CN110463659A - 一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法 - Google Patents
一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法，采集黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼，培育成熟后，繁殖获得不同群体、纯种的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼鱼苗；按照确定的鮰爱德华氏菌半致死浓度，采用浸泡法浸泡所有黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼种；抗鮰爱德华氏菌群体选育两次，通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系，分别将抗鮰爱德华氏菌黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼品系培育至性成熟，然后按照通用的鱼类人工繁殖方法，生产杂家黄颡鱼苗。本发明能培育黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼抗裂头病亲本，提高苗种及养殖过程中的裂头病发生率及死亡率，提高了养殖成活率。
Description
技术领域
本发明属于鱼类育种技术领域，具体涉及一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法。
背景技术
选择育种是传统的鱼类育种方法，利用鱼类本身的遗传变异，分离并保留优良性状，快速固定和发展优良变异，对鱼类品种进行提纯和复壮。目前国内外采用选择育种、杂交育种、细胞工程育种、分子辅助育种及基因组选择育种理论，先后培育出迅速在银鲫、鲤鱼、中国对虾、罗氏沼虾、大菱鲆、加州鲈、斑点叉尾、罗非鱼、鲍鱼、扇贝、牡蛎、珍珠贝和文蛤等养殖种类中培育出新品种。采用性别连锁遗传标记辅助的鱼类性别控制技术，成功培育出黄颡鱼“全雄1号”、全雌加州鲈“北鲆1号”和“北鲆2号”、罗非鱼“鹭雄1号”和半滑舌鳎高雌苗种等。截至2016年，国家水产原种和良种审定委员会审定通过的水产养殖新品种共达168个，涵盖了鱼、虾、贝、蟹、藻等主要养殖种类。现有育种技术及专利主要针对为行业培育创造高产、饲料转化效率高等经济性状优良的水产新品种。在整个水产产业中，培养抗病或抗逆等经济性状优良的水产新品种的通用研究理论及技术相对成熟；然而，水产养殖种类繁多，每种养殖种类的病害发生的条件、病原等因素千差万别；因此，针对具体的某种养殖鱼类的抗病或抗逆专有理论、培育技术十分欠缺。目前，中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林研究员等发明的“大菱鲆抗病优良品系选育方法”获国家发明专利授权，专利号ZL2010101288520。湖南师范大学生命科学院鱼类发育生物研究所经过多年精心培育，成功培育出了纯系抗病体草鱼。该草鱼具有抗病能力强、生长速度快、成活率高等优点，其养殖推广现已列入国家星火计划，属国家自然科学基金重点项目，并已申报国家发明专利(专利申请号20091004447 2.6)。这些鱼类抗病性专利拥有的抗病育种技术有效解决了人工养殖条件下的大菱鲆、草鱼易感具体病原的生产问题。
瓦氏黄颡鱼与黄颡鱼均属鲇形目、鲿科、黄颡鱼属，是黄颡鱼属中经济价值较高的两个种类。由于这两种鱼具有肉嫩味美、高营养、无肌间刺等特点，深受广大消费者的喜爱。1996年，人们已经掌握了黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼全人工繁殖技术，开始大规模全人工繁殖黄颡鱼鱼苗供应全国。2012年开始，中国水生所的专家们“从XY雌鱼雌核发育产生YY超雄黄颡鱼”，用YY超雄黄颡鱼与普通XX母鱼杂交而繁殖出♂XY全雄苗养殖，将黄颡鱼产业推上了一个新台阶。虽然近全国兴起全雄鱼养殖，但生产全雄苗所用YY超雄鱼供应紧张，价格昂贵；而社会上种质混杂，检测技术仅掌握在少数人手中，绝大部分苗场及广大养户很难对全雄亲本超雄公鱼及全雄苗种进行DNA检测鉴定。因此，在市场上有很大的局限性。黄颡鱼雌鱼与瓦氏黄颡鱼雄鱼杂交子代体型厚实，与双亲相比具有明显的生长优势，饵料系数低，已成为水产养殖较受欢迎的品种之一。
据水产渔业年鉴统计，2017年全国黄颡鱼养殖产量在47万吨，连续几年都是以20％左右的幅度在增长。苗种年需求量突破千亿尾，成鱼日上市量也超过一百万斤。随着养殖规模的扩大和养殖密度的提高，病害频发，细菌性疾病尤为严重，其中由“鲇鱼爱德华氏菌”感染导致的裂头病已成为黄颡鱼养殖业最主要的流行性疾病。目前，几乎在国内黄颡鱼养殖区域四川、重庆、湖北、湖南、广西、浙江、上海等地具有裂头病的报道。国内学者对患病黄颡鱼病原进行了研究，发现不同养殖区域的黄颡鱼病原不同，可能为迟钝爱德华氏菌或鮰爱德华氏菌。邓先余等对湖南湘潭以及陈飞鹏对天津宁河的患病黄颡鱼病原进行分离鉴定发现病原为迟钝爱德华氏菌；而徐进等、郑善坚、耿毅等以及陈保立和李丹分别对湖北荆州、浙江湖州、四川眉山与新津以及广东顺德等地的患病黄颡鱼病原进行分离鉴定发现其病原为鮰爱德华氏菌。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法，从抗病育种等方面着手对黄颡鱼主养品种进行优化，筛选出抗病能力强的品种进行推广养殖，为黄颡鱼养殖业的可持续发展提供技术支撑。
具体的技术方案为：
一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法，包括以下的步骤：
(1)群体的采集：采集沱江野生群体、岷江野生群体的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼，挑选种质纯正、性状优良的野生原种强化培育。
(2)子代繁育：将黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼培育成熟后，繁殖获得不同群体、纯种的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼鱼苗。
(3)抗病筛选：黄颡鱼裂头病患病季节，按照确定的鮰爱德华氏菌半致死浓度，采用浸泡法浸泡所有黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼种；浸泡过程中，粗糙网具反复捕捞搅动鱼种，浸泡3小时后，放回池塘自然养殖。浸泡后24小时内出现死亡，48小时内出现一点红症状，侵泡96小时内出现典型裂头症状；10天后，死亡消失。拉网统计，不同群体的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼的死亡率均达到80％以上。
(4)抗鮰爱德华氏菌群体选育：
①将不同群体的黄颡鱼父本、母本相互杂交；
②将不同群体的瓦氏鱼父本、母本相互杂交；
分别获得至少10个菌黄颡鱼家系和10个瓦氏黄颡鱼家系。家系：是由1尾雄鱼的精子和10-20尾雌鱼的卵子授精而获得的鱼苗。
重复步骤(3)，对获得的后代家系再次进行抗鮰爱德华氏菌感染的筛选，将感染后存活率高的家系确定为抗鮰爱德华氏菌黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼品系。
品系：指经过2代选育后、性状稳定的家系。
(5)通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：采用筛选到的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼抗病家系与其它群体进行杂交，其它群体指四川养殖群体、广东养殖群体、浙江养殖群体；建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至10-12厘米时，每个家系取200-250尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，筛选出抗鮰爱德华氏菌病品系；将获得的抗鮰爱德华氏菌品系作为亲本来繁育抗鮰爱德华氏菌的杂交黄颡鱼苗。
(6)抗菌性杂交黄颡鱼生产：分别将抗鮰爱德华氏菌黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼品系培育至性成熟，然后按照通用的鱼类人工繁殖方法，生产杂家黄颡鱼苗。
本发明提供的一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法，能培育黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼抗裂头病亲本，提高苗种及养殖过程中的裂头病发生率及死亡率，提高了养殖成活率，降低养殖过程中的抗生素及化学药物的使用；降低养殖成本。
采用本发明得到的杂交黄颡鱼苗(种)具有抗鮰爱德华氏菌病能力强、养殖成活率高、死亡率低、生长速度较快的特点，基本解决了普通黄颡鱼苗、杂交黄颡鱼苗等黄颡鱼苗种因感染鮰爱德华氏菌而爆发裂头病引起大量死亡的问题，适合在全国黄颡鱼养殖区域推广应用，将产生巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1本发明的选育流程图。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的技术方案。
1.抗鮰爱德华氏菌病黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼群体筛选：采用自然选择途径或人工感染途径筛选黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼抗鮰爱德华氏菌病的群体。按照图1的流程，具体事例如下：
(1)鮰爱德华氏菌病病源采集
①细菌分离鉴定
按照无菌操作要求对病原菌进行分离纯化。从患病黄颡鱼肝脏、肾脏和脑组织中取样，在BHI平板上划线，28℃恒温培养24～48h，挑取形态一致的优势菌落，进一步划线纯化，获得纯培养菌株，再转接到斜面培养基上，4℃保存备用。
然后按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌总DNA作为PCR模板。采用细菌通用引物进行PCR扩增。16S上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S下游引物：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'，引物由上海生物工程技术有限公司合成。PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。扩增产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，送生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定，测序结果经BlastN比对后，下载相似序列构建系统进化树，确定菌株种属地位。
②细菌毒力复壮
将冻存于-80℃冰箱的迟缓爱德华氏菌取100μl接种BHI平板，用接种环将菌液划开，放入28℃恒温培养箱培养24h。挑取单个菌落接种到BHI肉汤，28℃恒温120r/min条件下摇床振荡培养24h。培养24h取菌液1ml，12000r/min离心2min，收集菌体，0.85％生理盐水洗涤1次，并用1mL 0.85％生理盐水重悬。然后按照0.2ml/尾进行腹腔注射瓦氏黄颡鱼，感染后24h或48h后将瓦氏黄颡鱼处死，接种肝脏或肾脏组织到BHI平板，28℃培养24h后进行革兰氏染色检验纯度。染色检验正确后，挑取BHI平板上的单个菌落，重新接种到新的BHI平板上28℃恒温培养箱培养24h，进行细菌传代和保存。
③细菌大量培养及平板法细菌计数
挑取复壮BHI平板中的单个菌落接种至50mL的BHI肉汤中，放置在28℃，120r/min的摇床中振荡培养24h。吸取100μL菌液接种到BHI培养基，28℃恒温培养箱培养24h。挑取单菌落至试管中(三个重复)，28℃，120r/min振荡培养24h，取菌液1ml进行10倍梯度稀释，稀释浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，然后吸取10-3、10-4、10-5浓度的菌液300μl至平板中并左右晃动使其铺满整个平板，待液体吸干后，放入28℃恒温培养箱培养24h，计数每个平板上的细菌数量。
④半数致死浓度(LD50)实验
参考预试验的结果在100％死亡浓度和0％死亡浓度之间等比例设置6个试验组(每组10尾)，每尾鱼腹腔注射接种0.2ml菌液，各组接种剂量分别为：A、B、C、D、E、F，对照组每尾鱼腹腔注射接种等体积灭菌生理盐水，试验期为7d。采用改良寇氏法计算菌株对黄颡鱼的半数致死浓度(LD50)。实验期间水温控制在25℃左右。
当黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼鱼苗生长至3-12厘米时，进行人工感染实验，实验前一天停止投喂饲料，从每个家系中各随机选取7尾黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼个体，平均放到7个浓度梯度的鱼缸中，每个浓度梯度共32尾。用灭菌的PBS溶液把原菌液稀释到1.0OD，测得菌液浓度为4.33×109CFU/mL。将菌液分别按照不稀释、稀释50倍、100倍、500倍、1000倍和10000倍建立6个浓度梯度，另加一个对照组为灭菌PBS溶液，共7组进行感染，各组分别编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6和A7。按照病原菌感染黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼鱼苗的常规腹腔接种法进行鮰爱德华氏菌的感染。菌液剂量为0.2mL/10g体重。感染后观察鱼苗患病情况，记录鱼苗开始死亡时间和死亡鱼苗数量，统计鱼苗存活率。根据每个浓度梯度的死亡率，结合实际情况，计算出鮰爱德华氏菌对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼的半致死浓度LD50为3.69×105CFU/mL。
(2)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼的人工繁殖与培育：
在5月份，分别岷江宜宾段、沱江内江段采集野生性成熟的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼开展人工繁殖。瓦氏黄颡鱼第一次激素注射量为LRH-A2 20μg/Kg，第二次为LRH-A2 20μg+HCG2400IU+DOM 4mg/Kg。雄鱼一次注射，与雌鱼第二次注射同步进行，激素用量为雌鱼一半。可根据亲鱼的大小、性腺发育情况对注射剂量进行适当调节，以求获得最佳催产效果。
采用人工干法授精，水温28-30℃，8-10h进入效应期，按雌雄1-1.5:1配组，先杀死雄鱼取出精巢，剪碎放入研钵，将成熟卵挤入干燥的盛卵盆内，用7‰生理盐水将精巢液稀释后，加入盛卵盆内立即搅拌，使精卵充分接触完成受精后。将受精卵附到聚乙烯网片上，放入孵化池中进行孵化。分别繁殖7组瓦氏黄颡鱼和7组黄颡鱼。
仔苗孵出3-4d，取1200尾，移入培育池流水培育，以浮游动物为开口饵料，逐步诱食配合饲料。
(3)抗鮰爱德华氏菌黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼群体筛选：
将冻存于-80℃冰箱的迟缓爱德华氏菌取100μl接种BHI平板，用接种环将菌液划开，放入28℃恒温培养箱培养24h。挑取单个菌落接种到BHI肉汤，28℃恒温120r/min条件下摇床振荡培养24h。培养24h取菌液1ml，12000r/min离心2min，收集菌体，0.85％生理盐水洗涤1次，并用1mL 0.85％生理盐水重悬。然后按照0.2ml/尾进行腹腔注射瓦氏黄颡鱼，感染后24h或48h后将瓦氏黄颡鱼处死，接种肝脏或肾脏组织到BHI平板，28℃培养24h后进行革兰氏染色检验纯度。染色检验正确后，挑取BHI平板上的单个菌落，重新接种到新的BHI平板上28℃恒温培养箱培养24h，进行细菌传代和保存。
挑取复壮BHI平板中的单个菌落接种至50mL的BHI肉汤中，放置在28℃，120r/min的摇床中振荡培养24h。吸取100μL菌液接种到BHI培养基，28℃恒温培养箱培养24h。挑取单菌落至试管中(三个重复)，28℃，120r/min振荡培养24h，取菌液1ml进行10倍梯度稀释，稀释浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，然后吸取10-3、10-4、10-5浓度的菌液300μl至平板中并左右晃动使其铺满整个平板，待液体吸干后，放入28℃恒温培养箱培养24h，计数每个平板上的细菌数量。
人工感染前，将培养好的菌液以8000r/min的转速离心15min，每次离心后倒掉上清液，并用1×PBS吹洗，连续3次，最后测定OD600的菌液值，将菌液用1×PBS稀释到上步所得半致死浓度，进行感染。
在确定了鮰爱德华氏菌对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼半致死浓度后，从每个家系中随机抽取200尾个体，按照0.2mL/10g体重的剂量腹腔接种感染半致死浓度的菌液，并设置1次重复实验。实验时水温控制在(19±1)℃，每个家系实验用鱼独立养殖，保持正常的流水和通气。病原菌感染后每2h观察一次，记录每个家系实验鱼的体色变化、活动力大小、摄食强弱、有无发病症状和死亡时间等信息，及时捞出死鱼，测量其全长(从吻端到尾鳍末端)、体重，并剪取鳍条保存，在感染结束时，记录每个家系存活鱼的数目，测量每个个体全长和体重，并剪取少量鳍条保存。
将存活的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼培育性成熟，繁殖子二代，重复上述感染选择后，继续培养性成熟。
2.抗鮰爱德华氏菌黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼家系的选育:
将存活下来培养成熟的子二代黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼进行岷江群体和沱江群体的随机杂交，分别建立了10个黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼家系。当不同家系鱼苗生长至8-10厘米时，采用鮰爱德华氏菌对构建的家系鱼苗进行人工感染，比较不同家系鱼苗感染后的成活率，筛选出抗鮰爱德华氏菌病家系。将感染实验中成活率居前2-4名的家系的成活率作为确定抗病家系的数值，比如本发明中有2个家系的成活率在80％以上，所以选择成活率在80％以上的家系为抗病家系，而将成活率在30％-80％的家系确定为比较抗病家系，成活率为30％以下的定为不抗病家系。
从建立的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼家系中各选取10个家系进行感染，发现不同家系感染后的存活率显著不同。筛选出感染后成活率在80％以上的黄颡鱼家系2个，将其确定为抗病家系，其中存活率最高的家系其存活率为85％(1804号家系)，其次家系感染后存活率为83％(1807家系)，这2个抗病家系的存活率显著高于所有家系感染后的平均存活率58.5％(p<0.05)；筛选出感染后成活率在80％以上的瓦氏黄颡鱼家系2个，将其确定为抗病家系，其中存活率最高的家系其存活率为88％(1812号家系)，其次家系感染后存活率为81％(1817家系)，这2个抗病家系的存活率显著高于所有家系感染后的平均存活率52.7％(p<0.05)，结果如表1。
表1鮰爱德华氏菌感染黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼家系后的存活率
3.黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼抗鮰爱德华氏菌病品系的选育：
采用筛选到的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼抗病家系与其它养殖群体(四川养殖群体、广东养殖群体、浙江养殖群体)进行交配，建立抗病家系的后代家系；然后对获得的后代家系再次进行抗鮰爱德华氏菌感染的筛选，根据所有家系存活率的实际情况，将存活率位于前20％的抗病家系的后代家系定义为抗病品系。将获得的抗鮰爱德华氏菌病品系作为亲本来繁育抗鮰爱德华氏菌的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼苗种。将人工感染鮰爱德华氏菌后存活率高的家系以及混合养殖后成活率高的家系筛选出来培育成熟并作为亲本繁育后代，即可大量生产抗抗鮰爱德华氏菌的腹水病的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼优良苗种。
4.抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼苗的生产与应用：
将获得抗鮰爱德华氏菌病品系的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼鱼苗培育至性成熟，分别以黄颡鱼雌鱼为母本、瓦氏黄颡鱼雄鱼为父本，按照前述人工繁殖步骤生产抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼苗。
上述的结果表明，采用本发明技术生产的杂交黄颡鱼苗种具有抗鮰爱德华氏菌病能力强、养殖成活率高、死亡率低、生长速度较快的特点，基本解决了黄颡鱼苗种夏季因感染鮰爱德华氏菌而爆发腹水病引起大量死亡的问题，适合在黄颡鱼养殖场推广应用。
Claims (3)
1.一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法，其特征在于，包括以下的步骤：
(1)群体的采集：采集黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼，挑选种质纯正、性状优良的野生原种强化培育；
(2)子代繁育：将黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼培育成熟后，繁殖获得不同群体、纯种的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼鱼苗；
(3)抗病筛选：黄颡鱼裂头病患病季节，按照确定的鮰爱德华氏菌半致死浓度，采用浸泡法浸泡所有黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼种；浸泡3小时后，放回池塘自然养殖；10天后，死亡消失，保留存活的鱼；
(4)抗鮰爱德华氏菌群体选育：
将不同群体的黄颡鱼父本、母本相互杂交；
将不同群体的瓦氏鱼父本、母本相互杂交；
分别获得至少10个菌黄颡鱼家系和10个瓦氏黄颡鱼家系；
重复步骤(3)，对获得的后代家系再次进行抗鮰爱德华氏菌感染的筛选，将感染后存活率高的家系确定为抗鮰爱德华氏菌黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼品系；
(5)通过混合养殖鱼苗的成活率高低筛选抗病优良品系：
采用筛选到的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼抗病家系与其它群体的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼进行杂交，建立抗病家系的后代家系，当各家系鱼苗生长至8-10厘米时，每个家系取100尾鱼苗进行荧光标记，每个家系标记一种颜色，然后将标记了不同颜色的家系鱼苗混合养殖，混合养殖1年后进行体长、体重测量，统计存活鱼的数量，筛选出抗鮰爱德华氏菌病品系；将获得的抗鮰爱德华氏菌品系作为亲本来繁育抗鮰爱德华氏菌的杂交黄颡鱼苗；
(6)抗菌性杂交黄颡鱼生产：分别将抗鮰爱德华氏菌黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼品系培育至性成熟，然后按照通用的鱼类人工繁殖方法，生产杂家黄颡鱼苗。
2.根据权利要求1所述的一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法，其特征在于，步骤(1)中的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼采集自沱江野生群体、岷江野生群体。
3.根据权利要求1或2所述的一种抗鮰爱德华氏菌杂交黄颡鱼优良品系选育方法，其特征在于，步骤(4)中其它群体包括四川养殖群体、广东养殖群体、浙江养殖群体。
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