CN113475440A - 一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，包括苗种的选择、攻毒、筛选、二次攻毒、亲虾的养成、亲虾的暂养、子一代的繁育。本发明通过现代生物学原理及生物技术的方法，通过攻毒试验选育出具有抗HLV特性的亲虾繁育的子一代虾苗也具有很强的抗“玻璃苗”疫病的性能，保障了优质苗种的稳定生产与供给，对提高商业对虾养殖的成功率也有重要作用。本发明提供了一种健康优质种苗选育的新方法，设计合理，具有一定的可操作性，适合于大规模生产性选育具有抗HLV特性的南美白对虾种苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，属于对虾抗病性状选育技术领域。
背景技术
南美白对虾是重要的广盐性经济虾类，因其生长快速，单产产量高、经济价值高等特点深受水产养殖业者的青睐，养殖规模快速增长。但是随着养殖规模的增加、高密度养殖导致水环境污染加剧，南美白对虾养殖过程中的病害也越来越多样化。
2019年下半年至2020年上半年从南到北爆发了“玻璃苗”疫病，虾苗在2-3天内出现大量急性死亡，给养殖业造成毁灭性的影响，目前尚无有效防治“玻璃苗”疫病的有效措施，最有效的方法在于预防，在实际生产中我们发现南美白对虾苗种中有极少部分具有抗“玻璃苗”病菌(HLV)的能力，在感染HLV后很少能够健康存活下来。
因此，在南美白对虾中选育出具有抗“玻璃苗”病菌(HLV)性能的个体作为亲虾进行繁育，利用其子一代虾苗能否抗HLV的特性来防止“玻璃苗”的发生是苗种可持续健康发展的重要保障，也是南美白对虾养殖可持续健康发展的重要措施之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，具有抗玻璃苗病菌(HLV)的特点。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其创新点在于包括如下步骤：
步骤A：苗种的选择，选择经PCR检测合格达到SPF状态的健康虾苗，进行1-2天恢复性暂养；
步骤B：攻毒，健康虾苗经1-2天暂养稳定后，用玻璃苗病菌菌液进行浸泡攻毒，攻毒的浓度为2×102个/ml至8×102个/ml；
步骤C：筛选，淘汰经攻毒发病死亡的第一批虾苗，保留存活下来的健康虾苗；
步骤D：二次攻毒，将存活下来的健康虾苗进行二次攻毒，攻毒的方法为：投喂步骤C中攻毒发病死亡的第一批虾苗，并将剩余的死苗进行无害化处理，再次从中筛选出抗玻璃苗特性的健康虾苗，且经PCR检测合格达到SPF状态；
步骤E：亲虾的养成，将二次攻毒筛选出来的健康苗种分养到25m2至30m2的水泥育苗池中，按照160-180尾/m3的密度养成至30-35g/尾规格的成虾；
步骤F：亲虾的暂养，挑选出质量好的、健康的成虾按照养殖密度40-50尾/m3分稀暂养，同时进行营养强化，作为备用亲虾；
步骤G：子一代的繁育，待选育亲虾大小达到合适的规格后，即可进行繁育子一代的苗种，并且对子一代健康虾苗在实验室和实际生产中进行攻毒试验，获得实验室成活率可达95％以上且实际生产成活率80％-85％的虾苗。
优选的，所述步骤A和B中健康虾苗的暂养条件为，按照7万尾/m3的密度暂养，用水须经过陶氏超滤设备过滤处理，水温27-30℃，盐度17-20％0，溶解氧为6mg/L以上，pH值8.0-8.5，水中总氨氮含量为0-0.6mg/L，光照周期12h，光照强度500-1000lux，每天投饵6-8次。
优选的，所述步骤A中健康虾苗体长0.5cm、肠胃饱满。
优选的，所述步骤B中玻璃苗病菌菌液的制备方法为：在自然资源部第三海洋研究所杨丰研究员及其科研团队在爆发玻璃苗综合症症状明显的标粗场育苗池进行取样，经过层层实验最终确定玻璃苗病原为含毒性质粒并携带毒力基因的高致死性弧菌，同时在实验室分离纯化出玻璃苗病毒毒株并制备了玻璃苗菌液，并经PCR检测和投喂感染证明为玻璃苗病原阳性。
优选的，所述玻璃苗菌液有效菌浓度为4×109个/ml至5×109个/ml。
优选的，所述步骤C和步骤D中用水须经陶氏超滤设备过滤处理，水温27-30℃，盐度20-25‰，溶解氧为6mg/L以上，pH值8.0-8.5，水中总氨氮0-0.6mg/L，每天换水量30％-50％，光照周期12h，光照强度500-1000lux，每天投饵6-8次。
优选的，所述步骤E中亲虾的养成期间水深0.6-1.0m，养殖用水须经陶氏超滤设备过滤处理，常规养殖管理，定期进行PCR检测。
优选的，所述步骤E中亲虾的养成期间，水温25-31℃，盐度30-33‰，溶解氧为6mg/L以上，pH值7.8-8.5，水中总氨氮0-0.6mg/L，每天换水量30％-60％，日常光照，每天投喂4次。
优选的，所述步骤F中用水须经陶氏超滤设备处理，水温25-30℃，盐度30-33‰，溶解氧为6mg/L以上，pH值8.0-8.5，水中总氨氮0-0.6mg/L，每天换水量50％-70％，光照周期12h，光照强度800-1200hx，每天投饵4次。
本发明的优点在于：本发明通过现代生物学原理及生物技术的方法，通过攻毒试验选育出具有抗HLV特性的亲虾繁育的子一代虾苗也具有很强的抗“玻璃苗”疫病的性能，保障了优质苗种的稳定生产与供给，对提高商业对虾养殖的成功率也有重要作用。本发明提供了一种健康优质种苗选育的新方法，设计合理，具有一定的可操作性，适合于大规模生产性选育具有抗HLV特性的南美白对虾种苗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1：
(1)苗种的选择与暂养：挑选经PCR检测合格达到SPF状态的体长0.5cm健康虾苗(P5)500万尾，按照7万尾/m3的密度平均分至四个30m2的水泥池中，暂养1-2天。用水须经陶氏超滤设备过滤处理，水深0.6m，水温27-30℃，盐度17-20‰，溶解氧为6mg/L以上，pH值8.0-8.5，水中总氨氮含量为0-0.6mg/L，光照周期12h：12h，光照强度500-1000Lux，每天投饵6-8次。
(2)攻毒：P5虾苗经1-2天暂养稳定后，用HLV菌液进行浸泡攻毒，攻毒浓度为2×102个/ml，HLV菌液的制备方法为：自然资源部第三海洋研究所杨丰研究员及其科研团队在爆发“玻璃苗”综合症症状明显的标粗场育苗池进行取样，经过层层实验最终确定“玻璃苗”病原为含毒性质粒并携带毒力基因的高致死性弧菌(HLV)，同时在实验室分离纯化出HLV毒株并制备HLV菌液，其浓度为4×109个/ml至5×109个/ml，并经PCR检测和投喂感染证明为“玻璃苗”病原阳性。
(3)淘汰非抗性苗种：浸泡攻毒40-48小时后虾苗出现大量感染症状(玻璃苗)，2-3天后大量死亡，及时分离淘汰发病死亡的虾苗，保留存活下来的虾苗。经6-8天后，绝大部分虾苗已发病死亡，仅剩极少部分虽有感染症状，但又恢复成健康的虾苗，说明存活下来的虾苗具有抗HLV的特性。最终剩下6.5万的虾苗，存活率1.3％。
(4)二次攻毒：将存活下来的健康苗种进行二次攻毒，攻毒的具体方法为：投喂第一次攻毒死亡的部分死苗，该死苗经PCR检测仅显示“玻璃苗”病原阳性，剩余的死苗进行无害化处理。2-3天后，绝大部分的虾苗状态正常，不出现发病症状，成活率96％以上，从而再次筛选出具有抗HLV特性的健康苗种，经PCR检测合格。
(5)亲虾的养成：将二次攻毒筛选出来的具有抗HLV特性的6.3万尾的苗种分养到25m2和30m2水泥育苗池中，按照180尾/m3的密度养成到30-35g/尾规格的成虾，期间水深0.6-1.0米，养殖水须经陶氏超滤设备过滤处理。常规养殖管理，定期进行PCR检测合格。
(6)亲虾的暂养：挑选出质量好的、健康的成虾按照养殖密度50尾/m3进行饲养，同时进行营养强化，作为备用生产的亲虾。养殖用水须经陶氏超滤设备过滤处理。常规养殖管理，定期进行PCR检测合格。
(7)子一代的繁育：待选育亲虾大小达到合适的规格后，即可进行繁育子一代的苗种，并且子一代P5虾苗在实验室和实际生产中进行攻毒试验，结果发现在实验室的成活率可达95％，实际生产中成活率可达82％，证明了该选育的子一代虾苗具备了优良的抗“玻璃苗”疫病的性能。
实施例2：
(1)苗种的选择与暂养：挑选经PCR检测合格达到SPF状态的体长0.5cm健康虾苗(P5)500万尾，按照7万尾/m3的密度平均分至四个30m2的水泥池中，暂养1-2天。用水须经陶氏超滤设备过滤处理，水深0.6m，水温27-30℃，水中总氨氮含量0-0.6mg/L，光照周期12h：12h，光照强度500-1000Lux，每日投饵6-8次。
(2)攻毒：P5虾苗经1-2天暂养稳定后，用HLV菌液进行浸泡攻毒，攻毒浓度为4×102个/ml。HLV菌液的制备方法为：自然资源部第三海洋研究所杨丰研究员及其科研团队在爆发“玻璃苗”综合症症状明显的标粗场育苗池进行取样，经过层层实验最终确定“玻璃苗”病原为含毒性质粒并携带毒力基因的高致死性弧菌(HLV)，同时在实验室分离纯化出HLV毒株并制备HLV菌液，其浓度为4×109个/ml至5×109个/ml，并经PCR检测和投喂感染证明为“玻璃苗”病原阳性。
(3)淘汰非抗性苗种：浸泡攻毒40-48小时后虾苗出现大量感染症状(玻璃苗)，2-3天后大量死亡，及时分离淘汰发病死亡的虾苗，保留存活下来的虾苗。经6-8天后，绝大部分虾苗已发病死亡，仅剩极少部分虽有感染症状，但又恢复成健康状态的虾苗，说明存活下来的虾苗具有抗HLV的特性。最终剩下3.1万尾的虾苗，存活率0.6％。
(4)二次攻毒：将存活下来的健康苗种进行二次攻毒，攻毒的具体方法为：投喂第一次攻毒死亡的部分死苗，该死苗经PCR检测仅显示“玻璃苗”病原阳性，剩余的死苗进行无害化处理。2-3天后，绝大部分的虾苗状态正常，不出现发病症状，成活率98％以上，从而再次筛选出具有抗HLV特性的健康苗种，经PCR检测合格。
(5)亲虾的养成：将二次攻毒筛选出来的具有抗HLV特性的3.1万尾的苗种分养到30m2水泥育苗池中，按照170尾/m3的密度养成到30-34g/尾规格的成虾。期间水深0.6-1.0m，养殖用水须经陶氏超滤设备过滤处理。常规养殖管理，定期进行PCR检测合格。
(6)亲虾的暂养：挑选出质量好的、健康的成虾按照养殖密度45尾/m3分稀暂养，同时进行营养强化，作为生产备用亲虾。养殖用水须经陶氏超滤设备过滤处理。常规养殖管理，定期进行PCR检测合格。
(7)子一代的繁育：待选育的亲虾大小达到合适的规格后，即可进行繁育子一代的苗种，并且子一代P5虾苗在实验室和实际生产中进行攻毒试验，结果发现在实验室的成活率可达97％，实际生产中成活率可达80％，证明了该选育的子一代虾苗具备了优良的抗“玻璃苗”疫病的性能。
实施例3：
(1)苗种的选择与暂养：挑选经PCR检测合格达到SPF状态的体长0.5cm健康虾苗(P5)500万尾，按照7万尾/m3的密度平均分至四个30m2的水泥池中，暂养1-2天。用水须经陶氏超滤设备过滤处理，水深0.6m，水温27-30℃，盐度17-20‰，溶解氧6mg/L以上，pH值8.0-8.5，水中总氨氮含量0-0.6mg/L，光照周期12h：12h，光照强度500-1000Lux，每天投饵6-8次。
(2)攻毒：P5虾苗经1-2天暂养稳定后，用HLV菌液进行浸泡攻毒，攻毒浓度为8×102个/ml。HLV菌液的制备方法为：自然资源部第三海洋研究所杨丰研究员及其科研团队在爆发“玻璃苗”综合症症状明显的标粗场育苗池进行取样，经过层层实验最终确定“玻璃苗”病原为含毒性质粒并携带毒力基因的高致死性弧菌(HLV)，同时在实验室分离纯化出HLV毒株并制备HLV菌液，其浓度为4×109个/ml至5×109个/ml，并经PCR检测和投喂感染证明为“玻璃苗”病原阳性。
(3)淘汰非抗性苗种：浸泡攻毒36-48小时后虾苗出现大量感染症状(玻璃苗)，2天后大量死亡，及时分离淘汰发病死亡的虾苗，保留存活下来的虾苗。经6-8天后，绝大部分虾苗已发病死亡，仅剩极少部分虽有感染症状，但又恢复成健康的虾苗，说明存活下来的虾苗具有抗HLV的特性。最终剩下2.5万尾的虾苗，存活率0.5％。
(4)二次攻毒：将存活下来的健康苗种进行二次攻毒，攻毒的具体方法为：投喂第一次攻毒死亡的部分死苗，该死苗经PCR检测仅显示“玻璃苗”病原阳性，剩余的死苗进行无害化处理。2-3天后，绝大部分的虾苗状态正常，不出现发病症状，成活率95％以上，从而再次筛选出具有抗HLV特性的健康苗种，经PCR检测合格。
(5)亲虾的养成：将二次攻毒筛选出来的具有抗HLV特性的2.4万尾的苗种分养到25m2的水泥育苗池中，按照160尾/m3的密度养成到30-35g/尾规格的成虾，期间水深0.6-1.0m，养殖用水须经陶氏超滤设备过滤处理。常规养殖管理，定期进行PCR检测合格。
(6)亲虾的暂养：挑选出质量好的、健康的成虾按照养殖密度50尾/m3分稀暂养，同时进行营养强化，作为生产备用亲虾。养殖用水须经陶氏超滤设备过滤处理。常规养殖管理，定期进行PCR检测合格。
(7)子一代繁育：待选育的亲本大小达到合适的规格后，即可进行繁育子一代的苗种，并且子一代P5虾苗在实验室和实际生产中进行攻毒试验，结果发现在实验室的成活率可达98％，实际生产中成活率可达85％，证明了该选育的子一代虾苗具备了优良的抗“玻璃苗”疫病的性能。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制性技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤A：苗种的选择，选择经PCR检测合格达到SPF状态的健康虾苗，进行1-2天恢复性暂养；
步骤B：攻毒，健康虾苗经1-2天暂养稳定后，用玻璃苗病菌菌液进行浸泡攻毒，攻毒的浓度为2×102个/ml至8×102个/ml；
步骤C：筛选，淘汰经攻毒发病死亡的第一批虾苗，保留存活下来的健康虾苗；
步骤D：二次攻毒，将存活下来的健康虾苗进行二次攻毒，攻毒的方法为：投喂步骤C中攻毒发病死亡的第一批虾苗，并将剩余的死苗进行无害化处理，再次从中筛选出抗玻璃苗特性的健康虾苗，且经PCR检测合格达到SPF状态；
步骤E：亲虾的养成，将二次攻毒筛选出来的健康苗种分养到25m2至30m2的水泥育苗池中，按照160-180尾/m3的密度养成至30-35g/尾规格的成虾；
步骤F：亲虾的暂养，挑选出质量好的、健康的成虾按照养殖密度40-50尾/m3分稀暂养，同时进行营养强化，作为备用亲虾；
步骤G：子一代的繁育，待选育亲虾大小达到合适的规格后，即可进行繁育子一代的苗种，并且对子一代健康虾苗在实验室和实际生产中进行攻毒试验，获得实验室成活率可达95％以上且实际生产成活率80％-85％的虾苗。
2.如权利要求1所述的一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于：所述步骤A和B中健康虾苗的暂养条件为，按照7万尾/m3的密度暂养，用水须经过陶氏超滤设备过滤处理，水温27-30℃，盐度17-20‰，溶解氧为6mg/L以上，pH值8.0-8.5，水中总氨氮含量为0-0.6mg/L，光照周期12h，光照强度500-10001ux，每天投饵6-8次。
3.如权利要求1所述的一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于：所述步骤A中健康虾苗体长0.5cm、肠胃饱满。
4.如权利要求1所述的一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于：所述步骤B中玻璃苗病菌菌液的制备方法为：在自然资源部第三海洋研究所杨丰研究员及其科研团队在爆发玻璃苗综合症症状明显的标粗场育苗池进行取样，经过层层实验最终确定玻璃苗病原为含毒性质粒并携带毒力基因的高致死性弧菌，同时在实验室分离纯化出玻璃苗病毒毒株并制备了玻璃苗菌液，并经PCR检测和投喂感染证明为玻璃苗病原阳性。
5.如权利要求1所述的一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于：所述玻璃苗菌液有效菌浓度为4×109个/ml至5×109个/ml。
6.如权利要求1所述的一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于：所述步骤C和步骤D中用水须经陶氏超滤设备过滤处理，水温27-30℃，盐度20-25‰，溶解氧为6mg/L以上，pH值8.0-8.5，水中总氨氮0-0.6mg/L，每天换水量30％-50％，光照周期12h，光照强度500-10001ux，每天投饵6-8次。
7.如权利要求1所述的一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于：所述步骤E中亲虾的养成期间水深0.6-1.0m，养殖用水须经陶氏超滤设备过滤处理，常规养殖管理，定期进行PCR检测。
8.如权利要求7所述的一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于：所述步骤E中亲虾的养成期间，水温25-31℃，盐度30-33‰，溶解氧为6mg/L以上，pH值7.8-8.5，水中总氨氮0-0.6mg/L，每天换水量30％-60％，日常光照，每天投喂4次。
9.如权利要求7所述的一种选育具有抗玻璃苗病菌特性的南美白对虾种苗的方法，其特征在于：所述步骤F中用水须经陶氏超滤设备处理，水温25-30℃，盐度30-33‰，溶解氧为6mg/L以上，pH值8.0-8.5，水中总氨氮0-0.6mg/L，每天换水量50％-70％，光照周期12h，光照强度800-1200lux，每天投饵4次。
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