CN101473808A - 一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物根结线虫人工培养繁殖和种类保存的方法。实验室根结线虫的繁殖与保存一直依赖于寄主植物，本发明将根结线虫卵粒或二龄幼虫以较少数量接入特定的二重培养基而不是寄主根系，恒温密闭状态下倒置培养，根结线虫在培养基内取食、生长和繁殖，短期内即可获得大量线形虫体；另将培养平板适时转入冷凉条件下存放，半年内换皿传代培养一次，让根结线虫的繁殖与保存过程脱离寄主植物。本发明的优点在于：省去了根结线虫寄主植株的培育程序，同时又不丧失培养线虫对敏感寄主植物的侵染能力；所用材料成本低廉，实验方法易于操作；本发明为根结线虫的种类保存，特别为根结线虫相关研究中所需的大量虫体，提供了一种简便、快捷的繁殖方法。

Description

一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法

技术领域

本发明涉及一种植物根结线虫人工培养繁殖和种类保存的方法，具体是一种对植物主要根结线虫适用的脱离寄主植物的实验室繁殖和保存方法。属于植物根结线虫繁殖与保存的应用领域。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)是线虫中一类广泛分布于世界各地的植物根系定居性内寄生物，在分类上属于线形动物门、线虫纲、根结线虫属，是世界上十大最重要的植物寄生线虫属之一。已报道的根结线虫有90多个种，其中分布普遍危害最广的主要有南方根结线虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M.hapla)等四大优势种群。根结线虫属寄生范围广范，可侵染的植物超过3000种，分属114科，包括单子叶植物、双子叶植物，草本植物和木本植物等，蔬菜、粮食、经济和果树作物、观赏植物以及杂草等都可侵染，被喻为植物的隐蔽敌害。

根结线虫的生活周期分为卵、幼虫和成虫三个不同的阶段。受精卵经过有丝分裂发育成一龄幼虫(J1)，蜕皮后形成二龄幼虫(J2)，然后脱离卵壳进入土壤，开始侵染植物幼根；侵入根内的二龄幼虫第二次蜕皮后形成三龄幼虫(J3)，接着雌雄性生殖腺膨大伸长，植物根部出现明显“根结”；第三次蜕皮后四龄线虫开始性成熟，成熟雌虫虫体白色呈鸭梨形，雌雄线虫交尾后，雄虫在土壤中死亡；根内雌虫将卵粒产于虫体末端的胶质卵囊中，部分或全部暴露于根表面，在合适条件下不断繁殖生长。整个世代发育过程中，除卵粒、J1和J2可存在于土壤中外，J3、四龄线虫与雌、雄成虫必须在寄主植物根内才能完成其生长与分化。自然情况下，土壤与植物根系是根结线虫完成其生活周期的两个必要条件。

侵入植物根系的根结线虫取食于根内，阻止根部软组织原浆细胞有丝分裂时染色体的解开而诱导形成合胞体，破坏输导组织，改变寄主生理；在对寄主植物造成机械损伤的同时，分泌有毒物质，诱发其它病原物的入侵，致使植株生长迟缓，发育不良，严重时整株枯萎死亡，已被列为危害大、难防治的重要植物病原物。

对根结线虫进行基础理论和危害防治的研究，长期以来一直受到世界各国的重视。在许多研究场合，如线虫种类鉴定、寄主的抗线虫性鉴定、抗线虫指标的研究、线虫的为害损失测定以及线虫拮抗生防菌的筛选等工作中，获得大量幼虫甚至生育阶段一致的线虫，是一个不可缺少的实验环节，根结线虫的繁殖和保存是一项需要周期性进行的重要任务。

由于根结线虫是一种专性寄生物，在自然条件下生长与繁殖离不开植物根系和土壤，其种群培养和保存一直是困扰研究工作深入进行的主要问题之一，常规繁殖与培养一直依赖于活体寄主植物，需要温室、土壤及易感植物品种，涉及实验材料多，操作繁琐，周期长，不易管理。目前，根结线虫的种类研究已十分深入，生物防治研究也在世界各国广泛开展，而关于根结线虫培养繁殖的研究、应用报道却相对较少，国外的研究报道主要有以下几种：(1)寄主根系外植体培养法，Huettel，R.N.& Rebois，R.V.(1985)提出，选择敏感寄主根系片断，无菌条件下植入特定培养基，适时感染根结线虫卵粒或二龄幼虫，25℃恒温培养，40天后能从根表和根际培养基内收获第二代虫卵和二龄幼虫，避免了寄主植物及寄生线虫在温室土壤内的培育繁殖过程；Ko，M.P.，Schmitt，D.P&Sipes，B.S.(1996)报道，将已侵染根结线虫二龄幼虫的番茄根外植体和苜蓿愈伤组织植于Pluronic F127(一种聚醇凝胶培养基)上培养，既可正常繁殖根结线虫，还能保持培养过程的无菌状态。(2)寄主转化根系外植体培养法，S.Verdejo(1988)研究报道，经毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化后的植株具有侧根增多、易于次培养等特点，将毛根农杆菌转入番茄(Lycopersicon esculentum)、马铃薯(Solanum tuberosum))等植株根系于培养基上培养，选取转化根断接入特定培养基，2-10天内分别感染Meloidogyne javanica(爪哇根结线虫)卵粒与二龄幼虫，25℃培养42天后成功获得了大量虫卵和二龄幼虫；用同一方法繁殖Meloidogyne incognita(南方根结线虫)和Meloidogynec chitwoodi(奇得伍根结线虫)也得到一致结果，并提出，与常规寄主根系外植体培养法相比，转化根系外植体更有利于根结线虫的侵染繁殖，更适合进行根结线虫与土壤微生物相互关系的研究。(3)以拟南芥(Arabidopsis thaliana)作寄主培养，Sijmons，Peter C.(1991)在无菌条件下用组培法对74种不同生态型的拟南芥植株进行了南方和花生根结线虫的侵染试验，获得了100％的感染率，提出拟南芥可作为一种新的植物寄生线虫培养繁殖的模式寄主植物。(4)水培法，Lambert，K.N.(1992)报道了一种能在2个月内连续获得根结线虫二龄幼虫的营养液培植方法，无菌条件下先在温室内用马铃薯块茎盆栽培育幼苗，5-7周后重复接种爪哇根结线虫二龄幼虫3-5次，最后一次接种5-6天后，将染虫植株去土洗净转入盛有营养液的水培容器中，容器主体结构为一3升容量的布氏漏斗，漏斗顶部加有带孔盖，孔口用于加样、移放并固定植株，底部接上T形管，一端用于空气注入，一端用作流放液体；每3-4天补加一次因蒸腾作用而消耗的营养液，2周后开始从底端管口释放液体，孔筛过滤收获二龄幼虫，每24小时可收获一次，直至移植后的第9周。(5)番茄离体苗培养法，P.Hutangura(1998)研究报道，用番茄茎尖在穆拉希格(Murashige)和斯库克(Skoog)培养基上培养离体苗，一周后接种无菌根结线虫卵，5-7周后收获第二代卵块，卵粒在无菌水中温育孵化出的二龄幼虫可用于继续感染番茄离体苗或别的实验所需；经优化实验后报道，在培养基内添加0.5％的蔗糖、0.6％的植物胶，在pH 6.4的条件下恒温培养，对南方、花生、爪哇和北方4种主要根结线虫，都能在番茄离体苗内形成最高的根结指数，从而获得数量最多的雌虫和卵粒。在国内，黄翔研究报道，南方根结线虫在“龙溪8号”香蕉离体苗根内发育迟缓，不能正常完成生活周期，但在盆栽香蕉苗内能良好繁殖(黄翔，1995)；王汝贤研究报道了一种在Lambert，K.N.设计基础上有所改进的根结线虫水培繁殖方法(王汝贤，1999)；吴庆丽研究报道了用马铃薯作寄主盆栽培养根结线虫的效果(吴庆丽，2006)，并对易感马铃薯品种以及光温条件的影响作了深入研究，提出，与常用番茄培养法相比，用马铃薯块茎繁殖时，能形成具有强大分枝的须根系，有利于根结线虫的培养，而且由于植株所占空间相对较小，可以在培养箱中控制培养条件，从而达到保存或者大量繁殖根结线虫的目的。

根结线虫是一大类广泛存在的植物病原线虫，自然条件下其生活周期都要经历从土壤至寄主根内这两个统一而又不同的微环境，从而完成一次侵染过程，条件适宜时一个侵染周期需要30天左右的时间，这便构成了人工繁殖根结线虫的不便因素。迄今为止，国内外所报道的相关研究中，培养方法逐渐趋向于离开温室园地、离开土壤而在实验室内用营养液或者培养基的方法进行，但无论如何，根结线虫的取食寄生对象——土壤培育的寄主植株、组织培养的离体苗或一个根段外植体，其中之一是不可或缺的，而无菌培养这类植株或外植体，需要投入大量的时间和精力。如果只是给根结线虫提供一种食物源而不是寄主植物使其完成生长繁殖周期，将大大简化培养实验程序并缩短世代完成时间，进而为根结线虫的繁殖保存、为线虫相关理论及防治研究带来极大的便利。

中国热带农业科学院热带生物技术研究所鲍时翔课题组在根结线虫生物防治研究工作中发现，在海南所处的热带、亚热带气候条件下，土壤环境中的根结线虫二龄幼虫能存活很长时间，而且从病根土壤分离到的部分二龄幼虫其形体远比刚从卵内破壳出来时要大，于是推测，除寄主植物根系外，根结线虫，至少是二龄幼虫，应该还存在另外一类食物源。通过反复试验和筛选，最终找到了这种适于根结线虫生长繁殖的另类食物，并对以该种食物源培养根结线虫的相关条件进行了对比实验，获得了系统优化方案，经用分离自香蕉和蔬菜病根的三种主要根结线虫卵粒及孵化出的二龄幼虫接种培养试验，证明为一种不依赖寄主植物的根结线虫实验室人工培养与繁殖保存的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对植物根结线虫尚不能人工培养，依赖寄主植物繁殖周期长，需要园地、温室、盆栽或水培装置等配套设施，操作程序复杂，实验工作量大等特点，提出脱离寄主植物培养根结线虫，缩短繁殖周期，简化培养过程，并在短期内持续获得大量虫体，实现培养繁殖及种群保存过程实验室内的一体化。

本发明的目的是这样实现的：一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：将根结线虫卵粒或二龄幼虫以较少数量无菌条件下接入特定的二重培养基而不是寄主根系，恒温密闭状态下倒置培养，根结线虫在培养基内不停取食并快速生长和繁殖，繁殖高峰期时可以分离获得大量实验所需的线形虫体；另将培养平板适时转入冷凉条件下存放，半年后分离板内的二龄幼虫，接入新的二重培养基进行更新换皿传代培养，使培养过程脱离寄主植物，实现实验室内根结线虫繁殖与保存的人工一体化运行。

所述的根结线虫卵粒或二龄幼虫是这样获得的：将受根结线虫侵害并有明显根结的作物病根自来水冲净泥土，蒸馏水浸洗三次，双目解剖显微镜下分别挑取单一纯种卵囊，放入1.5ml灭菌Eppendorf管中，加0.5ml 1.0％ NaOCl消毒3分钟，蒸馏水洗三次，最后加入0.5-1ml无菌水摇匀，解剖镜下计数器计数，稀释或浓缩成1000粒/ml的根结线虫卵粒悬浮液；将按所述方法挑出并消毒清洗后的纯种卵囊放在双层滤纸上，置于浅盆中，28℃恒温箱中遮光孵化5天，每天加入适量蒸馏水以保持水面恒定，3-5天后收集已大量孵化的二龄幼虫水溶液，双目解剖镜下计数器计数，配制成1000条J2/ml的浓度，获得待接种的二龄幼虫液。

所述用于培养根结线虫的二重培养基是这样获得的：首先配制平板固体培养基，称取马铃薯200克，去皮，切成碎块煮沸半小时，两层纱布过滤，加葡萄糖20克，琼脂15-16克，溶化后补足水至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌20分钟，趁热倒入灭菌培养皿，每个9cm培养皿15-20ml的倒入量，无菌风吹干；在制得的培养平板内，每皿接入0.1ml的镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense孢子悬浮液，涂布平板，28℃恒温倒置培养，3-5天后白色菌丝长满整个平板，即得培养根结线虫的二重培养基。

在制备根结线虫二重培养基的过程中，所述的镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense孢子悬浮液是这样获得的：将镰刀菌Fusarium oxsporum f.sp.cubense的保藏菌种接入试管斜面培养基中进行斜面活化后，再置入装有液体种子培养基的容量为100ml的三角瓶，装液量为20-30ml/100ml；摇床转速180r/min，培养期的环境温度为28士2℃；将三角瓶置于摇床培养2-3天后，取0.1ml接入平板固体培养基，均匀涂布，3-5天菌丝长满平板后，用无菌水冲洗，转入100ml三角瓶中，4℃保存备用。

在获得镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense孢子悬浮液的过程中，所述的试管斜面培养基为：葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH₂PO₄ 1克，MgSO₄·7H₂O 0.5克，琼脂15-20克，pH自然，水1000毫升；所述的液体种子培养基为：葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH₂PO₄ 1克，MgSO₄·7H₂O 0.5克，pH自然，水1000毫升。

所述根结线虫卵粒或二龄幼虫较少的接种量，是指取浓度为1000粒/ml的卵粒悬浮液或1000条J2/ml的幼虫液0.1ml，每个9cm的二重培养基平板100个卵粒或100条J2的接入量，即能满足繁殖所需；悬浮液整体接入二重培养板中央，无需摇动或涂布，静置2-3个小时后再倒放；所述的恒温密闭状态，是将接种好的培养平板用风口膜密封后，放入28℃培养箱内倒放静置培养。

接入100个卵粒，1周后卵粒开始孵化出二龄幼虫，幼虫取食培养板内的菌丝体并不断生长，从第2周开始，白色菌丝体从中央接种处至周围方向逐渐减少，第3周后菌丝体被取食完毕，只剩下粘湿的固体培养基，每平方厘米的培养基内已有约200条的线形活虫体，虫体继续取食培养基内的镰刀菌孢子，至第6周时繁殖数量到达顶峰，培养基内虫体数目平均可达600-800条/cm²；接入100条已孵化好的二龄幼虫，幼虫立即开始取食菌丝，在培养板内的整体生长繁殖过程比接种卵粒的提前1-2周，即在第4周时繁殖数量可抵达高峰，此时，每个9cm培养皿内可平均收获1.5×10⁴条线虫。

所述的转入冷凉条件下存放，是将已进入繁殖高峰期的根结线虫培养平板，倒置于12士2℃的恒温箱内，4-6个月后培养基内仍有可供继代繁殖的活虫体，用贝曼氏漏斗法分离培养基中的线虫，或者取适量培养基，消毒小匙捣碎后放入无菌三角瓶中，加入10倍体积的蒸馏水，160r/min摇动15-20分钟，300目筛网过滤，获得二龄线虫液，又可继续接种繁殖。

本发明的优点在于：由于采用二重培养基，琼脂含量适中的固体培养基一方面培养出丰富的镰刀菌菌丝体与镰刀菌孢子，为根结线虫提供非寄主植物的食物来源，另一方面又为根结线虫构建了一个适于生长繁殖的微域环境，使根结线虫从受精卵有丝分裂孵化出一龄幼虫直至成熟雌虫产出胶质卵块的整个生活周期都处于同一固定环境中，既省去了寄主植株培育的繁杂程序，又成倍缩短了线虫一个世代完成的时间，短期内便能获得实验所需的大量虫体；虫种保存只需将培养平板转入12℃的冷凉环境中，4-6个月后再换板传培；该培养方法将根结线虫的全部繁殖保存过程简化在单纯的实验室内，同时又能与特定虫种对作物的侵害研究有机的结合起来，灭菌土盆栽苗回接感染试验表明，无论换代培养多少次，从培养基内分离出的二龄幼虫对敏感寄主作物均保持侵染能力，都能在寄主根系形成明显的“根结”；根结线虫实验室人工培养所采用的二重培养基组分均属常规材料，成本低廉，制作方法简单，可操作性强；本发明为根结线虫的种类保存，特别为根结线虫相关理论及防治研究中所需的大量虫体，提供了一种简便、快捷的繁殖方法，同时也为根结线虫雌虫发育行为因环境改变而变化的特别现象，提出了一个尚待深入研究的崭新课题。

具体实施方式

实施例1：培植镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense的培养基的配制

试管斜面培养基的配制：称取葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH₂PO₄ 1克，MgSO₄·7H₂O0.5克，溶解在1000毫升水中，加入琼脂15-18克，加热煮沸至琼脂溶化，补足体积至1000毫升，适当冷却后分装到试管中，装量为试管高度的1/5-1/6，用试管塞塞好试管口，121℃高压灭菌25min，趁热取出后摆斜面至冷却备用，斜面高度不超过试管高度的1/3。

液体种子培养基的配制：称取葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH₂PO₄ 1克，MgSO₄·7H₂O 0.5克，溶解在1000毫升水中，然后分装，装液量为20-30ml/100ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121℃高压灭菌25min，冷却后备用。

固体培养基的配制：称取马铃薯200克，去皮，切碎煮沸半小时，用两层纱布过滤，加葡萄糖20克，琼脂粉15-16克(为了适于后来线虫的活动与繁殖，琼脂含量以1.5％-1.6％为宜)，溶化后补足水至1000毫升，121℃高压灭菌20分钟备用。

实施例2：镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense孢子液的制备

本发明中所述的镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense是由本实验室采用斜面冷藏法保藏的菌种。

a)镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense菌种的活化

采用斜面保藏菌种的活化方法：从斜面保藏的菌种中挑取一块直径约8mm的菌种接种到试管斜面培养基中活化，在28士2℃的环境中培养3-5天后备用。

b)种子液的培养

从试管活化好的镰刀菌中挑取三个菌块分别接种在三个容积为100ml的装有25ml液体种子培养基的三角瓶中，置于摇床，摇床的转速180r/min，在28士2℃的环境中继续培养，培养3-4天后备用。

c)孢子液的制备

取0.1ml培养好的镰刀菌种子液，分别接入三个直径为9cm的固体培养平板中，均匀涂布，在28士2℃的条件下倒置培养3-5天，选择菌丝生长丰满且纯净的平板，每板用30ml无菌水，分三次加入平板菌丝上，涂布棒轻轻刮动，用移液枪将孢子液移入100ml灭菌三角瓶中，密封，4℃冰箱内保存备用。

以上所有接种及孢子液的制备过程必须在无菌条件下，即在经紫外线灭菌半小时的超净工作台的酒精灯旁无菌操作。

实施例3：二重培养基的制备

将配制好的固体培养基趁热或加热溶化后，于灭好菌的超净工作台内倒入9cm无菌培养皿中，倒入量以培养基盛满皿底的1/4厚度为宜，太少会限制线虫的生存活动空间，过多则不利于线虫的分离。待培养基冷却凝固后，每板接入0.1-0.2ml的镰刀菌Fusarium oxysporumf.sp.cubense孢子液，涂布均匀，封口膜密封，28℃恒温培养箱中倒置培养3-5天，白色菌丝长满整个平板后即为二重培养基。

实施例4：根结线虫卵粒悬浮液的制备

从海南省海口市秀英区永庄村蔬菜地采集受根结线虫侵害并有明显根结的番茄病根，装入塑料样品袋，带回实验室自来水冲净泥土，蒸馏水浸洗三次，双目解剖显微镜下各挑取三块较大的单一纯种卵囊，分别放入1.5ml灭菌Eppendorf管中，加0.5ml 1.0％ NaOCl消毒3分钟，2000r/min离心3分钟，吸弃上半层液体，向管内下部液体加入0.5ml蒸馏水混匀，同法离心洗三次，最后加入0.5ml无菌水摇匀，解剖镜下计数器计数，配制成浓度为1000粒/毫升的根结线虫卵粒悬浮液，备用。

实施例5：根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备

从海南省海口市府城镇那央村香蕉园采集受根结线虫侵害并有明显根结的香蕉病根，采用与实施例4所述的相同方法挑取并消毒大块纯种卵囊，转至双层滤纸上，搁置于浅盆中，28℃恒温箱中遮光孵化5天，每天加入适量蒸馏水以保持水面恒定，3-5天内收集已大量孵化的二龄幼虫水溶液，双目解剖镜下计数器计数，2000r/min离心3分钟，吸弃上层液体，浓缩至约1000条J2/ml的浓度，获得待接种的二龄幼虫液。

实施例6：用卵粒悬浮液接种二重培养基培养繁殖根结线虫

在无菌超净工作台内，取0.1ml制备好的根结线虫卵粒悬浮液(100个卵粒)，接入二重培养基平板正中央，盖好静置1小时，液滴在原处浸入菌丝间隙后，封口膜封闭平板，放入28℃恒温箱中倒置培养。

观察发现，一周内平板菌丝保持不变，十天后中央接种处的菌丝开始消退，并逐渐向四周延伸，两周时菌丝消退圈的直径达4厘米左右，至第三周时菌丝完全消失，剩下暗黄潮湿的培养基。定期从平板内菌丝消失区域取出10mm³(5×2×5mm)的培养基放入24孔细胞培养板内，加入1ml蒸馏水搅匀，倒置显微镜下统计所含线虫虫体的数目，并换算成每平方厘米培养基下所含的虫口数(表1)。结果表明，根结线虫卵粒在二重培养基上于28℃条件下，一周后孵化出二龄幼虫并取食菌丝开始生长，三周后虫体以培养基内的镰刀菌孢子为食，数量开始增加并持续繁殖，至第六周时培养基内虫体数量达到顶峰(每平方厘米培养基下含600条各龄虫体)，以后数量略有减少，直至第九周后，虫口密度才不断下降。

表1 接种100个卵粒后不同时期平板内线虫密度统计数量(单位：线虫条数/cm²培养基)

实施例7：用孵化的二龄幼虫接种二重培养基培养繁殖根结线虫

在无菌超净工作台内，取0.1ml制备好的根结线虫二龄幼虫悬浮液(100条J2)，接入二重培养基平板圆心处，合上盖静置1小时，液滴在原处浸润下沉后，封口膜封闭培养皿，放入28℃恒温箱中倒置培养。

观察表明，一周后中心接种处的菌丝即开始消退，消退圈不断向四周扩展，两周时平板菌丝消失完毕，剩下潮湿裸露的培养基。采用与实施例6所述的方法统计平板内不同时期线虫虫体的繁殖数量，结果见表2。实验表明，28℃条件下，根结线虫二龄幼虫在二重培养基内能立即取食菌丝并开始生长分化，两周后虫体继续以培养基内的镰刀菌孢子为食，并繁殖出下一代幼虫，数量不断增加，至第四周时培养基内虫体繁殖数量达到高峰(每平方厘米培养基下含800条混合虫体)，第五周后数量开始缓慢减少，至第九周时，虫口密度为高峰值时的37％。

表2 接种100条J2后不同时期平板内线虫密度统计数量(单位：线虫条数/cm²培养基)

实施例8：换板传代培养繁殖

分别用实施例6中所述的培养至第6周和实施例7中所述的培养至第9周的培养平板，超净工作台内各取10ml培养基于50ml三角瓶内，每瓶加入10ml蒸馏水，封口，摇床里160r/min振动20分钟，用100目和300目孔筛重叠套架在小烧杯上(100目在上，300目在下)，搅拌过滤，烧杯里的滤液即为二龄线虫液体；取滤液0.2ml镜检计数，配制成1000条J2/ml的线虫液，各取0.1ml分别接种在新制成的二重培养基平板中心处，按与实施例7所述的相同方法放入28℃恒温箱中倒置培养。观察记录表明，尽管分离虫种时，第一次平板培养时间有所不同，但二次接种后，培养板内菌丝及孢子被食取的快慢、线虫增殖的速度皆与实施例7中所统计的结果相一致。进一步的换板培养试验证明，根结线虫的换板传代培养繁殖可以不受限制的进行下去。

实施例9：培养板的冷凉保存

选择实施例8中制得的两种培养平板，在培养的第四周即板内线虫繁殖密度到达高峰值时，转入12士2℃的恒温箱内倒置存放，4个月后随机打取板内10mm³的培养基，按实施例6所述方法镜检计数，发现板内的平均活虫密度分别为转存时的46％和50％，采用相同方法，在冷藏第6个月后再一次镜检计数，板内平均活虫密度分别为转存时的25％和30％；按实施例8所述方法分离培养基内的二龄幼虫活虫体，转入新制成的二重培养基中换板培养，获得了与实施例8所述的相同结果，证明在12士2℃的恒温条件下，换板培养时间可以长达6个月，如果仅仅为了根结线虫的种群保存，一年内只需换板培养两次。

实施例10：培养板内繁出线虫的分子鉴定

无论采用挑自病根内的根结线虫卵囊，还是卵粒孵化出的二龄幼虫，接种二重培养基后，二三龄幼虫、雄成虫、卵粒的形态，以及卵粒的分裂孵化过程，与在寄主根内和土壤环境中的情形完全相同，所不同的是，植物根内发育的雌成虫为静止不动的鸭梨形，而培养基内发育的雌成虫是能游动的宽带蠕虫型，为了检测这种变态发育了的雌虫是否属于根结线虫，选择了mtDNA-PCR(线粒体DNA限制性片段扩增)法对所培养的线虫进行种类鉴定。采用Powers等(1993)设计的引物# C2F3和# 1108扩增提取自宽带雌虫mtDNA中COII基因和LrRNA基因之间的保守区段，分别扩出了1.1kb和1.7kb的特异条带，参阅海南省果树与蔬菜根结线虫分子鉴定的相关文献，证实采自永庄村番茄根结虫卵培养出的线虫为南方根结线虫，采自那央村香蕉根结虫卵培养出的线虫是花生根结线虫，表明培养板内的线虫属于根结线虫。

实施例11：培养线虫对寄主植物的回接侵染

采集砂壤土，121℃湿热灭菌120分钟，室内露置两天，多次翻动；取部分灭菌土，温室内苗床培育番茄幼苗(番茄品种：亚蔬12，种子由海南省亚蔬科技有限公司提供)，两周后将具有三片以上真叶的幼苗移栽至盛有灭菌土的花钵中，另购香蕉组培苗(品种名：巴西蕉)，同时移栽于花钵无菌土中，置于大棚温室内，每天适量浇水；移栽30天后选择生长健壮的植株，在根部接种已分别换板培养6次和9次的南方根结线虫与花生根结线虫液，接种量：1000条各龄线形虫体/株，每种线虫各接种3株番茄与3株香蕉，另设3株番茄与3株香蕉清水处理作对照，共计18个盆栽处理，每天少量浇水。线虫接种40天后，轻轻从花钵内连土取出各处理植株，清水洗净根部泥土，统计根结指数(结果见表3和表4)。根结指数采用五级分类法，0级：根部无根结，一级：微量根结(1％-10％)，二级：少量根结(11％-30％)，三级：中量根结(31％-50％)，四级：根结严重(51％-70％)，五级：根结很严重(71％-100％)。统计结果表明，无论换板培养多少次，所培养的根结线虫均保持着对寄主植物的侵染能力，都能在寄主根内重新形成鸭梨形雌虫。解剖显微镜下从形成的根结内挑取雌虫，制作会阴花纹切片，花纹形状也分别符合南方根结线虫和花生根结线虫的基本特征。

表3 盆栽番茄苗接种培养线虫后根结指数调查(单位：级)

表4 盆栽香蕉苗接种培养线虫后根结指数调查(单位：级)

此外，从海口市府城镇红星村采集受根结线虫危害的茄子病根，按实施例4所述方法清洗消毒后，在同一植株根内挑出10头雌虫直接放入新制成的二重培养基中心，28℃倒置培养，两周后雌虫解裂，体内释出的卵粒开始孵化，至第三周时平板菌丝开始消失，五周后培养基内充斥着高密度的线形虫体；用采自海南省定安县雷鸣镇田芳岭村受侵害的胡椒病根，同法清洗消毒后，将一小块卵囊直接挑入二重培养基平板中心，28℃倒置培养，也获得了与实施例4所述的相同的培养繁殖结果，说明用本发明所涉及的技术方案培养繁殖根结线虫是可行的，根结线虫能够进行人工培养并在实验室内保存。

Claims (8)

1、一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：将根结线虫卵粒或二龄幼虫以较少数量无菌条件下接入特定的二重培养基而不是寄主根系，恒温密闭状态下倒置培养，根结线虫在培养基内不停取食并快速生长和繁殖，繁殖高峰期时可以分离获得大量实验所需的线形虫体；另将培养平板适时转入冷凉条件下存放，半年后分离板内的二龄幼虫，接入新的二重培养基进行更新换皿传代培养，使培养过程脱离寄主植物，实现实验室内根结线虫繁殖与保存的人工一体化运行。

2、根据权利要求1所述的一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：所述根结线虫卵粒或二龄幼虫是这样获得的：将受根结线虫侵害并有明显根结的作物病根自来水冲净泥土，蒸馏水浸洗三次，双目解剖显微镜下分别挑取单一纯种卵囊，放入1.5ml灭菌Eppendorf管中，加0.5ml 1.0％ NaOCl消毒3分钟，蒸馏水洗三次，最后加入0.5-1ml无菌水摇匀，解剖镜下计数器计数，稀释或浓缩成1000粒/ml的根结线虫卵粒悬浮液；将按所述方法挑出并消毒清洗后的纯种卵囊放在双层滤纸上，置于浅盆中，28℃恒温箱中遮光孵化5天，每天加入适量蒸馏水以保持水面恒定(淹过浅盆筛孔正面)，3-5天后收集已大量孵化的二龄幼虫水溶液，双目解剖镜下计数器计数，配制成1000条J2/ml的浓度，获得待接种的二龄幼虫液。

3、根据权利要求1所述的一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：所述用于培养根结线虫的二重培养基是这样获得的：首先配制平板固体培养基，称取马铃薯200克，去皮，切成碎块煮沸半小时，两层纱布过滤，加葡萄糖20克，琼脂15-16克，溶化后补足水至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌20分钟，趁热倒入灭菌培养皿，每个9cm培养皿15-20ml的倒入量，无菌风吹干；在制得的培养平板内，每皿接入0.1ml的镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense孢子悬浮液，涂布平板，28℃恒温倒置培养，3-5天后白色菌丝长满整个平板，获得培养根结线虫的二重培养基。

4、根据权利要求3所述的一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：所述的在制备根结线虫二重培养基的过程中，所用镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense孢子悬浮液是这样获得的：将镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense的保藏菌种接入试管斜面培养基中进行斜面活化后，再置入装有液体种子培养基的容量为100ml的三角瓶，装液量为20-30ml/100ml；摇床转速180r/min，培养期的环境温度为28士2℃；将三角瓶置于摇床培养2-3天后，取0.1ml接入平板固体培养基，均匀涂布，3-5天菌丝长满平板后，用无菌水冲洗，转入100ml三角瓶中，4C保存备用。

5、根据权利要求4所述的一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：在制备镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense孢子悬浮液的过程中，所述的试管斜面培养基为：葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH₂PO₄ 1克，MgSO₄·7H₂O 0.5克，琼脂15-20克，pH自然，水1000毫升；所述的液体种子培养基为：葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH₂PO₄ 1克，MgSO₄·7H₂O0.5克，pH自然，水1000毫升。

6、根据权利要求1所述的一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：所述根结线虫卵粒或二龄幼虫较少的接种量，是指取浓度为1000粒/ml的卵粒悬浮液或1000条J2/ml的幼虫液0.1ml，每个9cm的二重培养基平板100个卵粒或100条J2的接入量，即能满足繁殖所需；悬浮液整体接入二重培养板中央，无需摇动或涂布，静置2-3个小时后再倒放；所述的恒温密闭状态，是将接种好的培养平板用风口膜密封后，放入28℃培养箱内倒放静置培养。

7、根据权利要求1所述的一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：所述根结线虫在培养基内不停取食并快速生长和繁殖，繁殖高峰期时可以分离获得大量实验所需的线形虫体，是指在二重培养基中接入100个卵粒，1周后卵粒开始孵化出二龄幼虫，幼虫取食培养板内的菌丝体并不断生长，从第2周开始，白色菌丝体从中央接种处至周围方向逐渐减少，第3周后菌丝体被取食完毕，只剩下粘湿的固体培养基，每平方厘米的培养基内已有约200条的线形活虫体，虫体继续取食培养基内的镰刀菌孢子，至第6周时繁殖数量到达顶峰，培养基内虫体数目平均可达600-800条/cm²；接入100条已孵化好的二龄幼虫，幼虫立即开始取食菌丝，在培养板内的整体生长繁殖过程比接种卵粒的提前1-2周，即在第4周时繁殖数量可抵达高峰，此时，每个9cm培养皿内平均可收获1.5×10⁴条线虫。

8、根据权利要求1所述的一种植物根结线虫人工培养及繁殖保存的方法，其特征在于：所述的转入冷凉条件下存放，是将已进入繁殖高峰期的根结线虫培养平板，倒置于12士2℃的恒温箱内，4-6个月后培养基内仍有可供继代繁殖的活虫体，用贝曼氏漏斗法分离培养基中的线虫，或者取适量培养基，消毒小匙捣碎后放入无菌三角瓶中，加入10倍体积的蒸馏水，160r/min摇动15-20分钟，300目筛网过滤，获得二龄线虫液，又可继续接种繁殖。