CN112741025B - 一种石斑鱼种苗的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石斑鱼种苗的培育方法，无病毒饵料生物规模化培养；将成熟石斑鱼亲鱼获得的精液和卵细胞，按干法受精法受授精后，加入5％聚维酮碘溶液，药浴15min；收集灭毒后胚胎，置于孵化池的灭毒海水中孵化获取出膜仔鱼，取样检测；将无病毒石斑鱼仔鱼移至仔稚鱼培育区池塘或培育池的灭毒海水中，采用步骤一获得的无病毒批量饵料生物为饵料，再次检测；幼鱼标粗后再次检测。本申请通过无病毒饵料生物的筛选并规模化生产获取批量无病毒饵料生物，使用消毒剂和安全的剂量在石斑鱼胚胎发育的特定时段进行消毒获得无病毒仔鱼，在无病毒培育环境中进行仔鱼、稚鱼和幼鱼培育，成功切断亲鱼病毒的垂直传播、生物饵料和培育环境的水平传播，获得批量无病毒石斑鱼种苗，成活率由传统技术的0.2％—0.4％提高到20％—30％。
Description
技术领域
本发明涉及动物养殖领域，具体涉及一种石斑鱼种苗的培育方法。
背景技术
鱼类诺达病毒(piscine nodavirus，又称神经坏死病病毒(Viral nervousnecrosis，VNN)和真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus，RSIV)是感染斜带石斑鱼、褐点石斑鱼、鞍带石斑鱼、珍珠龙趸等石斑鱼类，及欧洲狼鲈、军曹鱼等海水鱼类各个生长阶段的主要病毒。研究表明，鱼类诺达病毒(piscine nodavirus和真鲷虹彩病毒(RSIV)广泛存在于天然野生和养殖石斑鱼、海区浮游生物和海水中，其传播途径主要为亲鱼的垂直传播、饵料生物和生活环境的水平传播，感染后死亡率90％以上，导至仔、稚、幼鱼或者成鱼批量死亡，严重抑制海水名贵鱼类养殖业的可持续发展。
在石斑鱼种苗生产中，因亲鱼垂直传播、饵料生物和生活环境的水平传播导致仔、稚、幼鱼爆发病毒病而失败的现象日趋严重。近年来，粤、桂、琼三省沿海石斑鱼鱼类种苗培育中，从仔鱼培育至体长9cm的种苗规格，其成活率仅为0.2％—0.4％。其中神经坏死病成为制约石斑鱼养殖业可持续发展核心问题。
目前，切断鱼类诺达病毒和真鲷虹彩病毒垂直传播的方法有无特定病原(Specefic pathogen Free，简称SPF)亲鱼培育及其种质资源保存，但SPF亲鱼培育的周期长(褐点石斑鱼一代亲鱼雌鱼初次性成熟的时间是4-5年，雄鱼为6-7年，斜带石斑鱼雌鱼初次性成熟的时间是4-5年，雄鱼为6-7年，鞍带石斑鱼雌鱼初次性成熟的性时间是6-8年，雄鱼为8-10年)、SPF亲鱼种群维持费用高，因此尽管其应用前景广泛，但由于超长的研发周期和亲鱼后续可能受到的水平传播等原因，且SPF种质资源具有重新感染病毒的极大风险，尚无法应用于产业。切断鱼类诺达病毒和真鲷虹彩病毒水平传播的方法有无病毒饵料生物批量生产和无病毒培育环境的构建，但由于无病毒饵料生物批量生产和无病毒培育环境的构建技术工艺的复杂性和系统性，尚得不到从业者的重视和认可，无法应用于产业。
迄今为止，仅仅只有关于诺达病毒的快速检测方法。例如：ZL201610277466.5《三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒及其操作方法》“快速提取RNA、预混反应试剂的方法，简化了RNA病毒的检测步骤。本发明所用材料和试剂全部为一次性使用，确保不会出现假阳性结果；本发明试剂盒组份简单，使用方法可操作性强，适用于检测和防控石斑鱼类黑身病的流行，能特异性，高灵敏度的检测出β诺达病毒。”虽然能加快检测发现诺达病毒，但是无法从根本上有效减少鱼类诺达病毒的传播，无法提高石斑鱼的存活率。
发明内容
针对上述问题，本发明旨在提供一种能有效减少石斑鱼类诺达病毒传播、提高种苗质量和产量的石斑鱼种苗的培育方法。
为实现该技术目的，本发明的方案是：一种石斑鱼种苗的培育方法，在鱼类种苗生产区域设置水质处理区、饵料生物培养区、亲鱼培育区、仔稚鱼培育区、幼鱼标粗区和尾水处理区，各功能区相对隔离；水质处理区设置2套水处理系统，包括抽水设备、露天蓄水池、沙滤罐、黑暗蓄水池和水质处理设备；
具体步骤如下：
第一步，无病毒饵料生物规模化培养，采用微藻分离提纯培养技术和浮游动物分离提纯培养技术获得的一级藻种和一级浮游动物亲本，筛选出一级浮游动物中鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测为阴性的亲本，阳性者灭毒后淘汰；
一级藻种经二级扩大培养获得的批量小球藻藻液；无病毒一级浮游动物亲本经二级扩大培养获得浮游动物亲本，再次检测，阳性者灭毒后淘汰；
采用二级小球藻藻液和二级浮游动物亲本在池塘培育获得的灭毒海水中规模化生产获得批量饵料生物；
第二步，繁殖，将成熟石斑鱼亲鱼获得的精液和卵细胞，按干法受精法受授精后，置于灭毒海水中，受精卵密度5—10c/mL，微充气，镜检胚胎发育进入2细胞期时，加入5％聚维酮碘溶液，剂量为15×10-6 L-1，药浴15min；
收集灭毒后胚胎，置于孵化池的灭毒海水中孵化获取出膜仔鱼，取样检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA为阴性者为无病毒石斑鱼仔鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰；
第三步，培育，将无病毒石斑鱼仔鱼移至仔稚鱼培育区池塘或培育池的灭毒海水中，采用步骤一获得的无病毒批量饵料生物为饵料，按石斑鱼仔、稚鱼培育技术和工艺培育30d左右，获得批量体长为2.7cm—3.2cm的幼鱼，再次检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性者为无病毒石斑鱼幼鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰。
第四步，幼鱼标粗，将第三步获得的无病毒幼鱼移至幼鱼标粗区培育池的灭毒海水中，采用石斑鱼幼鱼人工配合饲料为饵料，按石斑鱼幼鱼标粗技术和工艺培育30d左右，获得批量体长为9.0-15.0cm的石斑鱼种苗，再次检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性者为无病毒石斑鱼种苗，检测为阳性者灭毒后淘汰。
作为优选，所述灭毒海水为：在沙滤海水加入含氯消毒剂，按有效氯(12—15)×10-6 L-1黑暗处理12h，化学纯以上的硫代硫酸钠中和余氯，曝气2h，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测为阴性。
作为优选，第一步中二级扩大培养，接种无特定病原小球藻，密度为80—120万c/mL，培养3—7d，小球藻密度达400—600万c/mL时，加入无特定病原饵料生物亲本；饵料生物密度为0.05—0.1个/mL，培育10—15d，饵料生物密度达0.3个/mL时，收获浮游动物成虫和池底澡泥，含休眠虫和休眠卵，获得批量浮游动物。
作为优选，第一步中规模化生产，在池塘注入沙滤后的消毒海水，按微藻培养配方加入肥料，接种无特定病原小球藻，密度为80—120万c/mL，培养3—7d，小球藻密度达400—600万c/mL时，加入步骤二获得的批量浮游动物，饵料生物密度为0.05—0.1个/mL；在自然光照、自然水温和自然海水盐度条件下进行饵料生物的培养15-30d，饵料生物密度达0.3个/mL时，可阶段性收获无特定病原饵料生物成虫。
作为优选，所述含氯消毒剂为漂白粉、漂白精、或强氯精其中一种或多种。
本发明的有益效果，本申请通过无病毒饵料生物的筛选并规模化生产获取批量无病毒饵料生物，使用消毒剂和安全的剂量在石斑鱼胚胎发育的特定时段进行消毒获得无病毒仔鱼，在无病毒培育环境中进行仔鱼、稚鱼和幼鱼培育，成功切断亲鱼病毒的垂直传播、生物饵料和培育环境的水平传播，获得批量无病毒石斑鱼种苗，成活率由传统技术的0.2％—0.4％提高到20％—30％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明所述的具体实施例为一种石斑鱼种苗的培育方法，在鱼类种苗生产区域设置水质处理区、饵料生物培养区、亲鱼培育区、仔稚鱼培育区、幼鱼标粗区和尾水处理区等功能区，各功能区相对隔离，功能和工艺衔接。水质处理区设置2套水处理系统，包括抽水设备、露天蓄水池1口、沙滤罐数个、黑暗蓄水池1口和水质处理设备1套。2套水质处理系统交替使用，从海区抽取海水经灭毒处理后供应亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区使用。各功能区生产用具独立且消毒后使用，操作人员严格执行消毒操作规程。亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区的尾水独立汇总至尾水处理区，经处理达排放标准后排放或循环使用。
具体步骤如下：
第一步，无病毒饵料生物规模化培养，采用微藻分离提纯培养技术和浮游动物分离提纯培养技术获得的一级藻种和一级浮游动物亲本，筛选出一级浮游动物中鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测为阴性的亲本，阳性者灭毒后淘汰；
一级藻种经二级扩大培养获得的批量小球藻藻液；无病毒一级浮游动物亲本经二级扩大培养获得浮游动物亲本，再次检测，阳性者灭毒后淘汰；
采用二级小球藻藻液和二级浮游动物亲本在池塘培育获得的灭毒海水中规模化生产获得批量饵料生物；
第二步，繁殖，将成熟石斑鱼亲鱼获得的精液和卵细胞，按干法受精法受授精后，置于灭毒海水中，受精卵密度5—10c/mL，微充气，镜检胚胎发育进入2细胞期时，加入5％聚维酮碘溶液，剂量为15×10-6 L-1，药浴15min；
收集灭毒后胚胎，置于孵化池的灭毒海水中孵化获取出膜仔鱼，取样检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA为阴性者为无病毒石斑鱼仔鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰；
第三步，培育，将无病毒石斑鱼仔鱼移至仔稚鱼培育区池塘或培育池的灭毒海水中，采用步骤一获得的无病毒批量饵料生物为饵料，按石斑鱼仔、稚鱼培育技术和工艺培育30d左右，获得批量体长为2.7cm—3.2cm的幼鱼，再次检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性者为无病毒石斑鱼幼鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰。
第四步，幼鱼标粗，将第三步获得的无病毒幼鱼移至幼鱼标粗区培育池的灭毒海水中，采用石斑鱼幼鱼人工配合饲料为饵料，按石斑鱼幼鱼标粗技术和工艺培育30d左右，获得批量体长为9.0-15.0cm的石斑鱼种苗，再次检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性者为无病毒石斑鱼种苗，检测为阳性者灭毒后淘汰。
为了提高海水灭毒的效果，所述灭毒海水为：在沙滤海水加入含氯消毒剂，按有效氯(12—15)×10-6 L-1黑暗处理12h，化学纯以上的硫代硫酸钠中和余氯，曝气2h，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测为阴性。
为了提高二级扩大培养的效果，第一步中二级扩大培养，接种无特定病原小球藻，密度为80—120万c/mL，培养3—7d，小球藻密度达400—600万c/mL时，加入无特定病原饵料生物亲本；饵料生物密度为0.05—0.1个/mL，培育10—15d，饵料生物密度达0.3个/mL时，收获浮游动物成虫和池底澡泥，含休眠虫和休眠卵，获得批量浮游动物。
为了满足规模化生产的需求，第一步中规模化生产，在池塘注入沙滤后的消毒海水，按微藻培养配方加入肥料，接种无特定病原小球藻，密度为80—120万c/mL，培养3—7d，小球藻密度达400—600万c/mL时，加入步骤二获得的批量浮游动物，饵料生物密度为0.05—0.1个/mL；在自然光照、自然水温和自然海水盐度条件下进行饵料生物的培养15-30d，饵料生物密度达0.3个/mL时，可阶段性收获无特定病原饵料生物成虫。
下面就具体实施例进行说明：
实施例一：
无病毒环境的构建：在广东某研究基地进行珍珠石斑种苗生产，在基地东区北侧为水质处理区，西区北侧为饵料生物培养区，西区西侧为亲鱼培育区，西区东侧为仔稚鱼培育区，B车间为幼鱼标粗区，东区东侧为尾水处理区等功能区，各功能区相对隔离，功能和工艺衔接。其中水质处理区设施设备包括抽水设备、露天蓄水池2口3亩、黑暗蓄水池2口1000m3、水质处理设备2套。2套水质处理系统交替使用，从海区抽取海水经灭毒处理后供应亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区使用。各功能区生产用具独立且消毒后使用，操作人员严格执行消毒操作规程。亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区的尾水独立汇总至尾水处理区，经处理达排放标准后排放或循环使用。
1.1无病毒饵料生物规模化培养繁殖：在硇州岛东北部海域筛选的2.5kg无病毒浮游动物(鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性)一级浮游动物亲本，在微藻室获取一级小球藻藻种，在东海岛基地饵料生物培养区水泥池采用步骤(2)获得的灭毒海水中进行二级扩大培养获得的批量小球藻藻液(密度达800万c.mL-1—1000万c.mL-1)和浮游动物亲本(密度达2c.mL-1—3c.mL-1)，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测为阴性。移至池塘采用步骤(2)获得的灭毒海水中规模化生产获得批量饵料生物。
1.2繁殖，切断石斑鱼亲鱼病毒垂直传播：在亲鱼培育区6号池精选性腺成熟的鞍带石斑(♂)1尾，2号池精选褐点石斑(♀)3尾，采用压挤法获得精液85mL，卵细胞1.7kg，按干法受精法受精后，置于灭毒海水中，受精卵密度5c.mL-1，微充气，镜检胚胎发育进入2细胞期时，加入5％聚维酮碘溶液，剂量为15×10-6 L-1，药浴15min。受精卵灭毒要求在4细胞期前完成，收集灭毒后胚胎，置于孵化池的灭毒海水中孵化获取出膜仔鱼。取样检测鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA为阴性者为无病毒石斑鱼仔鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰。
1.3培育，无病毒石斑鱼仔、稚鱼的培育：将获得的无病毒仔鱼移至仔稚鱼培育区1#池塘和2#池塘，池塘圆角方形，面积1.12亩，消毒后加入无毒海水，采用无病毒饵料生物为饵料，按石斑鱼仔、稚鱼培育技术和工艺培育28d，获得批量体长为2.0—2.2cm的幼鱼，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性，得到无病毒石斑鱼幼鱼。
1.4无病毒幼鱼标粗，将步骤1.3获得的无病毒幼鱼移至幼鱼标粗区培育池的无毒海水中，采用石斑鱼幼鱼人工配合饲料为饵料，培育初始密度为0.25万尾/m2，随着幼鱼的生长过筛调整规格和调整培育密度，按石斑鱼幼鱼标粗技术和工艺培育57d，获得批量体长为9.5-11.81cm的石斑鱼种苗，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性，得到无病毒石斑鱼种苗。
实施例一的结果如下：
1.6无病毒环境的构建：通过对基地进行区域功能区划，建立了相对隔离的水质处理区、饵料生物培养区、亲鱼培育区、仔稚鱼培育区、幼鱼标粗区和尾水处理区，各功能区功能和工艺衔接。水质处理区2套水质处理系统交替使用，从海区抽取海水经灭毒处理后供应亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区使用。各功能区生产用具独立且消毒后使用，操作人员严格执行消毒操作规程。亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区的尾水独立汇总至尾水处理区，经处理达排放标准后排放或循环使用，整个基地构建为无病毒环境。
1.7水质优化和灭毒海水制备：2套水质处理系统交替使用，每周黑暗蓄水池海水鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
1.8无病毒饵料生物规模化培养：获得饵料生物培养池塘1#和2#，每周收获浮游动物20kg—25kg，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
1.9无病毒石斑鱼仔、稚鱼的培育繁殖阶段：获得出膜仔鱼约180万尾，孵化率88.24％，畸形率0.27％，仔鱼形态正常，活力良好，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
1.10无病毒石斑鱼仔、稚鱼的培育阶段：32日后，1#池塘和2#池塘分别获得批量体长为2.1cm—2.4cm的幼鱼23万尾和21.5万尾，平均成活率24.72％，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
1.11无病毒幼鱼标粗阶段：又过47日后，获得体长8.3cm—11.2cm石斑鱼中苗26.3万尾。鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
实施例二
无病毒环境的构建：在广东某养殖基地进行珍珠石斑种苗生产，在基地设有水质处理区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区，B车间为幼鱼标粗区，东区东侧为尾水处理区等功能区，各功能区相对隔离，功能和工艺衔接。其中水质处理区设施设备包括抽水设备、露天蓄水池2口4亩、黑暗蓄水池2口800m3、水质处理设备2套。2套水质处理系统交替使用，从海区抽取海水经灭毒处理后供应亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区使用。各功能区生产用具独立且消毒后使用，操作人员严格执行消毒操作规程。饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区的尾水独立汇总至尾水处理区，经处理达排放标准后排放或循环使用。
水质优化和灭毒海水制备“”从海区沙滤井抽取海水进入水质处理区露天蓄水池，加入漂白精按有效氯12—15×10-6 L-1黑夜处理8h灭杀病毒、细菌、微藻和浮游动物后，自然光照和曝气6h后，硫代硫酸钠中和余氯，曝气2h后，经灭毒沙滤池过滤进入黑暗蓄水池沉淀备用。
2.1无病毒饵料生物规模化培养：在硇州岛东北部海域筛选的3.1kg无病毒浮游动物(鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性)一级浮游动物亲本，在微藻室获取一级小球藻藻种，在阳西湛江合兴水产科技有限公司养殖基地的饵料生物培养区水泥池采用灭毒海水中进行二级扩大培养获得的批量小球藻藻液(密度达800—1000万c.mL-1)和浮游动物亲本(密度达2—3个/mL)，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测为阴性。移至池塘采用步骤(2)获得的灭毒海水中规模化生产获得批量饵料生物。
2.2切断石斑鱼亲鱼病毒垂直传播繁殖：在某研究基地的亲鱼培育区6号池精选性腺成熟的鞍带石斑(♂)1尾，2号池精选褐点石斑(♀)4尾，采用压挤法获得精液54mL，卵细胞1.9kg，按干法受精法受精后，置于灭毒海水中，受精卵密度5c/mL，微充气，镜检胚胎发育进入2细胞期时，加入5％聚维酮碘溶液，剂量为15×10-6/L，药浴15min。受精卵灭毒要求在4细胞期前完成，收集灭毒后胚胎，置于孵化池的灭毒海水中孵化获取出膜仔鱼。取样检测鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA为阴性者为无病毒石斑鱼仔鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰。
2.3无病毒石斑鱼仔、稚鱼的培育：将获得的无病毒仔鱼移至仔稚鱼培育区1#池塘和2#池塘，池塘方形，面积3.5亩，消毒后加入无毒海水，采用无病毒饵料生物为饵料，按石斑鱼仔、稚鱼培育技术和工艺培育30d左右，获得批量体长为2.2—2.5cm的幼鱼，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性者为无病毒石斑鱼幼鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰。。
2.4无病毒幼鱼标粗：将无病毒幼鱼移至幼鱼标粗区培育池的无毒海水中，采用石斑鱼幼鱼人工配合饲料为饵料，培育初始密度为0.25万尾/m2，随着幼鱼的生长过筛调整规格和调整培育密度，按石斑鱼幼鱼标粗技术和工艺培育61d，获得批量体长为7.8—12.5cm的石斑鱼种苗，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性，得到无病毒石斑鱼种苗。
实施例二的结果如下：
2.5无病毒环境的构建：通过对基地进行区域功能区划，建立了相对隔离的水质处理区、饵料生物培养区、亲鱼培育区、仔稚鱼培育区、幼鱼标粗区和尾水处理区，各功能区功能和工艺衔接。水质处理区2套水质处理系统交替使用，从海区抽取海水经灭毒处理后供应亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区使用。各功能区生产用具独立且消毒后使用，操作人员严格执行消毒操作规程。亲鱼培育区、饵料生物培养区、仔稚鱼培育区和幼鱼标粗区的尾水独立汇总至尾水处理区，经处理达排放标准后排放或循环使用，整个基地构建为无病毒环境。
2.6水质优化和灭毒海水制备：2套水质处理系统交替使用，每周黑暗蓄水池海水鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
2.7无病毒饵料生物规模化培养：获得饵料生物培养池塘1#和2#，每天收获浮游动物30kg—50kg，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
2.8无病毒石斑鱼仔、稚鱼的培育：获得出膜仔鱼约176万尾，孵化率92.63％，畸形率0.27％，仔鱼形态正常，活力良好，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
2.9无病毒石斑鱼仔、稚鱼的培育：31日后，1#池塘和2#池塘分别获得批量体长为2.2cm—2.5cm的幼鱼20万尾和18万尾，平均成活率21.6％，幼苗鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
2.10无病毒幼鱼标粗：又过，45日后，获得体长7.5cm—10cm石斑鱼中苗24.7万尾。鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测均为阴性。
本申请通过无病毒饵料生物的筛选并规模化生产获取批量无病毒饵料生物，使用消毒剂和安全的剂量在石斑鱼胚胎发育的特定时段进行消毒获得无病毒仔鱼，在无病毒培育环境中进行仔鱼、稚鱼和幼鱼培育，成功切断亲鱼病毒的垂直传播、生物饵料和培育环境的水平传播，获得批量无病毒石斑鱼种苗，繁殖阶段到幼鱼标粗阶段的成活率由传统技术的0.2％—0.4％提高到20％—30％。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种石斑鱼种苗的培育方法，其特征在于：在鱼类种苗生产区域设置水质处理区、饵料生物培养区、亲鱼培育区、仔稚鱼培育区、幼鱼标粗区和尾水处理区，各功能区相对隔离；水质处理区设置2套水处理系统，包括抽水设备、露天蓄水池、沙滤罐、黑暗蓄水池和水质处理设备；
具体步骤如下：
第一步，无病毒饵料生物规模化培养，采用微藻分离提纯培养技术和浮游动物分离提纯培养技术获得的一级藻种和一级浮游动物亲本，筛选出一级浮游动物中鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测为阴性的亲本，阳性者灭毒后淘汰；
一级藻种经二级扩大培养获得的批量小球藻藻液；无病毒一级浮游动物亲本经二级扩大培养获得浮游动物亲本，再次检测，阳性者灭毒后淘汰；
采用二级小球藻藻液和二级浮游动物亲本在池塘培育获得的灭毒海水中规模化生产获得批量饵料生物；
第二步，繁殖，将成熟石斑鱼亲鱼获得的精液和卵细胞，按干法受精法受授精后，置于灭毒海水中，受精卵密度5—10c/mL，微充气，镜检胚胎发育进入2细胞期时，加入5％聚维酮碘溶液，剂量为15×10-6L-1，药浴15min；
收集灭毒后胚胎，置于孵化池的灭毒海水中孵化获取出膜仔鱼，取样检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA为阴性者为无病毒石斑鱼仔鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰；
第三步，培育，将无病毒石斑鱼仔鱼移至仔稚鱼培育区池塘或培育池的灭毒海水中，采用步骤一获得的无病毒批量饵料生物为饵料，按石斑鱼仔、稚鱼培育技术和工艺培育30d左右，获得批量体长为2.7cm—3.2cm的幼鱼，再次检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性者为无病毒石斑鱼幼鱼，检测为阳性者灭毒后淘汰；
第四步，幼鱼标粗，将第三步获得的无病毒幼鱼移至幼鱼标粗区培育池的灭毒海水中，采用石斑鱼幼鱼人工配合饲料为饵料，按石斑鱼幼鱼标粗技术和工艺培育30d左右，获得批量体长为9.0-15.0cm的石斑鱼种苗，再次检测，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测阴性者为无病毒石斑鱼种苗，检测为阳性者灭毒后淘汰。
2.根据权利要求1所述的石斑鱼种苗的培育方法，其特征在于：所述灭毒海水为：在沙滤海水加入含氯消毒剂，按有效氯(12—15)×10-6L-1黑暗处理12h，化学纯以上的硫代硫酸钠中和余氯，曝气2h，鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA检测为阴性。
3.根据权利要求1所述的石斑鱼种苗的培育方法，其特征在于：第一步中二级扩大培养，接种无特定病原小球藻，密度为80—120万c/mL，培养3—7d，小球藻密度达400—600万c/mL时，加入无特定病原饵料生物亲本；饵料生物密度为0.05—0.1个/mL，培育10—15d，饵料生物密度达0.3个/mL时，收获浮游动物成虫和池底澡泥，含休眠虫和休眠卵，获得批量浮游动物。
4.根据权利要求1所述的石斑鱼种苗的培育方法，其特征在于：第一步中规模化生产，在池塘注入沙滤后的消毒海水，按微藻培养配方加入肥料，接种无特定病原小球藻，密度为80—120万c/mL，培养3—7d，小球藻密度达400—600万c/mL时，加入步骤二获得的批量浮游动物，饵料生物密度为0.05—0.1个/mL；在自然光照、自然水温和自然海水盐度条件下进行饵料生物的培养15-30d，饵料生物密度达0.3个/mL时，可阶段性收获无特定病原饵料生物成虫。
5.根据权利要求2所述的石斑鱼种苗的培育方法，其特征在于：所述含氯消毒剂为漂白粉、漂白精、或强氯精其中一种或多种。
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