CN114680083B

CN114680083B - 一种无菌丰年虫的制作方法及其应用

Info

Publication number: CN114680083B
Application number: CN202210482684.8A
Authority: CN
Inventors: 贾盼盼; 裴得胜
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114680083A

Abstract

本发明属于水产养殖技术领域，具体公开了一种无菌丰年虫的制作方法及其应用。本发明经过处理浓度、无菌和孵化效果对比及方法优化，最终获得5种快速、高效、简便、较为成熟的孵化方案，用于制备无菌丰年虫；制得无菌丰年虫可作为所有鱼类及其他水生生物模型的开口期至成年阶段的重要活体饲料。与传统方法相比，本方法均具有孵化装置简单、避免曝气污染、获得孵化后丰年虫时间短、无菌率高、成本低、易操作等特点，为长期无菌鱼类模型构建、无菌丰年虫模型的环境毒性检测等科研领域提供了重要的技术支撑。

Description

一种无菌丰年虫的制作方法及其应用

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，特别是涉及一种无菌丰年虫的制作方法及其应用。

背景技术

丰年虫(Brine shrimp,Artemia salina),俗名丰年虾、盐水丰年虫、盐虾或鳃足虫，为节肢动物门、鳃足纲、无甲目、盐水丰年虫科，卤虫属(Artemia)，一种小型低等、广温、耐高盐型甲壳动物。丰年虫具有较强适应能力、繁殖能力，休眠卵可长时间保存且孵化时间短，孵化出的无节幼体含丰富蛋白质和不饱和脂肪酸，及类胡萝卜素、核黄素和一些蜕皮激素类物质，因其极高的营养价值而成为当前世界85％以上的水产动物育苗饵料。此外，丰年虫因其生活习性和特殊生理结构常被应用于环境污染物评价和生态毒理学研究中，属于标准实验生物，故无菌丰年虫模型的制备具有重要研究意义。

斑马鱼(Zebrafish,Danio rerio)模式生物具有生长周期短、产卵量多、胚胎透明、易饲养、与人类基因组高度相似等优势，通常用于环境毒理学、遗传发育学等研究。在2004年，Rawls et al.提出无菌斑马鱼模型建立方法，已被用于免疫、代谢、疾病模型、药物筛选等研究，但由于无菌动物微生物组的缺失、消化系统和免疫系统的缺陷，无菌鱼类模型及其应用研究受限制于早期卵黄供能无需进食阶段。开口期饵料是影响鱼类孵化初期至青少年时期存活率和生长率的最主要因素。多数鱼类从出膜到开口、从内源性营养转向外源性营养的过程伴随着消化系统的形成和逐渐完善。孵化幼鱼在开口摄食前已能分泌多种消化酶，但相对活性较差，不能有效利用饲料营养成分，而部分生物饵料可为幼鱼提供外源性消化酶，在一定程度上提高幼鱼的消化能力而促进其生长。常用的鱼类开口饲料有丰年虫、熟蛋黄、红线虫、微颗粒饲料等，但也有研究证明多数鱼类早期阶段对人工合成微颗粒不能真正消化吸收，并有肠道被逐渐填满死亡风险。天然饵料中，线虫体内富集大量有机磷、有机氯和重金属等毒害物质，且需要磨碎才能投喂早期幼鱼，极易污染养殖水体。相比而言，丰年虫喂食对幼鱼的生长速度和存活率都高于饲料组和熟蛋黄组，是最适宜的幼鱼开口饵料。另外，丰年虫也可作为其他模式鱼类如海水青鳉(Marine medaka,Oryziasmelastigma)、稀有鮈鲫(Rare gudgeon,Gobiocypris rarus)等开口期幼鱼至生长繁殖成鱼阶段的活饵饲料，丰富的营养成分对亲鱼性腺发育、产卵量和子代均有重要影响。

因此，无菌丰年虫(germ-free Artemia,GF-A)等开口活体饵料的制备是长期无菌鱼类模型建立的重要前提，尤其是相比微颗粒饲料和蛋黄处于静止状态和在水中容易失散而引起水质败坏的特征，丰年虫在养鱼水体能够存活一定时间，幼鱼与丰年虫活体相遇频率较高，比较适宜摄食。

目前丰年虫的孵化制作是采用曝气法，然而传统曝气法制作丰年虫时使用的孵化设备和操作过程复杂，孵化时间久，至少需要48h，且持续曝气极易导致污染。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种无菌丰年虫的制作方法及其应用，用于解决现有技术中传统曝气法制作丰年虫使用的孵化设备和操作过程复杂、孵化时间久、持续曝气极易导致污染等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种无菌丰年虫的制作方法，包括如下步骤：将丰年虫卵(Brine shrimp eggs)漂洗杀菌处理、灭菌水清洗干净后用筛网过滤，放入灭菌盐水中制成灭菌盐水虫卵混合液，然后进行无菌孵化，获得无菌丰年虫，无菌孵化方法选自以下方式中的任意一种：

(a)将灭菌盐水虫卵混合液置于封口膜封口的无菌瓶中，光照条件下在摇床上摇晃孵化；

(b)将灭菌盐水虫卵混合液置于封口膜封口的无菌瓶中，避光条件下在培养箱中静置孵化；

(c)将灭菌盐水虫卵混合液置于一次性培养皿中，封口后，避光条件下在培养箱中静置孵化；

(d)将灭菌盐水虫卵混合液涂布在TSA平板上，封口后，避光条件下在培养箱中静置培养；

(e)将灭菌盐水虫卵混合液置于盛有TSB或BHI培养基的无菌容器中，封口后，光照条件下在摇床上摇晃孵化。

进一步，所述无菌孵化方法选自(a)、(d)、(e)方式中的任意一种，优选为(a)。

进一步，孵化温度为30±2℃。

进一步，孵化时间为20-72h，优选为24～48h。孵化超过3天会导致丰年虫沉淀死亡，所以最长孵化到72h。

进一步，所述无菌瓶为灭菌处理后的玻璃瓶。

进一步，所述方式(a)、(e)中，摇床转速为100～200rpm。

进一步，采用次氯酸钠(NaClO)溶液对丰年虫卵进行漂洗杀菌处理，然后用灭菌水清洗干净；优选地，次氯酸钠溶液的浓度为1.0～3.0g/L，更优选为2.0～2.5g/L。

进一步，丰年虫卵漂洗杀菌处理时间为3～10min，优选为4～8min。

进一步，所述灭菌水为无菌超纯水。

进一步，漂洗后丰年虫卵用灭菌水清洗至少3次，每次1～2min。

进一步，所述灭菌盐水的浓度为2.0％-3.5％，优选为2.25～2.5％。

进一步，所述灭菌盐水虫卵混合液中，丰年虫卵的用量为2.5～5.0g/L，优选为2.5g/L。

上述操作步骤在超净工作台或生物安全柜无菌环境下进行。

本发明第二方面提供根据第一方面所述的方法在制作无菌丰年虫以及在无菌鱼培育和毒理学检验领域中的应用。

本发明第三方面提供一种无菌鱼的培育方法，包括如下步骤：采用第一方面所述的方法制备无菌丰年虫，然后用于喂食幼鱼，培育得到无菌鱼。

进一步，用一次性无菌吸管选取活跃游动的无菌丰年虫制成无菌丰年虫悬液，用于喂食幼鱼。

进一步，选取24～48h连续孵化的无菌丰年虫，制成无菌丰年虫悬液后用于喂食幼鱼。

进一步，喂食方法包括如下步骤：幼鱼在7-10dpf喂食灭菌蛋黄，从11-18dpf开始喂食灭菌蛋黄和无菌丰年虫，每天喂食1次，每次可摄食2～3只丰年虫/每条幼鱼，根据生长发育逐步增加喂食量，至幼鱼完成摄食丰年虫即可断掉蛋黄，全部喂食无菌丰年虫，直至成鱼。

进一步，所述鱼包括淡水鱼和海水鱼，包括但不限于斑马鱼、海水青鏘、淡水青鏘、稀有鉤鲫、罗非鱼、草鱼、鲢鱼等其他淡水鱼及海水鱼类。

进一步，所述鱼的生长周期包括幼鱼阶段和成鱼阶段，包括所有喂食丰年虫时期。

如上所述，本发明的无菌丰年虫的制作方法及其应用，具有以下有益效果：

本发明创新使用无菌玻璃瓶封口膜摇床法，不加曝气，孵化时间最短仅需24h，就能获得孵化率、存活率、无菌率较高的无菌丰年虫，避免持续曝气、复杂的孵化装置和外界污染，极大简化和节约了无菌鱼类饵料制作的经济、人力、时间、实验仪器等生产成本投入，能经济简便快速地制备得到无菌丰年虫，具有很大实际应用价值和潜力。本发明制得的无菌丰年虫可用于珍贵鱼类的开口期高质量喂食，为无菌鱼类培育提供了洁净、高营养的活体饵料，为长期无菌鱼类模型构建、丰年虫模型的环境毒性检测等科研领域应用提供了重要的技术支撑。

附图说明

图1显示为本发明实施例中无菌丰年虫模型的制作流程图。

图2显示为本发明实施例1中未处理丰年虫卵和漂洗处理后丰年虫卵和的镜检图，其中，图2A中为未处理丰年虫休眠卵，图2B中为漂洗处理后的虫卵。

图3显示为本发明实施例1中处理后丰年虫卵封口膜摇床法孵化24h的镜检状态图，其中(A)为显微镜拍照放大倍数1×，标尺：2000μm，(B)为放大倍数3×，标尺：1000μm。

图4显示为本发明实施例2中无菌丰年虫制作过程中采集样品的无菌检测结果举例图，其中，(A)为未处理丰年虫卵和处理后丰年虫卵，孵化后无菌丰年虫悬液的TSA平板、血平板、双层板涂板，(B)为未处理丰年虫卵和处理后丰年虫卵。

具体实施方式

下面具体的例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行具体的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其中，丰年虫卵来源为：购买自尚嘉水族，产品为罐装丰年虾卵(Aquamaster品牌，Artemia cysts,Brine shrimp eggs)，使用期间密闭封口4℃冰柜保存。

TSB培养基：400mL胰蛋白胨大豆肉汤(Trypticase Soy Borth,TSB)培养基含6g胰蛋白胨，2g大豆蛋白胨，2g NaCl；

BHI培养基：称取脑心浸液培养基(Brain Heart Infusion Medium,BHI)3.7g溶于100mL超纯水，混匀灭菌备用；来源Solarbio，货号：Cat#B8130；

TSA平板：称取6g胰蛋白胨，2g大豆蛋白胨，2g NaCl，6g琼脂粉配制400mL胰蛋白胨大豆肉琼脂(Trypticase Soy Agar,TSA)培养基，混匀灭菌倒板备用；

血平板：TSA平板加5％无菌脱纤维绵羊血，来源Solarbio，货号：Cat.No.TX0030；

双平板：TSA平板涂板后倒入上层TSA固体培养基，厚度为2-3mm。

厌氧管：配置好TSB和BHI培养基分装至厌氧管，充高纯氮气排净空气。

以上实验材料高压灭菌后，固体培养基倒板，液体培养基冷却至室温后放置4℃冰箱备用。

实施例1

一.按照图1所示流程，在超净工作台/生物安全柜无菌环境操作可获得无菌丰年虫模型，具体步骤如下：

1.实验材料灭菌准备

使用蓝盖瓶配制2.5％孵化盐水，并将蓝盖瓶容器2个、及操作过程需用到的孵化盐水、超纯水、超密滤网、EP管、TSB和BHI培养基、烧杯等实验材料进行高温、高压灭菌；

2.漂洗杀菌处理丰年虫卵

将0.5g普通带壳丰年虫卵(Brine shrimp eggs)用现配制2.4g/L浓度的次氯酸钠(NaClO)漂洗5min；

3.丰年虫卵过滤清洗：

将漂洗处理后的丰年虫卵用灭菌超密短把滤网(长约17.5cm，半径约6.0cm，孔径约170目)过滤，并用灭菌超纯水清洗3次，每次1-2min；

4.丰年虫卵分装孵化及各方法对比

将清洗后的约0.5g丰年虫卵转移至200mL 2.5％灭菌盐水中，按照如下6种方法进行混匀分装和无菌孵化：

(a)蓝盖玻璃瓶封口膜摇床孵化法：分装50mL灭菌盐水虫卵混合液于灭菌蓝盖玻璃瓶(容积100mL)，封口膜封口后放入30℃摇床，在150rpm转速和光照条件下(光照条件即不避光，在普通培养箱和白光灯强度范围均可)孵化24h；

(b)蓝盖玻璃瓶封口膜培养箱静置法：分装50mL灭菌盐水虫卵混合液于灭菌蓝盖玻璃瓶(容积100mL)，封口放入30℃培养箱，静置避光条件下孵化24h；

(c)一次性培养皿封口培养箱静置法：分装8mL灭菌盐水虫卵混合液于一次性培养皿，封口放入30℃培养箱，静置避光条件下孵化24h；

(d)丰年虫卵TSA平板涂布封口培养箱静置法：分装1mL灭菌盐水虫卵混合液于TSA平板进行涂布，封口放入30℃培养箱，静置避光条件下培养24h；

(e)丰年虫卵TSB或BHI培养基玻璃管摇床孵化法：收集1mL灭菌盐水虫卵混合液于分装有5mL TSB或BHI培养基的玻璃管，封口放入30℃摇床，在150rpm转速和光照条件下培养24h；

(f)蓝盖玻璃瓶封口磁力搅拌法：分装约100mL灭菌盐水虫卵混合液于蓝盖玻璃瓶(500mL)，加入灭菌转子，封口放置于磁力搅拌器上，在室温、转速450rpm条件下孵化24h；

5.孵化24h的丰年虫过滤清洗制备无菌丰年虫喂食悬液

将孵化的丰年虫用一次性无菌吸管取出中下层悬浮虫子悬液(注意避去上层漂浮虫卵和空壳)约30mL，进行灭菌滤网过滤，并用灭菌超纯水于灭菌烧杯中清洗3次，每次约30s～1min，清洗后虫子用约4mL灭菌超纯水制成无菌丰年虫悬液，再次吸取EP管中无菌丰年虫悬液中上层活跃游动的丰年虫(注意避去底层不游动丰年虫和个别漂浮虫卵/壳)，于新无菌EP管内用约4mL灭菌超纯水制成无菌丰年虫悬液，即用于喂食和无菌检测；

6.无菌丰年虫的样品采集和无菌检测

利用TSA平板，血平板，TSA双平板，TSB培养基，BHI培养基，好氧玻璃管和厌氧管，对漂洗处理后的丰年虫卵、无菌盐水孵化后的丰年虫等样品进行好氧和厌氧条件下的无菌检测；

收集样品为：未处理虫卵，漂洗处理后虫卵，孵化清洗后丰年虫，灭菌超纯水作为对照；摇菌条件为30℃，150rpm；平板条件为：30℃培养箱，静置不加光照，分别在24h,48h,72h,96h,120h观察平板和摇菌结果，并延长观察记录至144h,168h；

利用PCR技术和16S引物(27F-1492R,63F-1387R)对收集样品悬液：未处理虫卵，漂洗处理后虫卵，孵化清洗后丰年虫，灭菌超纯水作为对照等，进行无菌条件检测。其中引物序列为：27F-5’AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3’(SEQ ID NO.1)和1492R-5’ACG GYT ACCTTG TTA CGA CTT 3’(SEQ ID NO.2)；63F-5’CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC 3’(SEQ IDNO.3)和1387R-5’GGG CGG WGT GTA CAA GGC 3’(SEQ ID NO.4)；Takara Taq DNA聚合酶0.1μL、10×Buffer(Mg²⁺)2.1μL、dNTP 1.6μL、样品模板1.0μL、引物27F1.0μL和1492R 1.0μL、DNA/RNA free H₂O 13.2μL，共20μL体系；PCR反应程序为：95℃4min；94℃1min，55℃1min，72℃1min共32个循环；72℃10min。1％凝胶电泳验证无目的大小条带如27F-1492R的1465bp，或63F-1387R的1324bp，说明所检测样品为无菌；

7.无菌丰年虫的喂食

根据涂板、摇菌、PCR等检测结果判断，制作成功的无菌丰年虫，可用于喂食无菌斑马鱼、海水青鳉等孵化后的开口期幼鱼，即：在每10mL养有5条无菌组(germ-free,GF)或对照正常养殖组(conventionally raised,CR)的开口期幼鱼中放入5-15只无菌丰年虫，每天喂食1次并作无菌检测，次日换水除去残渣并喂食新制备无菌丰年虫，随幼鱼生长适量增加喂食至成鱼。

二.各组孵化方法对比，获得最优化、简便的无菌丰年虫制作方法

未处理的丰年虫卵和漂洗处理后的丰年虫卵镜检图如图2所示(显微镜拍照放大倍数5×，标尺：500μm)，其中，图2A中为未处理丰年虫休眠卵，干瘪凹陷，表面又杂质薄膜；图2B中为漂洗处理后的虫卵，已吸水激活，凹陷稍凸起，虫卵表面杂质薄膜清洗掉，明显较为洁净。

漂洗处理后丰年虫卵经封口膜摇床法孵化24h后的镜检图如图3所示，其中(A)显微镜拍照放大倍数1×，标尺：2000μm；(B)放大倍数3×，标尺：1000μm。

通过显微镜观察无节幼虫活跃游动、死亡/不动状态，并拍照记录丰年虫孵化无节幼体、挂伞、未孵化虫卵、虫壳等各类特征，统计数量和生长发育指标。

经过孵化率对比，孵化效果(a)蓝盖玻璃瓶封口膜摇床孵化法>(b)蓝盖玻璃瓶封口膜培养箱静置法>(c)一次性培养皿封口培养箱静置法>(d)丰年虫卵TSA平板涂布封口培养箱静置法>(e)丰年虫卵TSB或BHI培养基玻璃管摇床孵化法。

其中，(f)蓝盖玻璃瓶封口磁力搅拌法孵化24h后出现大量絮状沉淀，孵化效率最低，悬液浑浊，不适合无菌丰年虫孵化和制作，最终制作可省去此步骤。

因此，本发明推荐(a)蓝盖玻璃瓶封口膜摇床孵化法作为获得无菌丰年虫的最优化、简便的孵化方法。

实施例2

封口膜摇床孵化法获得的无菌丰年虫做无菌检测

采用实施例1获得的无菌丰年虫，经过检测验证无菌条件，在实施例1的无菌丰年虫制作过程中，采集样品进行无菌检测，无菌检测结果见图4和表1。

图4中，(A)未处理丰年虫卵和处理后丰年虫卵，孵化后无菌丰年虫悬液的TSA平板、血平板、双层板涂板；(B)未处理丰年虫卵和处理后丰年虫卵，孵化后无菌丰年虫悬液的TSB和BHI培养基好氧摇菌、厌氧管培养。对比可知，处理后虫卵在涂板和摇菌中均出现孵化幼体并活跃游动，且涂板和摇菌在丰年虫活体存在下均无菌；无菌丰年虫样本的涂板和液体培养均无菌。

从表1可知，孵化方法(d)丰年虫卵TSA平板涂布封口培养箱静置法和(e)丰年虫卵TSB或BHI培养基玻璃管摇床孵化法，既可做丰年虫卵孵化又可同时做无菌验证，用于制作无菌丰年虫备份，进行少量幼鱼喂食。

表1.无菌丰年虫制作过程中样品采集和无菌检测记录结果统计

实施例3

封口膜摇床孵化法获得的无菌丰年虫的生长发育指标

统计实施例1中(a)蓝盖玻璃瓶封口膜摇床孵化法获得的无菌丰年虫的指标，具体数据如表2所示。处理后丰年虫卵的孵化率较高，均值为88.15％；统计死亡/不动无节幼体和游动幼体，对比总数计算的存活率为77.83％；显微镜视野下孵化幼体的畸形率较低为1.87％；测量后无节幼体的体长为546.70μm；体重指标为3.80mg/100只。

表2.无菌丰年虫的孵化率，存活率，畸形率，体长，体重指标

实施例4

无菌丰年虫的喂食策略

采用实施例1中(a)蓝盖玻璃瓶封口膜摇床孵化法获得的无菌丰年虫进行幼鱼喂食，总结出如下规律：斑马鱼幼鱼在7-10dpf喂食灭菌蛋黄，从11-18dpf开始喂食灭菌蛋黄+无菌丰年虫，观察发现60％幼鱼从11dpf开始进食丰年虫无节幼体，每天喂食1次每次可摄食1-3只丰年虫/每条幼鱼，随生长发育增加喂食量，至幼鱼完全摄食丰年虫(约>21dpf)即可断掉蛋黄全部喂食无菌丰年虫，直至成鱼。

根据饲养无菌鱼和正常鱼的生长特征，及无菌丰年虫在养鱼水体存活状态，每1-2天换液除去剩余食物残渣和粪便等，废液用于无菌检测，同时换新的无菌养鱼水和投喂新制作的无菌丰年虫活体。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学

<120> 一种无菌丰年虫的制作方法及其应用

<130> PYZYK2216126

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 27F

<400> 1

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<211> 21

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<213> Artificial

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<400> 2

acggytacct tgttacgact t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 63F

<400> 3

caggcctaac acatgcaagt c 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 1387R

<400> 4

gggcggwgtg tacaaggc 18

Claims

1.一种无菌丰年虫的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：将丰年虫卵漂洗杀菌处理、灭菌水清洗干净后用筛网过滤，放入灭菌盐水中制成灭菌盐水虫卵混合液，然后进行无菌孵化，获得无菌丰年虫，无菌孵化方法选自以下方式中的任意一种：（a）将灭菌盐水虫卵混合液置于封口膜封口的无菌瓶中，光照条件下在摇床上摇晃孵化；（b）将灭菌盐水虫卵混合液置于封口膜封口的无菌瓶中，避光条件下在培养箱中静置孵化；（c）将灭菌盐水虫卵混合液置于一次性培养皿中，封口后，避光条件下在培养箱中静置孵化；（d）将灭菌盐水虫卵混合液涂布在 TSA 平板上，封口后，避光条件下在培养箱中静置培养；（e）将灭菌盐水虫卵混合液置于盛有 TSB 或 BHI 培养基的无菌容器中，封口后，光照条件下在摇床上摇晃孵化；所述筛网为灭菌超密短把滤网，长 17.5 cm，半径 6.0 cm，孔径 170 目；所述无菌瓶为灭菌处理后的玻璃瓶；孵化温度为 30±2℃，孵化时间为 20-72 h；所述灭菌水选自灭菌超纯水；所述方式（a）、（e）中，摇床转速为 100~200 rpm；所述灭菌盐水的浓度为 2.0%-3.5%，所述灭菌盐水虫卵混合液中，丰年虫卵的用量为 2.5~5.0 g/L。

2.根据权利要求 1 所述的无菌丰年虫的制作方法，其特征在于：所述无菌孵化方法选自（a）、（d）、（e）方式中的任意一种。

3.根据权利要求 1 所述的无菌丰年虫的制作方法，其特征在于：采用次氯酸钠(NaClO) 溶液对丰年虫卵进行漂洗杀菌处理，然后用灭菌水清洗干净；和/或，丰年虫卵漂洗杀菌处理时间为 3~10min。

4.根据权利要求1~3任一项所述的方法在制作无菌丰年虫以及在无菌鱼培育和毒理学检验领域中的应用。

5.一种无菌鱼的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求 1~3 任一项所述的方法制备无菌丰年虫，然后用于喂食幼鱼，培育得到无菌鱼； 2 喂食方法包括如下步骤：幼鱼在 7-10 dpf 喂食灭菌蛋黄，从 11-18 dpf 开始喂食灭菌蛋黄和无菌丰年虫，每天喂食 1 次，每次可摄食 1~3 只丰年虫/每条鱼，根据生长发育逐步增加喂食量，至幼鱼完成摄食丰年虫即可断掉蛋黄，全部喂食无菌丰年虫，直至成鱼。

6.根据权利要求 5 所述的无菌鱼的培育方法，其特征在于：选取活跃游动的无菌丰年虫制成无菌丰年虫悬液，用于喂食幼鱼。

7.根据权利要求 5 所述的无菌鱼的培育方法，其特征在于：所述鱼包括淡水鱼和海水鱼。