉剂，且所述可湿性粉剂中还包括载体、润湿剂和分散剂，且所述载体的质量优选为所述可湿性粉剂质量的60％～68％，更优选为60％。本发明所述载体优选选自膨润土、高岭土、硅藻土、白炭黑和滑石粉中的一种或多种的混合，更优选选自膨润土、高岭土和硅藻土中的一种，最优选为硅藻土。
本发明所述润湿剂的质量优选为所述可湿性粉剂质量的1～5％，更优选为5％。本发明所述润湿剂优选选自拉开粉BX、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠和GY-WS01中的一种或多种的混合，更优选选自拉开粉BX和十二烷基磺酸钠中的一种，最优选为拉开粉BX。
本发明所述分散剂的质量优选为所述可湿性粉剂质量的1～5％，更优选为5％。本发明所述分散剂优选选自木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、扩散剂MF、萘磺酸盐甲醛缩合物和羧丙基纤维素中的一种或多种的混合，更优选选自木质素磺酸钠与扩散剂MF中的一种，最优选为扩散剂MF。
利用上述原料(孢子粉30％，润湿剂拉开粉BX 5％，分散剂扩散剂MF5％，载体硅藻土60％)制备得到的可湿性粉剂，含孢量为410亿个孢子/克，悬浮率70.15％，溶解时间85.23s，干燥减重3.56％，pH为7.26，细度97.6％，剂型达到国家标准GB/T25864-2010要求。
下面结合实施例对本发明提供的一株球孢白僵菌BD01菌株及其发酵方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
球孢白僵菌BD01的分离、鉴定
在超净工作台中，选取被白僵菌感染的落叶松八齿小蠹僵虫体，每个虫体用单面刀片分割成两段，75％酒精浸泡30s消毒，之后放入培养皿中用无菌水冲洗三遍，冲洗完毕后用滤纸将虫体表面水分吸干。将消毒完毕的僵虫体块接种到PDA平板上，每个平板接种两块。平板放入25℃恒温培养箱中进行培养，4～5d后，待其长出菌丝，挑取边缘菌丝接种到新的PDA平板上，重复此过程3次，得到纯的菌株。逐日观察菌落形态，待其产孢后用显微镜(型号：奥林巴斯SZX-16)观察孢子形态大小，根据真菌鉴定手册进行鉴定。提取分离纯化后的菌株基因组DNA进行ITS序列分析，按照大连TaKaRa公司提供的试剂盒说明书进行操作。
ITS序列分析时，选用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增。引物序列为：ITS1(SEQ IDNO.2，5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′)、ITS4(SEQ ID NO.3，5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′)，PCR扩增反应体系为：1.0μL基因组DNA(20ng/μL)，5.0μL 10×Buffer(含2.5mM Mg2+)，1.0μLTaq聚合酶(5μ/μL)，1.0μL dNTP(10mM)，1.5μL ITS1引物(10μM)，1.5μL ITS4引物(10μM)，39.0μL双蒸水。扩增反应程序为：95℃预变性，5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延7min。反应完成后，取3μLPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片段，并交由上海派森诺生物科技有限公司完成测序工作。
菌株在PDA培养基上的菌落形态如图1所示，在生长10d后菌株正面呈乳白色，绒毛状，背面呈浅黄色。菌株产孢结构为“之”字形，分生孢子近似圆球状，根据真菌鉴定手册初步鉴定该菌株为球孢白僵菌；用NCBI Blast程序将拼接后的序列与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，发现该菌株与球孢白僵菌具有较高同源性，相似度高达99.62％，结合形态学鉴定结果，最终确定BD01菌株为球孢白僵菌。
实施例2
球孢白僵菌BD01对落叶松八齿小蠹的致病性
采用浸渍法对落叶松八齿小蠹成虫进行致病性测定。用含有0.05％吐温-80的无菌水冲洗培养15d的球孢白僵菌平板，在显微镜下利用血球计数板计算孢子悬浮液浓度，用含有0.05％吐温-80的无菌水进行稀释，制备成浓度分别为1×104个/mL、1×105个/mL、1×106个/mL、1×107个/mL、1×108个/mL的孢子悬浮液。挑选健康活跃的落叶松八齿小蠹成虫进行分组，每组35头试虫，接种不同浓度的孢子悬浮液，每个浓度梯度设置3组重复，并以无菌水作为对照组(CK)。将试虫放入盛有40mL孢悬液的培养皿中，轻轻摇晃培养皿，使试虫与孢悬液充分接触30s后，用针管将孢悬液吸出，试虫放在圆形滤纸上30s吸收水分后，放入盛有小块落叶松树皮的培养皿中，并在皿底铺垫圆形滤纸。将接种后的试虫在25℃下培养，每天向皿盖内喷洒无菌水保持皿内湿度，每隔24h观察虫体变化，记录死亡率。将死亡虫体保湿培养，有白僵菌菌丝长出则记为有效致死，记录死亡率，直至试虫全部死亡。
运用SPSS软件中Probit模型对试虫的死亡率进行分析，计算致死中浓度(LC50)与致死中时(LT50)。
Figure BDA0003044536110000081
Figure BDA0003044536110000082
结果如表1至表3所示，不同浓度的白僵菌孢子悬浮液均可对落叶松八齿小蠹成虫产生一定的致病性，但在不同浓度、不同时间下致病性有所不同。在同一浓度下，随着时间的延长，致病性逐渐增强。在1×108个/mL浓度下时，第2d的校正死亡率为17.14％，第6d的校正死亡率为94.53％。同一时间下，随着浓度的增加，致病性逐渐增强。第5d时1×104个/mL浓度下，校正死亡率为31.43％；1×108个/mL浓度下，校正死亡率为82.86％。1×104～1×108浓度下致死中时LT50分别6.92d、5.80d、5.66d、4.57d和3.72d，随着孢悬液浓度的增加，致死中时(LT50)逐渐缩短。第3～7d的致死中浓度LC50分别是4.50×108个/mL、3.71×107个/mL、1.21×106个/mL、4.86×104个/mL和2.51×103个/mL，说明随着接种后时间推移，致死中浓度(LC50)逐渐减小。可知球孢白僵菌BD01菌株对落叶松八齿小蠹具有较强致病性。
表1 BD01菌株对落叶松八齿小蠹的致病性(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000091
注：表中同一列中不同字母表示经Duncan氏新复极差法测验在0.05水平上差异显著。(下同)
表2 BD01菌株对落叶松八齿小蠹的致死中时
Figure BDA0003044536110000092
表3 BD01菌株对落叶松八齿小蠹的致死中浓度
Figure BDA0003044536110000093
Figure BDA0003044536110000101
实施例3
球孢白僵菌BD01的杀虫谱测定
选择榆小蠹、松大蚜、美国白蛾、落叶松毛虫、双条杉天牛、光肩星天牛进行杀虫谱测定，其中落叶松毛虫为3龄幼虫，双条杉天牛为体长1.3～1.5cm幼虫，美国白蛾为5龄幼虫，榆小蠹、松大蚜、光肩星天牛均为成虫。
配制1×105个/mL、1×106个/mL、1×107个/mL、1×108个/mL浓度的孢子悬浮液，对供试昆虫进行分组，每组30头，每个浓度梯度设置3组重复，以含0.05％吐温-80的无菌水处理作为对照组(CK)。由于部分种类试虫数量有限，所以只接种三个浓度梯度的孢子悬浮液。榆小蠹、双条杉天牛、光肩星天牛采用浸渍法接种孢子悬浮液，按照上述处理落叶松八齿小蠹成虫的方法进行操作。松大蚜、美国白蛾、落叶松毛虫采用喷雾法接种孢子悬浮液，将试虫放入铺有圆形滤纸的培养皿中，用同一规格的喷壶分别将不同浓度的孢悬液喷洒到试虫虫体，每次固定喷洒高度与次数，待孢悬液均匀沉降3min后盖上皿盖。培养温湿度、记录方法等与实施例2相同。
1、如表4所示，不同浓度的白僵菌孢子悬浮液对榆小蠹具有一定的致病性，但在不同浓度、不同时间下致病性有所不同。同一浓度下，随着时间的延长，榆小蠹的校正死亡率逐渐升高，最后趋于稳定。在1×107个/mL浓度下时，第2d的校正死亡率为6.78％，第7d的校正死亡率为89.25％。在第5d时，1×104个/mL浓度下校正死亡率为30.21％；1×107个/mL浓度下校正死亡率为59.59％。
表4球孢白僵菌BD01对榆小蠹(成虫)的致病性
Figure BDA0003044536110000102
Figure BDA0003044536110000111
2、如表5所示，当孢悬液浓度一定时，松大蚜的校正死亡率随时间的延长而增加。如白僵菌孢子悬浮液的浓度为1×107个/mL时，松大蚜第2d的校正死亡率为5.79％，第7d的校正死亡率为69.12％。当天数一定时，松大蚜的校正死亡率随孢悬液浓度的升高而增加。在第5d时，1×104个/mL浓度下校正死亡率为19.61％；1×107个/mL浓度下校正死亡率为59.24％。
表5球孢白僵菌BD01对松大蚜(成虫)的致病性
Figure BDA0003044536110000112
3、如表6所示，不同浓度白僵菌孢子悬浮液对美国白蛾具有一定的致病性，但在不同浓度、不同时间下致病性有所不同。在1×107个/mL浓度下时，第2d的校正死亡率为7.07％，第7d的校正死亡率为63.74％。在第5d时，1×105个/mL浓度下校正死亡率为22.37％；1×107个/mL浓度下校正死亡率为51.28％。
表6 BD01菌株对美国白蛾的致病性(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000113
4、如表7所示，不同浓度白僵菌孢子悬浮液对落叶松毛虫具有一定的致病性，但在不同浓度、不同时间下致病性有所不同。同一浓度下，随着时间的延长，落叶松毛虫的校正死亡率逐渐升高，最后趋于稳定。在1×107个/mL浓度下时，第2d的校正死亡率为2.27％，第7d的校正死亡率为57.45％。在第5d时，1×105个/mL浓度下校正死亡率为20.13％；1×107个/mL浓度下校正死亡率为41.07％。
表7球孢白僵菌BD01对落叶松毛虫(3龄幼虫)的致病性
Figure BDA0003044536110000121
5、如表8所示，当孢子悬浮液浓度一定时，双条杉天牛的校正死亡率随时间的延长而增加。如白僵菌孢子悬浮液浓度为1×107个/mL时，双条杉天牛第2d的校正死亡率为0.00％，第7d的校正死亡率为73.86％。同一天数下，双条杉天牛的校正死亡率随孢悬液浓度升高而增加。在第5d时，1×105个/mL浓度下校正死亡率为29.87％；1×107个/mL浓度下校正死亡率为55.67％。
表8球孢白僵菌BD01对双条杉天牛(1.3～1.5cm幼虫)的致病性
Figure BDA0003044536110000122
6、如表9所示，BD01菌株对光肩星天牛具有一定致病性，但致病性较弱。当孢悬液浓度一定时，光肩星天牛的校正死亡率随时间的延长而增长。如白僵菌孢子悬浮液浓度为1×107个/mL时，光肩星天牛第2d的校正死亡率为0.00％，第7d的校正死亡率为10.26％。在特定天数范围内，光肩星天牛的校正死亡率不随孢悬液浓度变化而发生改变。在2～5d时，1×105个/mL浓度下校正死亡率为0.00％；1×107个/mL浓度下校正死亡率为0.00％。
表9球孢白僵菌BD01对光肩星天牛(成虫)的致病性
Figure BDA0003044536110000131
实施例4
球孢白僵菌BD01发酵条件优化
1、液态发酵条件
(1)主要作用因子的筛选
采用单因素分析法探究不同pH值、培养温度、摇床转速、初始接种浓度、培养基装样量对BD01菌株营养生长的影响，以培养48h后的菌丝发酵水平为判断标准。
①不同pH值对菌丝发酵水平的影响：将50mLPDB液体培养基加入250mL三角烧瓶中，接入白僵菌孢子悬浮液使浓度达到1×107个/mL，通过1mol/L的HCl与NaOH溶液将PDB培养基的pH值调至5、6、7、8，将其置于26℃，150r/min的恒温摇床进行培养，每个处理重复三次，48h后测定菌丝发酵水平。
②不同培养温度对菌丝发酵水平的影响：测定24℃、26℃、28℃、30℃培养温度对菌丝发酵水平的影响，接种和测定方法同上。
③不同摇床转速对菌丝发酵水平的影响：测定100r/min、150r/min、200r/min摇床转速对菌丝发酵水平的影响，接种和测定方法同上。
④不同初始接种浓度对菌丝发酵水平的影响：测定1×105个/mL、1×106个/mL、1×107个/mL、1×108个/mL初始接种浓度对菌丝发酵水平的影响，接种和测定方法同上。
⑤不同培养基装样量对菌丝发酵水平的影响：测定20mL、50mL、80mL、110mLPDB液体培养基对菌丝发酵水平的影响，接种和测定方法同上。
菌丝发酵水平的测定标准：取培养48h后的菌液2mL加入离心管，12000r/min离心5min，取出后弃掉上清液，菌丝体倒在已经烘干恒重的滤纸上，滤纸质量为M1，将带有菌丝体的滤纸80℃烘干至恒重，利用电子天平进行称量，得到质量为M2。按照以下公式计算菌丝发酵水平。
菌丝发酵水平(g/L)＝(M2-M1)×500，式III。
通过单因素分析法对以上因子进行筛选，其中起主要作用的因子分别为摇床转速、初始接种浓度、培养基装样量。设计3因素3水平的L9(34)正交实验，每组实验重复3次，以培养48h后的菌丝发酵水平为判断标准，确定液态发酵的最佳培养条件，实验因子与水平如表10所示。
表10 L9(34)正交实验因素及水平
Figure BDA0003044536110000141
采用单因素分析法对球孢白僵菌BD01液态发酵的培养温度、摇床转速、初始接种浓度、液体装样量、pH值进行分析，试验结果如表11至表15所示，通过对不同培养条件48h时的菌丝发酵水平进行显著性差异分析，其中摇床转速(F＝19.875，P＜0.01)、初始接种浓度(F＝21.432，P＜0.01)、液体装样量(F＝49.687，P＜0.01)对菌株的液态生长具有显著性差异，而pH值(F＝3.197，P＞0.05)对菌株的液态生长没有显著性差异，故在进行菌株液态发酵试验中，选取中性pH(7)进行培养，培养温度选择常规温度26℃。
表11不同培养温度对BD01菌株液态生长的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000151
表12不同摇床转速对BD01菌株液态生长的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000152
表13初始接种浓度对BD01菌株液态生长的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000153
表14不同液体装样量对BD01菌株液态生长的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000154
Figure BDA0003044536110000161
表15不同pH值对BD01菌株液态生长的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000162
(2)液态发酵最佳培养条件测定
运用正交设计表L9(34)对白僵菌液态发酵条件进行优化，所得结果如表16所示，不同培养方式对菌株液态生长量具有显著性差异。某个因素的极差越大表明其对液态发酵菌丝发酵水平大小的影响越大。由表16可知，对白僵菌液态发酵菌丝发酵水平的影响从大到小依次为C、B、A，即初始接种浓度对菌丝生长量影响最大，摇床转速次之，液体装样量影响最小。根据表17主效应分析可得，C因素具有显著性，对菌丝生长量的影响最大，与所得极差结果相吻合。其中，A因素的3水平对应值分别为10.34、9.82、9.49，B因素的3水平对应值分别为9.22、10.40、10.03，C因素3水平分别为11.64、10.99、7.02，最佳方案为A1B2C1，但最佳方案并未在9次正交实验中出现，以A1B2C1为优化发酵条件进行试验，设置3次重复，得到菌丝发酵水平为13.74g/L，高于9次正交实验的结果。确定液态发酵的最佳条件为初始接种浓度107个/mL，摇床转速150r/min，液体装样量80mL。
表16 L9(34)正交实验中不同组合的菌丝发酵水平
Figure BDA0003044536110000163
Figure BDA0003044536110000171
表17 L9(34)正交实验主效应分析结果
Figure BDA0003044536110000172
2、固态发酵最佳条件
(1)不同条件对菌株固态发酵结果的影响
采用控制变量法探究不同KNO3浓度、培养天数、初始接种浓度对BD01菌株固态发酵结果的影响，以培养得到的菌米产孢量与孢子萌发率为判断标准。
大米固体培养基的制备：用电子天平称取大米100g，放入500mL烧杯中，倒入沸水没过大米，浸泡30min，期间不停用玻璃棒进行搅拌，确保大米与沸水充分接触，之后将沸水倒出，大米均匀平铺在报纸上晾干，加入0.5％大豆色拉油搅拌均匀，置于灭菌袋中121℃灭菌20min，冷却后备用。进行试验时，在超净工作台内将灭菌冷却后的大米固体培养基均匀打散在
Figure BDA0003044536110000183
的无菌培养皿中。
萌发率的测定方法：萌发率测定方法如下式所示
Figure BDA0003044536110000181
产孢量的测定方法：电子天平称取1g菌米，加入50mL含有0.05％吐温-80的无菌水中，搅拌均匀，使菌米上的分生孢子均匀溶于无菌水中，在显微镜下利用血球计数板进行镜检，换算成每克菌米含有的孢子数量(个/g)。
①不同KNO3浓度对固态发酵结果的影响：在
Figure BDA0003044536110000184
的无菌培养皿中加入100g大米固体培养基，接种20％液态优化发酵液，分别加入0.1％、0.4％、0.7％、1.0％、1.3％的KNO3作为氮源，搅拌均匀后密封，放入26℃恒温培养箱中培养20d，测定产孢量、萌发率，每个处理重复三次。
如表18所示，在培养天数、接种量不变的条件下，不同浓度的KNO3对白僵菌固态发酵的产孢量具有一定影响，使孢子的萌发率均能保持在90％以上。在一定的KNO3浓度范围内，产孢量随KNO3浓度的升高而增加，当KNO3浓度达到0.4％时，产孢量达到最大，且与其他浓度下的产孢量存在显著性差异。而随着浓度的继续升高，产孢量则呈现下降的趋势。
表18不同KNO3浓度对BD01菌株产孢量的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000182
②不同培养天数对固态发酵结果的影响：按照上述方法接种发酵液，加入1.0％的KNO3作为氮源，分别培养10、15、20、25、30d，测定产孢量与萌发率。
如表19所示，在KNO3浓度、接种量不变的条件下，不同的培养天数对白僵菌固态发酵的产孢量具有一定影响，在一定的培养天数范围内，产孢量随培养天数的延长而增加，当培养天数为20d时，产孢量达到最大，且与其他培养天数下的产孢量存在显著性差异。而随着培养天数的继续延长，产孢量呈现下降的趋势，在25d之前，孢子萌发率均保持在90％以上，当培养天数达到30d时，孢子萌发率低于90％。
表19不同培养天数对BD01菌株产孢量的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000191
③不同初始接种浓度对固态发酵结果的影响：按照上述方法分别接种5％、10％、15％、20％、25％液态优化发酵液，加入1.0％的KNO3作为氮源，测定产孢量与萌发率。
如表20所示，在KNO3浓度、培养天数不变的条件下，不同的初始接种量对白僵菌固态发酵的产孢量具有一定影响，使孢子萌发率均保持在90％以上。当初始接种量达到20％时，产孢量达到最大，且与其他初始接种量下的产孢量存在显著性差异。而当初始接种量超过20％时，产孢量呈现下降的趋势。
表20不同初始接种量对BD01菌株产孢量的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000192
(2)培养优化前后菌株产孢特性对比
在固态发酵试验得到的最佳培养条件下对液态优化发酵液进行培养，以固态发酵优化前的基础培养条件(初始接种量15％，培养天数20d，KNO3浓度0.7％，培养温度26℃，培养湿度85％)作为对照进行培养，每组试验重复3次，培养结束后，将两组试验得到的孢子粉进行含孢量、萌发率以及含水率的测定并进行对比。
含孢量的测定方法：利用真菌孢子分离器对固态优化发酵所得的菌米进行分离得到纯净孢子粉，准确称取50mg孢子粉加入500mL含有0.05％吐温-80的无菌水中，搅拌均匀后显微镜下利用血球计数板测定孢子悬浮液浓度，换算成每克孢子粉含有的孢子数量(个/g)。
含水率的测定方法：利用真菌孢子分离器对固态优化发酵所得的菌米进行分离得到纯净孢子粉，用电子天平称取1g孢子粉于滤纸上，得到质量W1，将滤纸与孢子粉放入烘箱中烘干至恒重，得到质量W2，按照以下公式计算样品含水率。
Figure BDA0003044536110000201
如表21所示，在基础培养条件(初始接种量15％，培养天数20d，KNO3浓度0.7％，培养温度26℃，培养湿度85％)下发酵得到的孢子粉含孢量为0.76×1011个/g，优化培养条件(初始接种量20％，培养天数20d，KNO3浓度0.4％，培养温度26℃，培养湿度85％)下得到的孢子粉含孢量为1.33×1011个/g，二者具有显著性差异。萌发率方面，基础培养条件得到的孢子粉萌发率为94.28％，优化培养条件得到的孢子粉萌发率为97.25％，二者具有显著性差异。含水率方面，基础培养条件得到的孢子粉含水率为9.86％，优化培养条件得到的孢子粉含水率为8.78％，二者具有显著性差异。即优化培养条件下，产孢量和萌发率均高于基础培养条件，含水率则低于基础培养条件。
表21培养优化前后菌株特性对比(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000202
实施例5
球孢白僵菌BD01可湿性粉剂
1、载体的筛选
选择膨润土、高岭土、硅藻土、白炭黑、滑石粉作为载体，测定不同载体对白僵菌BD01菌株萌发率与产孢量的影响。
(1)萌发率的测定：将载体膨润土、高岭土、硅藻土、白炭黑、滑石粉分别与孢子粉1:1均匀混合，放置7d后，电子天平称取1g混合物加入100mL含0.05％吐温-80的无菌水中制成孢子悬浮液，同时加入2g葡萄糖与1g蛋白胨，置于26℃，150r/min的恒温摇床培养24h后测定孢子萌发率，每个处理重复3次，以不加载体的样品作为对照。
(2)产孢量的测定：将载体膨润土、高岭土、硅藻土、白炭黑、滑石粉分别加入PDA培养基中，浓度为0.05g/mL，灭菌后倒入培养皿，接种BD01菌株后置于25℃恒温培养箱中黑暗培养7d，用打孔器在菌落中心至边缘二分之一处取直径6mm的菌饼，加入50mL含0.05％吐温-80的无菌水中制成孢子悬浮液，震荡均匀后在显微镜下利用血球计数板计算产孢量，每个处理重复3次，以不加载体的样品作为对照。
结果如表22所示，培养基中加入硅藻土的白僵菌菌株产孢量最高，与其他处理组存在显著性差异。而培养基中加入白炭黑的处理组产孢量最低，仅为加入硅藻土处理组的0.3倍。在相容性测定方面，五个处理组的孢子萌发率均保持在90％以上，白炭黑与滑石粉处理组的萌发率低于其他处理组。综合各载体对白僵菌产孢量与萌发率的影响，选择硅藻土作为载体。
表22不同载体对产孢量及萌发率影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000211
Figure BDA0003044536110000221
2、润湿剂的筛选
选择拉开粉BX(丁基萘磺酸钠)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基磺酸钠、GY-WS01作为润湿剂，测定溶解时间及其与白僵菌孢子的相容性。
(1)润湿力的测定：将润湿剂拉开粉BX(丁基萘磺酸钠)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基磺酸钠、GY-WS01分别以1％、3％、5％的比例与30％的白僵菌孢子粉混合，剩余部分用载体补足。取250mL烧杯加入100mL标准硬水，将烧杯放入25℃恒温水浴锅中，使烧杯液面与水浴锅液面持平，待温度稳定后，电子天平称取5g样品加入烧杯中，同时用秒表进行计时，记录样品完全溶解所用时间，每个处理重复三次，取平均值作为溶解时间，以不加润湿剂的样品作为对照。
(2)润湿剂与孢子相容性的测定：取1g上述样品，加入100mL含有2％葡萄糖、1％蛋白胨的营养液中，制成孢子悬浮液，置于26℃，150r/min的恒温摇床培养16h后测定孢子萌发率，每个处理重复三次，以不加润湿剂的样品作为对照。
结果如表23所示，加入润湿剂可显著缩短样品的溶解时间。其中加入5％拉开粉BX以及十二烷基磺酸钠的样品溶解时间均在100s以内，与其他处理组存在显著性差异。在相容性测定方面，加入拉开粉BX的孢子粉萌发率均达到90％以上，具有较好萌发效果且与其他处理组存在显著性差异，可知其对孢子的萌发具有促进作用。综合各润湿剂的溶解时间以及对孢子粉的萌发率影响可知，含量为5％的拉开粉BX对缩短样品溶解时间及促进孢子萌发具有较好效果。
表23润湿剂对溶解时间和萌发率的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000222
Figure BDA0003044536110000231
3、分散剂的筛选
选择木质素磺酸钙(CL)、木质素磺酸钠(SL)、扩散剂MF、萘磺酸盐甲醛缩合物(NNO)、羧丙基纤维素(CMHPC)作为分散剂，测定悬浮率及其与白僵菌孢子的相容性。
(1)悬浮率的测定：将分散剂木质素磺酸钙(CL)、木质素磺酸钠(SL)、扩散剂MF、萘磺酸盐甲醛缩合物(NNO)、羧丙基纤维素(CMHPC)分别以1％、3％、5％的比例与30％的白僵菌孢子粉和5％的润湿剂混合，剩余部分用载体补足。取适量样品加入盛有250mL标准硬水的量筒中，轻轻震荡使样品分散，将量筒瓶口处用塞子塞紧，以量筒底部为轴，1min内上下颠倒30次，打开塞子将量筒静置30min后，迅速将量筒内溶液的9/10吸出(225mL)，操作过程中不要晃动量筒或搅动量筒内沉积物，保证移液设备总是处在液面几毫米以下。将量筒内的剩余液体倒入100mL已经干燥称重的烧杯中，将盛有液体的烧杯放入烘箱中烘干至恒重，取出后待其冷却到室温时进行称重，每个处理重复三次，以不加分散剂的样品作为对照，按照以下公式计算悬浮率。
Figure BDA0003044536110000232
其中C1为称样质量，C2为25mL溶液中剩余物的质量，10/9为换算系数。
如表24所示，不加入分散剂时对照组的悬浮率仅为43.67％。在分散剂含量为1％～5％之间时，样品的悬浮率与分散剂的含量成正比。在分散剂含量为5％时，加入扩散剂MF的样品悬浮率最高，与其他处理组存在显著性差异。在相容性测定方面，各组样品的孢子萌发率均保持在90％以上，其中木质素磺酸钠与扩散剂MF处理组孢子萌发率高于其他处理组。综合各样品的悬浮率以及孢子萌发率可知，含量为5％的扩散剂MF对样品悬浮率的增加以及孢子的萌发具有较好效果。
表24分散剂对悬浮率和萌发率的影响(平均值±标准误)
Figure BDA0003044536110000241
4、可湿性粉剂质量检测
对白僵菌BD01菌株可湿性粉剂(孢子粉30％，润湿剂拉开粉BX 5％，分散剂扩散剂MF 5％，载体硅藻土60％)的悬浮率、溶解时间、干燥减重、pH值、细度进行质量检测。
干燥减重的测定：称取10g样品，放入干燥称重后的培养皿中，将培养皿放入烘箱中烘干至恒重，质量相减，得到样品质量减少的百分比，重复三次，计算平均值。
pH值的测定：称取1g样品放入100mL烧杯中，加入适量无菌水搅拌均匀，静置1min，用pH计测定样品pH值，重复三次，计算平均值。
可湿性粉剂细度的测定：称取适量样品加入250mL烧杯中，倒入80mL自来水，充分搅拌使其完全溶解后，加入自来水将试液稀释至150mL。将试液全部倒入润湿的标准筛中，用自来水洗涤烧杯，洗涤液也倒入标准筛中，直至烧杯中的较大颗粒完全移至标准筛中。将9～10mm左右的橡皮管接在水龙头上，以每分钟4～5L的水流速度冲洗标准筛，橡皮管末端与标准筛边缘持平，冲洗过程中保持水流与筛上颗粒充分接触，均匀洗涤，直到通过标准筛的自来水清澈透亮为止。将标准筛放入盛有清水的盆中进行清洗，上下移动标准筛使其边缘始终处在水面之上，重复洗涤2min直到没有颗粒过筛为止。将标准筛中的残余颗粒进行收集，用水冲入干燥称重后的100mL烧杯中，待杯中颗粒都沉降至底部后，倒出大部分自来水，将烧杯放入烘箱中烘干至恒重。将烧杯取出后使其冷却到室温进行称重，每个处理重复三次，按照以下公式计算可湿性粉剂细度。
Figure BDA0003044536110000251
其中A1为称样质量，A2为烧杯中剩余物的质量。
结果如表25所示，白僵菌BD01菌株外观为浅灰色粉末，含孢量为410亿个孢子/克，剂型各项检测结果均达到国家标准GB/T25864-2010要求。
表25可湿性粉剂质量检测结果
Figure BDA0003044536110000252
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 一株球孢白僵菌BD01菌株及其发酵方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 530
<212> DNA
<213> Beauveria bassiana
<400> 1
tctacctgat tcgaggtcac gttcagaagt tgggtgtttt acggcgtggc cgcgtcgggg 60
tcccggtgcg agctgtatta ctgcgcagag gtcgccgcgg acgggccgcc actccatttc 120
agggccggcg gtgtgctgcc ggtccccaac gccgacctcc ccaaggggag gtcgagggtt 180
gaaatgacgc tcgaacaggc atgcccgcca gaatgctggc gggcgcaatg tgcgttcaaa 240
gattcgatga ttcactggat tctgcaattc acattactta tcgcgtttcg ctgcgttctt 300
catcgatgcc agagccaaga gatccgttgt tgaaagtttt gattcatttg ttttgccttg 360
cggcgtattc agaagatgct ggaatacaag agtttgaggt ccccggcggg ccgctggtcc 420
agtccgcgtc cgggctgggg cgagtccgcc gaagcaacga taggtaggtt cacagaaggg 480
ttagggagtt gaaaactcgg taatgatccc tccgcaggtt accctacgga 530
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (9)

1.一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BD01菌株，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.21463。
2.根据权利要求1所述BD01菌株，其特征在于，所述BD01菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述BD01菌株的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将所述BD01菌株的孢子接种到PDB液体培养基上进行液体发酵12～48h，得液体发酵液；所述液体发酵的温度为26℃；
(2)将所述液体发酵液接种到大米固体培养基上，以KNO3为氮源进行26℃恒温发酵10～25d，对发酵产生的菌米进行分离纯化，得孢子粉；
所述大米固体培养基中包括大米和大豆色拉油，所述大豆色拉油的质量为大米质量的0.5％。
4.根据权利要求3所述发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述液体发酵时，孢子接种量为107个/ml，且在进行所述液体发酵时伴随震荡，震荡频率为100～200r/min。
5.根据权利要求3所述发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述PDB液体培养基的体积为进行液体发酵装置体积的20～44％。
6.根据权利要求3所述发酵方法，其特征在于，步骤(2)所述接种的液体发酵液体积为所述大米固体培养基体积的5～25％；
所述KNO3的质量为所述大米固体培养基质量的0.1～0.4％。
7.权利要求1或2所述BD01菌株或利用权利要求3～6任一项所述发酵方法得到的孢子粉在防治常见林木害虫中的应用；
所述常见林木害虫包括落叶松八齿小蠹(Ips subelongatus)、榆小蠹(Scolytusmultistriatus)、松大蚜(Cinarapinitabulaeformis)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、落叶松毛虫(Dendrolimus superans)、双条杉天牛(Semunotus bifasliatus)和光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)。
8.一种防治林木常见害虫的制剂，其特征在于，所述制剂的有效成分包括利用权利要求3～6任一项所述发酵方法得到的孢子粉，且所述孢子粉的质量为所述制剂质量的30％。
9.根据权利要求8所述制剂，其特征在于，所述制剂的剂型包括可湿性粉剂。
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