CN103430872A - 黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其技术方案要点包括黄姑鱼精子的遗传失活和卵子的二倍体化；主要途径首先用紫外线照射黄姑鱼精液使精子遗传失活，然后与黄姑鱼卵子混合后，用海水激活，启动黄姑鱼卵子的雌核发育，再用冷休克抑制第二极体排放，使卵子的染色体组加倍，诱导出黄姑鱼雌核发育二倍体。本发明具有操作简单、所需成本较低、实用性较强等优点。

Description

黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法

技术领域

本发明属于水产养殖科学技术领域，涉及一种鱼类雌核发育诱导方法，是用遗传失活的黄姑鱼（Nibea albiflora）精子诱导鱼类卵子雌核发育，特别是涉及一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法。

背景技术

雌核发育是指卵子只依靠本身的遗传物质发育成为个体的现象，它需要同种或异种精子进入卵内，但这些精子只起激动作用并不参与发育，胚胎发育完全是在雌核的控制之下进行的，因此得到的后裔全部是母性性状，基因型与母本相同或略有差异。人工诱导雌核发育是加速鱼类优良基因纯合化、使优良的遗传性状得以迅速固定，从而实现快速育种的最有效方法之一，同时也是进行鱼类遗传分析与性别控制的有效辅助手段；已经被广泛应用于国内外许多种鱼类遗传育种的研究与实践。例如王志勇等已经利用雌核发育技术培育出遗传纯合度很高的大黄鱼品系，并用于良种选育，培育出大黄鱼“闽优1号”新品种；通过诱导雌核发育大黄鱼性反转产生生理性雄鱼，再与雌鱼配组繁殖，培育出遗传全雌大黄鱼，也已应用到生产实践。刘海金等利用雌核发育技术培育出性状优良的雌核发育系，通过性反转与未反转的雌核发育系杂交配组，培育出生产性能优越的新品种牙鲆“北鲆1号”，取得了良好的经济和社会效益。

黄姑鱼是我国一种重要的海水养殖鱼类，而且其雌性生长明显优于雄性，通过人工诱导黄姑鱼雌核发育可产生只具有母本基因的全雌群体，在其遗传与育种研究中具有重要而广泛的应用价值。然而，目前黄姑鱼人工雌核发育的研究尚属空白。尽管目前国内外已经有很多种鱼类人工雌核发育诱导技术的报道，但是，不同的物种所需要采用的精子稀释液、精子遗传灭活所需要的紫外线等的照射剂量、诱导雌核发育单倍体染色体组二倍化开始处理时间、持续时间等往往也有很大差异，因此需要针对每一个物种进行一系列实验摸索进行确定。本发明针对黄姑鱼的生理和繁殖特性，采用权利要求书中所述的方法和步骤，能够成功诱导出黄姑鱼雌核发育二倍体，用于遗传育种研究与实践，其特点是方法简单，成本低，实用性强，而且可以避免采用异源精子（即不同物种的精子）诱导所可能导致的不同物种基因污染黄姑鱼基因库的问题（黄姑鱼的养殖方式是海区网箱养殖或滩涂池塘养殖，在养殖过程中不可避免会产生养殖个体逃逸进入自然海区，如果雌核发育黄姑鱼带有异源精子的遗传物质，将难以避免对分布于自然海区的黄姑鱼种群造成基因污染）。本发明在黄姑鱼良种培育和遗传学研究上将发挥出重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、成本较低、实用性较强，可以避免不同物种基因污染的黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，用于黄姑鱼良种选育和相关的遗传学研究。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为： 

本发明是一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，它包括以下步骤：

1) 黄姑鱼精子的遗传失活：取黄姑鱼精液经精子稀释液稀释20-30倍后，调整厚度至0.5-1 mm，置于紫外灯下照射，紫外线照射剂量为200-300mw/cm²；

2) 卵子雌核发育的启动：取黄姑鱼卵子与经步骤1)遗传失活的黄姑鱼精液混合后，加入室温海水，启动黄姑鱼卵子的雌核发育；

3) 卵子染色体组加倍：通过冷休克处理抑制第二极体排放，诱导黄姑鱼卵子的雌核发育单倍体的染色体组加倍成为雌核发育二倍体。

步骤1）中所说的精子稀释液的配制方法为：NaCl 7.896g、KCl 0.396g、MgSO₄·7H₂O 0.195g、Na₂HPO₄·7H₂O 0.054g、KH₂PO₄ 0.054g、NaHCO₃ 0.305g、C₆H₁₂O₆ 0.99g，加水定容至1L。

步骤2）中遗传失活黄姑鱼精液与黄姑鱼卵子的比例为1mL：2-20g。

在步骤3）中所说的冷休克处理中抑制第二极体排放方法是：黄姑鱼卵子启动后1-5min，转移到0-6℃海水中，静置5-20min，再转移到室温海水中孵化。

由于本发明首先用紫外线照射黄姑鱼精液，失活黄姑鱼精子的遗传物质，因此卵子只能依靠自身遗传物质控制个体发育，从而可以大大提高和加速基因纯合效率；卵子发育启动后再用冷休克抑制第二极体排放诱导卵子染色体组加倍产生雌核发育二倍体，可以使胚胎克服单倍体综合症的影响，恢复正常发育，形成具有正常发育生长能力的个体；利用紫外线照射精子和用冷休克处理诱导卵子染色体加倍的方法简单易行、成本低廉、干净无污染，采用黄姑鱼精子而不采用异源精子，同一个物种雌雄鱼成熟期相同，可以在获得黄姑鱼成熟卵子的同时方便地从同一个养殖群体中取得成熟雄鱼、获取成熟的精子，避免寻找成熟期相同的异种鱼类的精子的麻烦，操作方便，并且可以有效避免异源精子基因的掺入造成基因污染，因此同时具有多方面的优点。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

本发明是一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，它包括以下步骤：

1、黄姑鱼精子的遗传失活。取黄姑鱼精液经稀释液稀释20-30倍后，吸取3mL于直径9cm的培养皿中，使精液厚度约为0.5-1 mm；然后将培养皿置于盛有碎冰且表面水平的托盘上，再将托盘放在转速为110 r/min的摇床上；用2支平行安放的30W紫外灯作为光源进行照射（波长为254 nm），照射距离为40cm， UV-C强度为3800μw/（cm²·s），照射时间为50-70s。

2. 卵子雌核发育的启动。取120g黄姑鱼卵子，加入15 mL步骤1所说的遗传失活的黄姑鱼精液混匀，加入24±0.5℃的海水，启动黄姑鱼卵子雌核发育，并开始计时。

3. 卵子染色体组加倍。步骤2所计时间至2min时，将步骤2所得的黄姑鱼已启动发育卵子转移到4℃的海水中，静置10min，后转移到20-26℃海水中充气至孵出仔鱼。仔鱼孵出后，可按常规黄姑鱼育苗方法进行鱼苗培育和养殖。

在步骤1中稀释液的配制方法为：NaCl 7.896g、KCl 0.396g、MgSO₄·7H₂O 0.195g、Na₂HPO₄·7H₂O 0.054g、KH₂PO₄ 0.054g、NaHCO₃ 0.305g、C₆H₁₂O₆ 0.99g，加水定容至1L。

本发明获得的雌核发育二倍体的鉴定：

仔鱼孵出后，取样经倍性分析仪分析（检测染色体倍性，也可以通过染色体制片等其它通用检测方法）和微卫星标记分析，结果表明，所检测的子代都是二倍体，全部只含有母本等位基因，为真实的黄姑鱼雌核发育二倍体。

本发明微卫星标记分析，是指用任何可以在黄姑鱼使用的微卫星标记引物对所诱导获得的雌核发育二倍体（称为雌核发育体，可以使胚胎、鱼苗或者成体）基因组DNA，以及提供卵子的雌性亲鱼和提供精子的雄性亲鱼的基因组DNA，进行PCR扩增与后续的电泳、银染或荧光染料标记染色等分析，雌核发育体只含有来自母本（卵子）的PCR扩增产物，而没有来自父本（精子）的PCR扩增产物。为了便于对分析结果进行判别，最好使用能够在母本与父本扩增出显著不同DNA电泳条带的引物。这是目前最为先进和简便可靠的判别雌核发育真实性的检测方法。由于目前尚没有已报道的黄姑鱼微卫星标记引物可利用，因此在本实施例中是采用经前期试验证明可以在黄姑鱼应用的来自大黄鱼的5个微卫星标记位点引物进行检测，所使用大黄鱼微卫星标记引物的名称为：LYC0009（60℃）、LYC0017（TD55-50℃）、LYC0038（51℃）、LYC0222（55℃）和LYC0453（55℃），其中括号内的温度为检测时所使用的退火温度，上述微卫星标记引物序列都已经公开于GenBank及相关的文献，可以通过网络检索获得；所使用的PCR扩增及其扩增产物电泳分析方法，是采用通用的PCR和电泳方法。

本发明的重点就在于：黄姑鱼精子的遗传失活和卵子的二倍体化。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能以此限定本发明实施的范围，即依本发明申请专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范围内。

Claims (4)

1.一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其主要特征在于：它包括以下步骤：

1) 黄姑鱼精子的遗传失活：取黄姑鱼精液经精子稀释液稀释20-30倍后，调整厚度至0.5-1 mm，置于紫外灯下照射，紫外线照射剂量为200-300mw/cm²；

2) 卵子雌核发育的启动：取黄姑鱼卵子与经步骤1)遗传失活的黄姑鱼精液混合后，加入室温海水，启动黄姑鱼卵子的雌核发育；

3) 卵子染色体组加倍：通过冷休克处理抑制第二极体排放，诱导黄姑鱼卵子的雌核发育单倍体的染色体组加倍成为雌核发育二倍体。

2.如权利要求1所述的黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于：步骤1）中所说的精子稀释液的配制方法为：NaCl 7.896g、KCl 0.396g、MgSO₄·7H₂O 0.195g、Na₂HPO₄·7H₂O 0.054g、KH₂PO₄ 0.054g、NaHCO₃ 0.305g、C₆H₁₂O₆ 0.99g，加水定容至1L。

3.如权利要求1所述的黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于：步骤2）中遗传失活黄姑鱼精液与黄姑鱼卵子的比例为1mL：2-20g。

4.如权利要求1所述的黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其特征在于：在步骤3）中所说的冷休克处理中抑制第二极体排放方法是：黄姑鱼卵子启动后1-5min，转移到0-6℃海水中，静置5-20min，再转移到室温海水中孵化。