CN111149730A - 一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法，包括如下步骤：首先，采用多能干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog和Gdf3中的任意一种或几种作为标记基因，获得多能干细胞荧光标记的嵌合体斑马鱼；然后，采用灭活的红鲫精子激活所述的嵌合体斑马鱼卵子，再通过热休克抑制胚胎第一次卵裂，即获得所述的多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。本发明的方法可以快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体，相较于传统通过测交再自交(需历经至少3代)得到纯合转基因斑马鱼的方法，本发明的操作更简单，更快速，成本更低，具有重要的科学价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法。
背景技术
1998年，Nichols等首次发现Oct4基因在小鼠囊胚内细胞团中表达，基因敲除实验表明Oct4对于维持细胞团和胚胎干细胞多能性极为关键。在大多数脊椎动物中，Oct4在早期胚胎的多能性细胞中表达，直至囊胚期，而后在生殖系干细胞中持续表达，直至成年。OCT4蛋白在斑马鱼胚胎中既有母源型表达，又有合子型表达，OCT4不但可以调控多个维持自我更新、多能性、多向分化相关基因的表达，还参与到信号转导、表观遗传调控等多个过程，是复杂、精密而又精巧的调控网络中的核心调控因子。鉴于Oct4基因功能的重要性，建立Oct4基因荧光标记鱼在鱼类发育生物学、生殖干细胞生物学、诱导多能性干细胞等研究中获得广泛的应用。
与许多转基因高等生物一样，目前受精卵显微注射方法研制的转基因鱼均为转植基因嵌合体，培育纯合转基因鱼已成为研究者们追求的目标。传统方法培育荧光转基因鱼纯合个体通常采用F0代与野生型测交得到F1代杂合个体，筛选出具有荧光的F1代雌雄个体进行自交，自交后代(F2)性成熟后再与野生型测交，若F3代均有荧光的可确定其对应亲本(F2)为纯合个体。然而，此方法筛选转基因纯合个体需工作量大，且耗时长(历经3代)。如何快速得到多能干细胞荧光标记的纯合转基因鱼，对本领域来说具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，利用雌核发育方法，提供一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法，包括如下步骤：首先，采用多能干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog和Gdf3中的任意一种或几种作为标记基因，获得多能干细胞荧光标记的嵌合体斑马鱼；然后，采用灭活的红鲫精子激活所述的嵌合体斑马鱼卵子，再通过热休克抑制胚胎第一次卵裂，即获得所述的多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。
上述的方法，优选的，具体包括如下步骤：
(1)克隆斑马鱼的标记基因启动子区域片段，并将其连接到带有Tol2转座子以及荧光蛋白基因EGFP序列的PBLK质粒上，构成PBLK-标记基因-EGFP质粒；
(2)通过显微注射处理，将含有PBLK-标记基因-EGFP质粒和转座酶mRNA的混合液注入处于一细胞期的AB品系斑马鱼胚胎，然后进行静水孵化，待胚胎发育至囊胚期，筛选出发绿色荧光的F0代胚胎，待其孵化成鱼苗后进行单独培养，获得多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代(即嵌合体斑马鱼)；
(3)以已达性成熟的雌性多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代为母本，与经紫外线灭活的红鲫精子进行假受精，得到的受精卵经热休克处理后，进行静水培养，待胚胎发育至囊胚期，筛选出发绿色荧光的F1代胚胎继续培养，获得所述的多能干细胞荧光标记的斑马鱼纯合个体。
上述的方法，优选的，所述步骤(1)中，所述斑马鱼的标记基因具体为斑马鱼Oct4基因，其启动子区域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，序列长度为2995bp；采用PCR方法克隆斑马鱼Oct4基因启动子区域片段，其采用的克隆引物包括正向引物Oct4-F和反向引物Oct4-R，所述正向引物Oct4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物Oct4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述PBLK-标记基因-EGFP质粒具体为PBLK-Oct4-EGFP质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
优选的，所述步骤(1)中，所述PBLK-标记基因-EGFP质粒的构建过程具体包括如下步骤：选用带有Tol2转座子以及荧光蛋白基因EGFP序列的PBLK质粒，经BamHI和XbaI两种限制酶酶切PBLK质粒后，把所述斑马鱼的标记基因启动子区域片段连接到PBLK质粒骨架上，即得到所述PBLK-标记基因-EGFP质粒。
优选的，所述步骤(2)中，所述AB品系斑马鱼胚胎由雄性斑马鱼与雌性斑马鱼经过人工催产、人工授精后得到；所述混合液是由浓度为200ng/μL的PBLK-标记基因-EGFP质粒、浓度为2000ng/μL的转座酶mRNA和DEPC水按照1:2:7的体积比例制成，每枚胚胎注入所述混合液0.01-0.03μL。
优选的，所述步骤(2)中，所述静水孵化是在E3培养液中进行，所述E3培养液由以下方法配制得到：每10L去离子水中加入2.9gNaCl、0.13gKCl、0.36gCaCl2和0.6g MgSO4·6H2O，灭菌后再加入20μL0.03M亚甲基蓝，即得到所述E3培养液。
优选的，所述步骤(2)中，所述单独培养具体包括如下步骤：将鱼苗转入27-29℃的水中进行恒温培养，鱼苗孵出满3-5天后开始投喂草履虫，鱼苗孵出满15-20天后改投喂丰年虫直至成年。
优选的，所述步骤(2)中，所述多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代通过PCR分子检测法和/或生殖细胞组织学鉴定法进行鉴定；
所述PCR分子检测法的具体操作包括如下步骤：待筛选出的发绿色荧光的F0代胚胎发育至肌效期前后荧光逐渐消褪后，剪取斑马鱼尾鳍，提取其DNA，通过PCR法检测其是否含有EGFP基因序列；采用的检测引物包括正向引物EGFP-F和反向引物EGFP-R，所述正向引物EGFP-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物EGFP-R的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；
所述生殖细胞组织学鉴定法的具体操作包括如下步骤：提取成鱼性腺组织包埋后进行冰冻切片，或待雌鱼催青后进行挤卵，在荧光显微镜下观察其生殖细胞中是否有荧光。
优选的，所述步骤(3)中，所述假受精的具体操作包括如下步骤：选择已达性成熟的雌性多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代和雄性红鲫进行人工催产，获取多能干细胞荧光标记的斑马鱼卵子和红鲫精液；将红鲫精液用Hank’s液按体积比1:100稀释，取2-5mL稀释后的红鲫精液平铺于玻璃培养皿中，置于15W紫外灯下10-15cm处的摇床上，摇床转速60-100rpm，避光照射2-2.5min，完成精子灭活；然后将所述多能干细胞荧光标记的斑马鱼卵子与灭活后得到的红鲫精子进行人工授精。
优选的，所述步骤(3)中，将得到的受精卵在28.5℃下培养22min后，进行41.4℃热休克处理2min，而后置于培养皿中在28.5℃下静水培养。
优选的，所述步骤(3)中，所述多能干细胞荧光标记的斑马鱼纯合个体通过以下方法进行鉴定：提取多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的gDNA作为模板，分别以AB品系斑马鱼和红鲫作为对照，通过Sox-HMG分子标记引物进行PCR分析检测其是否为雌核发育鱼，若为雌核发育鱼则鉴定为多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。
更优选的，所述Sox-HMG分子标记引物包括正向引物Sox-F和反向引物Sox-R，所述正向引物Sox-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述反向引物Sox-R的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。
本发明利用雌核发育技术获得多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的原理如下：
首先，采用多能干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog和Gdf3中的任意一种或几种作为标记基因(更优选Oct4基因)，获得多能干细胞荧光标记的嵌合体斑马鱼。然后，采用灭活的红鲫精子激活嵌合体斑马鱼卵子，再通过热休克抑制胚胎第一次卵裂，获得纯合个体，而斑马鱼与红鲫的杂交后代不能存活，所以存活的斑马鱼个体是纯合体。最后，采用Sox-HMG分子标记引物PCR法证实雌核发育后代不是斑马鱼和红鲫杂交后代，进一步确定雌核发育后代是纯合个体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过构建PBLK-标记基因-EGFP质粒来实时示踪多能干细胞；然后在胚胎发育至一细胞时期进行显微注射，得到嵌合体F0代；再通过雌核发育方法，在F1代成功得到多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。相较于传统通过测交再自交(需历经至少3代)得到纯合转基因斑马鱼的方法，本发明的操作更简单，更快速，成本更低，具有重要的科学价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是重组PBLK-Oct4-EGFP质粒图谱；
图2是多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代的建立；
图3是多能干细胞荧光标记斑马鱼雌核发育F1代纯合体的建立；
图4是斑马鱼F1代纯合体的多能干细胞荧光标记示踪；
图5是斑马鱼F1代纯合体的分子鉴定。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法，包括如下步骤：
(1)构建PBLK-Oct4-EGFP质粒：首先设计引物(引物序列为Oct4-F：CATTGACTGCCCTCACTC，如SEQ ID NO：1所示；Oct4-R：CCTTGCAAATCGTTCG，如SEQ ID NO：2所示)，然后采用常规PCR方法克隆斑马鱼Oct4基因启动子区域片段(核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示，长度为2995bp)，选用带有Tol2转座子以及荧光蛋白基因EGFP序列的PBLK质粒骨架，经BamHI和XbaI两种限制酶酶切PBLK质粒后，把Oct-4基因启动子区域片段连接到PBLK质粒骨架上，构建成PBLK-Oct4-EGFP质粒(如图1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)；
(2)斑马鱼催产：将挑选的AB品系斑马鱼亲鱼按照雄性与雌性2:1的数量比例放入孵化盒中，进行暗处理12h，然后光照25min，完成人工催产；
(3)人工授精：为保证胚胎处于相同的发育阶段，取人工催产后得到的雄性斑马鱼，挤出精液，按精液与Hank’s液体积比1:100的比例稀释，置于冰上备用；取所述人工催产后得到的顺利产卵的雌性斑马鱼，挤出卵子，用含有精液的Hank’s液覆盖在卵子上，加水搅动混匀，完成人工授精，得到AB品系斑马鱼胚胎；
(4)显微注射：待AB品系斑马鱼胚胎发育至一细胞时期，将200ng/μLPBLK-Oct4-EGFP质粒、2000ng/μL转座酶mRNA、DEPC水(用DEPC(diethyl pyrocarbonate，碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水)按照1:2:7的体积比例制备混合液，每枚胚胎注入混合液约0.02μL；
(5)筛选F0代胚胎：显微注射过的F0代置于E3培养液(每10L去离子水中加入2.9gNaCl、0.13gKCl、0.36gCaCl2、0.6gMgSO4·6H2O，灭菌后再加入20μL0.03M亚甲基蓝)中静水孵化，发育至囊胚期时，在荧光体式显微镜下筛选出发绿色荧光的F0代胚胎，胚胎孵化后，将鱼苗转入27-29℃的水中进行恒温培养，鱼苗孵出满3-5天后开始投喂草履虫，鱼苗孵出满15-20天后改投喂丰年虫直至成年，获得多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代(如图2所示)；
(6)F0代PCR分子检测：所有筛选出来的发绿色荧光的F0代胚胎发育至肌效期前后荧光逐渐消褪后，鱼苗剪尾鳍，常规试剂盒提取DNA，根据EGFP基因序列设计引物(引物序列为：EGFP-F：GGCAAGCTGACCCTGAAGTT，如SEQ ID NO：3所示；EGFP-R：GGTCTTGTAGTTGCCGTCGT，如SEQ ID NO：4所示)，通过常规PCR法检测是否有EGFP基因；
(7)生殖细胞组织学鉴定：雌性转基因斑马鱼人工催产后，挤卵进行观察，或直接取性腺组织包埋后进行冰冻切片观察，在荧光体式显微镜下观察其生殖细胞中是否有荧光表达(如图3所示)；
(8)人工催产：将已达性成熟的多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代按照雄性与雌性2:1的数量比例放入孵化盒中，进行暗处理10-14h，然后光照20-30min，完成对雌性多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代的人工催产；对父本亲鱼红鲫注射促黄体素释放激素类似物与人绒毛膜促性腺激素的混合催产剂，其中，促黄体素释放激素类似物的量为7-8ug/kg，人绒毛膜促性腺激素的量为325-400IU/kg，完成对雄性红鲫的人工催产；
(9)精子灭活：取人工催产后得到的雄性红鲫，挤出精液用Hank’s液按体积比1:100稀释，取2-5mL稀释的红鲫精液平铺于10cm的玻璃培养皿中，置于15w的紫外灯下10-15cm处的摇床上，摇床转速60-100rpm，避光照射2-2.5min，完成精子灭活；
(10)雌核发育：将灭活的红鲫精子与斑马鱼F0代的鱼卵进行人工授精(假受精)，得到的“受精卵”在28.5℃下培养2min后，41.4℃热休克处理2min，而后置于培养皿中28.5℃下静水培养；
(11)筛选F1代胚胎：待胚胎发育至囊胚期，在荧光体式显微镜下筛选出发绿色荧光的F1代胚胎，阳性胚胎在28.5℃下继续培养，得到的雌核发育斑马鱼F1代即为获得Oct4基因荧光标记斑马鱼纯合个体(如图4所示)；
(12)分子生物学鉴定：提取雌核发育斑马鱼F1代的尾鳍gDNA作为模板，分别以AB品系斑马鱼和红鲫作为对照，Sox-HMG分子标记引物进行PCR分析，鉴别获得的雌核发育斑马鱼F1代均为多能干细胞荧光标记斑马鱼，即表示只要检测F1代是否为雌核发育鱼，若为雌核发育鱼则鉴定为多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。
gDNA的提取方法：将多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的尾鳍置于1.5mL的EP管中，向EP管中加入20μL50nMNaOH，95℃处理30min，在往管中加入2μL的Tris-HCl(pH：8.0)，完成gDNA提取。
PCR方法：往200μL的EP管中加入提取的模板gDNA1μL，2×tap酶5μL，正向和反向Sox-HMG分子标记引物(引物序列为：Sox-F：TGAAGCGACCCATGAA(C/G)G，如SEQ ID NO：5所示；Sox-R：AGGTCG(A/G)TACTT(A/G)TA(A/G)T，如SEQ ID NO：6所示)各1μL，DEPC water2μL，在PCR仪中按照程序，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；取5μLPCR产物，加入到置于电泳槽中的1.5％小孔琼脂糖凝胶中，以功率50W进行电泳10-15min，观察结果。
如图5所示结果分析：Sox-HMG引物在红鲫中可扩增出分子量为250bp、700bp、1700bp三个条带，而雌核发育斑马鱼F1代和AB品系斑马鱼均只扩增得到一条250bp左右条带。
本发明通过反复实验，多次成功制备出多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。目前通过雌核发育快速建立多能干细胞荧光标记斑马鱼纯系的方法还未见报道，本发明的方法，在通过构建PBLK-Oct4-EGFP质粒的基础上，利用雌核发育技术在F1代成功得到多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。打破了传统通过测交再自交(需历经至少3代)得到纯合转基因斑马鱼的方法，具有重要的科学价值，也为得到纯合转基因鱼提供了一种快速有效的方法。
本实施例的方法同样适用于多能干细胞标记基因Sox2、Nanog和Gdf3荧光标记斑马鱼纯合个体，原理及操作步骤与本实施例相同。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cattgactgc cctcactc 18
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttgcaaat cgttcg 16
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcaagctga ccctgaagtt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtcttgtag ttgccgtcgt 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaagcgacc catgaasg 18
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggtcgrtac ttrtart 17
<210> 7
<211> 2995
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Barchydanio rerio var)
<400> 7
cattgactgc cctcactcaa atgcatgtct ggttatttct agaacagact ttggcctggt 60
cggtgaaact tacaagcagt gtttgtttca gagtaggagg aggaggggga caggggcgga 120
atcaaaggct tgcggcttat tgttcggttc tgaaaggcag ctaatggccg gccatcgcta 180
ctctggatct ggaagcgacg gggggcctcg ggctcttctg gcacaaagcc tccccctcca 240
ctttcctgcg gcgcgtcttc ctgctgcaat ctgcaccgat cggcccggtc gggggtgcac 300
agctgtatcg atgcgtctcg tggagctcct acaactgtaa acaaggcgca ttgaaagaaa 360
aaaaggagca agcacgctaa ctggtcccga ctggctatgg cctatgcaaa tagcctttat 420
ttaaaatgta cactgtaaaa cagtggtttc aacttaaatg taggtaaata atgactattt 480
tagcctaatt ataggcataa tccaaacatc tcaaactcaa tgttcgctga ttgttcaaac 540
tactacttta aaatgagctg aaacaacacg tttctttagg gtttttaggg gacaacttaa 600
ttaatttttc ttcaatccga ttaaatttgt gaaaactaat taattccttc atgtttgacc 660
aacacaaacc gattgtgtga aaatcagcat tttaaacaga tgatttggat gatccactga 720
aaaaatcttc aaagatgata tcttggattt accaaattat tttaagttaa gtgctggtaa 780
aaatttattt gggctgaatt taaacaaaca cattaagttt aacattacta tatttatttt 840
aattttaact aaatctgagc aaattcaaca cgtataaatt gtttgcaaca attttgaaaa 900
attagatctc tataaaatgt atgcttatgc atattcaaaa aaaaactgaa aataaggtaa 960
taaagataat ttatttatct tgttttattg attgtcttgt gtagctatta caacctatga 1020
taggcctatt agcatctcct gctaaattct tatttagctc gtccactaca ttatttcttc 1080
tttataatag cctaaatgaa aaaataaata aaaatcagat taattgtggt tttaatagaa 1140
cgaatagata aagtttttgt aaactttaca cattttctaa atcagaaaat acatcattca 1200
tttattttac atgtttgtgc aattggcttt gttgtgtcct atgattaaaa aaaaacaaac 1260
aaacactgaa cattacatca tgaaatttga ttacatttta ttaaatctat taatttataa 1320
ttgaatgtac actgaaaaaa taagtctgca aaattgttgc actttatgtg ttgaatttaa 1380
acaaatgaat aaattttata ttgttcaact taatttgttt gtttaaattc aacccaaaat 1440
aattgtttac aaccacttaa cttaaaaaaa atccacgtaa tcatcgttga ataatggtgc 1500
actttaaaga atccataaaa ttggatccca ttatgctgta tacatataaa ggaattttct 1560
gttttgtgtt aaacagaatg ctgtatatat attgattcaa ccttttatat atagttttta 1620
aggatgtttt atatgtattt tcattttgta ttgcatgctg tcttctggga tttgcagcca 1680
aattcaccaa tttgcaagca attttatttt ggcatgtaaa atggtttgat ttatttttca 1740
gtattttctt tctcactgat aaatttacat tagaacttaa gttttccaca tcacagcatt 1800
gttctcttta ttttccaaac actcttgcgt gtataaacgg ctcctatcag cgattcaaca 1860
agcagcgtga aggtgggaga tgtgacgctt gtaatccaat tgcttatcag caacagacaa 1920
acatttcacc ttttatttgt cactcctggt caaaaagaac agcaaaaatg caagtgaaag 1980
catttagatc tactgtactt ttttcctgat ccactttgtt taatagctta taggcttcat 2040
ttaataaaat ctaaatgtgg aaaagtgagt tttcccgttg cgcatattgc ataagtgttt 2100
tcccacggat gtcaagaatt ttaatatcaa ggacagctca ttaagtacat attactgaaa 2160
caaagtttac ataatgtggc atgaatataa aatacatgaa tttgcattgt aaatactcga 2220
aatatgcata agagggcagg aatgacaaaa tgacggtgat tgttatgcat ttttatattc 2280
gtttttaaag aggttagtga ggttaatcta tttttatttg gacttttata agatgcaaat 2340
ctatacagat acacctcgcg ttcccaaaca tgtcctcgcc caatgagaaa accaagttca 2400
ttcacaaatt cacagtcagc tgtagcttat tgtctcgggt ggccaatggg agagaagttg 2460
gttcagaccc ctgcctccaa ctccgattga ttagcaaaac ctgtgtgggc caggatcaga 2520
gctgagattg ggaagagttg gaggtggtga attattggcc cattctgatt gatggccgcc 2580
acacaaggac tgcgcacatt tccacacagg ctgatactga gacgcgcaat ctgagtttag 2640
tctgtttgga tcatcctggg atggagcaac tgatcgacgt ttattgatta tcaaaccagc 2700
agtctttacg ctttcttgtt tgaaatctca acaacctttt tagcggaaag atgacggaga 2760
gagcgcagag cccaacagca gcagactgca gaccctatga ggtcaacagg gccatgtatc 2820
ctcaagccgc gggcctggat ggacttggcg gagcgtcctt gcagtttgcg cacggtatgc 2880
ttcaggatcc aagtctgatt tttaacaagg cccatttcaa cggaatcacc cccgcgacag 2940
cccagacctt ctttccattt tcaggcgatt ttaaaacgaa cgatttgcaa ggtgg 2995
<210> 8
<211> 4267
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccca 660
gaggtgtaaa gtacttgagt aattttactt gattactgta cttaagtatt atttttgggg 720
atttttactt tacttgagta caattaaaaa tcaatacttt tacttttact taattacatt 780
tttttagaaa aaaaagtact ttttactcct tacaatttta tttacagtca aaaagtactt 840
attttttgga gatcacttgg gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgatatc 900
gaattcctgc agcccggggg atccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 960
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 1020
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 1080
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 1140
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 1200
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 1260
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 1320
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 1380
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 1440
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 1500
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 1560
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 1620
ggcatggacg agctgtacaa gtaaagcggc cgcgactcta gatcataatc agccatacca 1680
catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac 1740
ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 1800
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 1860
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc tagagcggcc gccaccgcgg aatactcaag 1920
tacaatttta atggagtact tttttacttt tactcaagta agattctagc cagatacttt 1980
tacttttaat tgagtaaaat tttccctaag tacttgtact ttcacttgag taaaattttt 2040
gagtactttt tacacctctg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg 2100
cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 2160
ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 2220
taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 2280
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 2340
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 2400
gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 2460
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 2520
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 2580
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 2640
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 2700
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 2760
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 2820
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 2880
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 2940
aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 3000
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 3060
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 3120
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 3180
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 3240
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 3300
gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 3360
tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 3420
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 3480
cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 3540
gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 3600
atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 3660
aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 3720
atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 3780
aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 3840
aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 3900
gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 3960
gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 4020
gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 4080
ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 4140
ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 4200
atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 4260
gtgccac 4267
Claims (10)
1.一种快速培育多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的方法，其特征在于，包括如下步骤：首先，采用多能干细胞标记基因Oct4、Sox2、Nanog和Gdf3中的任意一种或几种作为标记基因，获得多能干细胞荧光标记的嵌合体斑马鱼；然后，采用灭活的红鲫精子激活所述的嵌合体斑马鱼卵子，再通过热休克抑制胚胎第一次卵裂，即获得所述的多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)克隆斑马鱼的标记基因启动子区域片段，并将其连接到带有Tol2转座子以及荧光蛋白基因EGFP序列的PBLK质粒上，构建成PBLK-标记基因-EGFP质粒；
(2)通过显微注射处理，将含有PBLK-标记基因-EGFP质粒和转座酶mRNA的混合液注入处于一细胞期的AB品系斑马鱼胚胎，然后进行静水孵化，待胚胎发育至囊胚期，筛选出发绿色荧光的F0代胚胎，待其孵化成鱼苗后进行单独培养，获得多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代；
(3)以已达性成熟的雌性多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代为母本，与经紫外线灭活的红鲫精子进行假受精，得到的受精卵经热休克处理后，进行静水培养，待胚胎发育至囊胚期，筛选出发绿色荧光的F1代胚胎继续培养，获得所述的多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述斑马鱼的标记基因具体为斑马鱼Oct4基因，其启动子区域片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；采用PCR方法克隆斑马鱼Oct4基因启动子区域片段，其采用的克隆引物包括正向引物Oct4-F和反向引物Oct4-R，所述正向引物Oct4-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物Oct4-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述PBLK-标记基因-EGFP质粒具体为PBLK-Oct4-EGFP质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述PBLK-标记基因-EGFP质粒的构建过程具体包括如下步骤：选用带有Tol2转座子以及荧光蛋白基因EGFP序列的PBLK质粒，经BamHI和XbaI两种限制酶酶切PBLK质粒后，把所述斑马鱼的标记基因启动子区域片段连接到PBLK质粒骨架上，即得到所述PBLK-标记基因-EGFP质粒。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述AB品系斑马鱼胚胎由雄性斑马鱼与雌性斑马鱼经过人工催产、人工授精后得到；所述混合液是由浓度为200ng/μL的PBLK-标记基因-EGFP质粒、浓度为2000ng/μL的转座酶mRNA和DEPC水按照1:2:7的体积比例制成，每枚胚胎注入所述混合液0.01-0.03μL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述静水孵化是在E3培养液中进行，所述E3培养液由以下方法配制得到：每10L去离子水中加入2.9g NaCl、0.13gKCl、0.36g CaCl2和0.6g MgSO4·6H2O，灭菌后再加入20μL 0.03M亚甲基蓝，即得到所述E3培养液；
所述单独培养具体包括如下步骤：将鱼苗转入27-29℃的水中进行恒温培养，鱼苗孵出满3-5天后开始投喂草履虫，鱼苗孵出满15-20天后改投喂丰年虫直至成年。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代通过PCR分子检测法和/或生殖细胞组织学鉴定法进行鉴定；
所述PCR分子检测法的具体操作包括如下步骤：待筛选出的发绿色荧光的F0代胚胎发育至肌效期前后荧光逐渐消褪后，剪取斑马鱼尾鳍，提取其DNA，通过PCR法检测其是否含有EGFP基因序列，采用的检测引物包括正向引物EGFP-F和反向引物EGFP-R，所述正向引物EGFP-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物EGFP-R的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；
所述生殖细胞组织学鉴定法的具体操作包括如下步骤：提取成鱼性腺组织包埋后进行冰冻切片，或待雌鱼催青后进行挤卵，在荧光显微镜下观察其生殖细胞中是否有荧光。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述假受精的具体操作包括如下步骤：选择已达性成熟的雌性多能干细胞荧光标记的斑马鱼F0代和雄性红鲫进行人工催产，获取多能干细胞荧光标记的斑马鱼卵子和红鲫精液；将红鲫精液用Hank’s液按体积比1:100稀释，取2-5mL稀释后的红鲫精液平铺于玻璃培养皿中，置于15W紫外灯下10-15cm处的摇床上，摇床转速60-100rpm，避光照射2-2.5min，完成精子灭活；然后将所述多能干细胞荧光标记的斑马鱼卵子与灭活后的红鲫精子进行人工授精。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将得到的受精卵在28.5℃下培养22min后，然后41.4℃热休克处理2min，而后置于培养皿中在28.5℃下静水培养。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体通过以下方法进行鉴定：提取多能干细胞荧光标记斑马鱼纯合个体的gDNA作为模板，分别以AB品系斑马鱼和红鲫作为对照，通过Sox-HMG分子标记引物进行PCR分析检测其是否为雌核发育鱼，若为雌核发育鱼则鉴定为多能干细胞荧光标记的斑马鱼纯合个体；
所述Sox-HMG分子标记引物包括正向引物Sox-F和反向引物Sox-R，所述正向引物Sox-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述反向引物Sox-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114680083A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-07-01 | 重庆医科大学 | 一种无菌丰年虫的制作方法及其应用 |
| CN117898229A (zh) * | 2024-03-19 | 2024-04-19 | 三亚热带水产研究院 | 一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 |
| CN117958186A (zh) * | 2024-04-01 | 2024-05-03 | 水利部交通运输部国家能源局南京水利科学研究院 | 鱼类全生活史生境需求的生态流量过程水温过程确定方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1939299A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-02 | Universität des Saarlandes | Trpm4-deficient transgenic mammals and use thereof |
| CN103430872A (zh) * | 2013-08-05 | 2013-12-11 | 集美大学 | 黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法 |
| CN103589801A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-19 | 湖南师范大学 | 可在鉴别不同鱼类的方法中进行应用的特异引物序列及鉴别不同鱼类的dna分子标记方法 |
| CN106434748A (zh) * | 2016-07-29 | 2017-02-22 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 一种热激诱导型 Cas9 酶转基因斑马鱼的研制及应用 |
| CN107988246A (zh) * | 2018-01-05 | 2018-05-04 | 汕头大学医学院 | 一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型 |
| KR20190042152A (ko) * | 2017-10-16 | 2019-04-24 | 전남대학교산학협력단 | 소 락토페린 발현을 위한 넉-인 벡터 및 이를 이용한 넉-인 방법 |
| CN110178757A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-08-30 | 广东医科大学附属医院 | 一种斑马鱼脑创伤模型及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-12-25 CN CN201911358182.9A patent/CN111149730B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1939299A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-02 | Universität des Saarlandes | Trpm4-deficient transgenic mammals and use thereof |
| CN103430872A (zh) * | 2013-08-05 | 2013-12-11 | 集美大学 | 黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法 |
| CN103589801A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-19 | 湖南师范大学 | 可在鉴别不同鱼类的方法中进行应用的特异引物序列及鉴别不同鱼类的dna分子标记方法 |
| CN106434748A (zh) * | 2016-07-29 | 2017-02-22 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 一种热激诱导型 Cas9 酶转基因斑马鱼的研制及应用 |
| KR20190042152A (ko) * | 2017-10-16 | 2019-04-24 | 전남대학교산학협력단 | 소 락토페린 발현을 위한 넉-인 벡터 및 이를 이용한 넉-인 방법 |
| CN107988246A (zh) * | 2018-01-05 | 2018-05-04 | 汕头大学医学院 | 一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型 |
| CN110178757A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-08-30 | 广东医科大学附属医院 | 一种斑马鱼脑创伤模型及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 龙敏笛: "用于水环境重金属污染检测的转基因斑马鱼构建", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114680083A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-07-01 | 重庆医科大学 | 一种无菌丰年虫的制作方法及其应用 |
| CN114680083B (zh) * | 2022-05-05 | 2023-05-16 | 重庆医科大学 | 一种无菌丰年虫的制作方法及其应用 |
| CN117898229A (zh) * | 2024-03-19 | 2024-04-19 | 三亚热带水产研究院 | 一种华贵栉孔扇贝人工受精方法 |
| CN117958186A (zh) * | 2024-04-01 | 2024-05-03 | 水利部交通运输部国家能源局南京水利科学研究院 | 鱼类全生活史生境需求的生态流量过程水温过程确定方法 |
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| Publication number | Publication date |
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