CN113841638A - 一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，涉及水产养殖的领域，包括：S1、选取不携带病毒的苗种培育后备亲本，通过疫苗免疫和定期病毒检测，确保培育的后备亲本不携带病毒；S2、筛选个体建康、成熟，且不携带病毒的后备亲本，并进行产前营养强化；S3、对亲本进行自然受精，受精卵采用浓度为20ppm‑50ppm的病毒灭活剂浸泡30min，随后孵化，孵化后对水花进行病毒检测；S4、对水花进行培育，培育期间定期病毒检测，结果为阴性即得大口黑鲈无病毒苗种。本申请采用先进的病原检测技术和病毒净化手段，可以杜绝病毒的引入和传播，提高大口黑鲈苗种的孵化率和成活率，有助于大口黑鲈无病毒苗种繁育技术的推广。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖的领域，尤其涉及一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus salmoides)又称加州鲈，隶属鲈形目，太阳鱼科、黑鲈属，是一种肉质鲜美、生长快、易起捕得名贵淡水鱼类。大口黑鲈自1983年引进我国，现已经推广到全国各地，2020年产量突破60万吨。但是随着大口黑鲈规模化集约化养殖得增加，其病害问题也越来越严重，现报道危害较大病原包括：大口黑鲈蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒，在养殖过程中一旦发生这些病毒性疾病，造成得死亡量非常大，经济损失惨重。同时，因病害频发增加了养殖过程中抗生素等药物使用量，导致药物残留超标等事件时有发生，从而引发重大的产品质量安全隐患，危害到人们生命健康。
调查研究发现，大口黑鲈苗种病毒携带率非常高，平均成活率只有10-20％，苗种已成为大口黑鲈养殖过程中，病毒病爆发的最大风险因素。目前我国的大口黑鲈苗种繁育，主要关注苗种的产卵率和孵化率，并没有从病害防控的层面进行生产管理，导致很多苗种企业，生产的种苗病毒携带率很高，培苗成活率低，产量不稳定。
为此，急需研究大口黑鲈的无病毒繁殖技术，减少病毒感染传播，以期提高大口黑鲈苗种的产量和质量。
发明内容
本发明提供了一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，从大口黑鲈的后备亲本开始病毒监测，以减少苗种繁育过程中病毒的引入和侵染，提高大口黑鲈苗种的产量和质量。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，具体包括以下步骤：
S1、病毒检测后选取不携带病毒的苗种培育后备亲本，通过疫苗免疫和定期病毒检测，淘汰携带病毒的全部苗种，获得不携带病毒的后备亲本；
S2、筛选个体建康、成熟且不携带病毒的后备亲本，并进行产前营养强化；
S3、对后备亲本进行自然受精，受精卵采用浓度为20ppm-50ppm的病毒灭活剂进行浸泡，浸泡时间为30min，随后进行孵化，随后对孵化后水花进行病毒检测，淘汰携带病毒水花；
S4、对水花进行培育，培育期间进行病毒检测，淘汰携带病毒的全部苗种，结果为阴性即得大口黑鲈无病毒苗种；
其中，所述病毒灭活剂包括聚维酮碘、大黄提取物、柠檬酸和乙二胺四二酸。
通过采用上述方案，对大口黑鲈的后备亲本进行病毒追踪，利用先进的病原检测技术，对后备亲本进行病毒筛选，在后备亲本培育阶段杜绝病毒通过遗传感染下一代，同时对亲本在产前进行营养强化，提高亲本自身抵抗病毒的免疫能力，对自然受精获得的受精卵进行病毒净化，在保证病毒和细菌杀灭的前提下，最大限度避免病毒灭活剂影响受精卵的孵化，提高苗种的孵化率和成活率，有助于大口黑鲈无病毒苗种繁殖技术的推广。
作为优选方案，所述病毒灭活剂包括以下重量份原料：
聚维酮碘：20份-30份；
大黄提取物：5份-10份；
柠檬酸：2份-3份；
乙二胺四二酸：0.2份-0.4份。
作为优选方案，在所述S1中，采用不携带病毒的人工配合饲料饲养后备亲本。
作为优选方案，在所述S2中，筛选不携带病毒的后备亲本包括每隔10天对后备亲本进行病毒检测，淘汰含有携带病毒的后备亲本的培育空间中全部苗种，病毒检测批次不少于3次。
通过采用上述方案，在后备亲本培育阶段，通过层层筛查病毒，杜绝病毒在后备亲本中的传播，避免病毒传染给下一代苗种。
作为优选方案，所述病毒包括大口黑鲈蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和弹状病毒中的一种或多种。
作为优选方案，在所述S2中，对亲本进行产前营养强化包括在人工配合饲料中添加0.3wt％-0.5wt％的营养强化剂，所述营养强化剂由复合维生素、黄芪多糖和N-氨甲酰谷氨酸按质量比为1：2：1的比例混合。
通过采用上述方案，由于亲本在产前处于繁育的生理周期，体内的能量消耗和需求大，若此时出现营养不良则会给病毒的入侵提供机会，通过营养强化剂进行产前营养化，可以提高亲本自身的免疫能力，同时提高下一代大口黑鲈苗种的个体健康程度，获得高质量、成活率高的大口黑鲈苗种。
作为优选方案，在所述S3中，所述水花孵化后先用丰年虫投喂，随后用人工配合饲料投喂，所述丰年虫和人工配合饲料投喂前经检测不携带病毒。
作为优选方案，在所述S4中，培育用水消毒处理，培育用工具和培育场所均采用50ppm-100ppm过氧化酸溶液消毒处理，所述培育用工具消毒时间为6h-8h，所述培育场所消毒时间为30min-60min，培育人员操作时手脚消毒，进入培育场所前替换消毒过的工作服和胶鞋。
作为优选方案，在所述S3中，所述亲本的自然受精包括以下步骤：
S01、制作鱼巢，并对所述鱼巢进行消毒处理；
S02、母本的性腺发育达到Ⅳ期卵巢，开始投放鱼巢，鱼巢架设在离池塘边1.5m-2m位置，入水深度50cm-60cm处，以供产卵。
作为优选方案，在所述S3中，所述鱼巢为50×30cm的长方形棕榈片，所述鱼巢使用前用浓度为5PPM的高锰酸钾溶液浸泡24小时以上，然后更换清水漂洗3次以上。
通过采用上述方案，采用自然受精的方式和采用鱼巢收集受精卵，便于集约化管理，提高收卵的工作效率。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
1、对大口黑鲈的后备亲本进行病毒监测，利用先进的病原检测技术，对后备亲本进行病毒筛选，同时对亲本在产前进行营养强化，提高亲本自身抵抗病毒的免疫能力，对自然受精繁育获得的受精卵进行病毒净化，提高苗种的孵化率和成活率，有助于大口黑鲈无病毒苗种的推广。
2、由于亲本在产前处于繁育的生理周期，体内的能量消耗和需求大，通过营养强化剂进行产前营养化，可以提高亲本自身的免疫能力，同时提高下一代大口黑鲈苗种的个体健康程度，获得高质量、成活率高的大口黑鲈苗种。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施案例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请发明实施例利用先进的病原检测技术无创筛选亲本，并通过亲本和苗种的病毒净化，配以严格的生物安保措施进行大口黑鲈无病毒苗种的繁育。主要包括以下几个步骤：大口黑鲈无病毒亲本的挑选，大口黑鲈亲鱼产前营养强化；大口黑鲈受精卵的病毒净化和孵化；大口黑鲈无病毒苗种的培育。采用本发明实施例繁育的大口黑鲈苗种不携带特定病毒，可以提升苗种培育成活率，提高大口黑鲈苗种的产量，有利于大口黑鲈产业的稳定健康发展。此外，本发明实施例方案操作简单易学，可以大规模推广，特别适合工厂化车间、高密度大口黑鲈苗种繁育。
制备例一
一种病毒灭活剂，包括以下原料组分：
聚维酮碘：20g；
大黄提取物：10g；
柠檬酸：2g；
乙二胺四二酸：0.2g。
制备例二
一种病毒灭活剂，包括以下原料组分：
聚维酮碘：30g；
大黄提取物：5g；
柠檬酸：3g；
乙二胺四二酸：0.4g。
实施例一
一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，具体包括以下步骤：
1、大口黑鲈无病毒后备亲本培育；
1.1、场地的选择：
进行后备亲本培育的养殖场，选择在水源独立，周围无其他养殖场区域，远离大口黑鲈苗种繁育和成鱼养殖区域，本方案于2017年选择惠州某大口黑鲈养殖场作为繁育地点，近3年未发生过大口黑鲈病毒案例。
1.2、大口黑鲈后备亲本培育前准备及管理：
1)检测用于培育后备亲本的苗种是否携带大口黑鲈蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和弹状病毒，确定检测结果为阴性即不携带病毒，随后用传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒二联灭活疫苗和蛙虹彩病毒灭活疫苗对后备亲本苗种实施免疫；
2)各功能区生产工具独立，所有生产鱼塘和生产工具严格消毒后方可使用，养殖全程不使用鲜活饵料，所有投入品检测病毒均为阴性。
1.3、病毒检测：
每个月每个鱼塘随机挑选30尾后备亲本苗种进行病毒检测，淘汰含有检测结果为阳性的鱼塘中的后备亲本，并对阳性鱼塘和鱼塘中后备亲本进行应急处置，保留检测结果均为阴性鱼塘中的后备亲本。
2、无病毒后备亲本的筛选和营养强化
2.1、后备亲本的筛选
1)选择无特定病毒性疾病发病史，规格要求体重650g以上，个体均匀、体质健壮，无明显体表畸形，作为待选后备亲本；
2)随机挑选30尾待选后备亲本，用拭子从肠道采集样品，用数字PCR检测方法每10天进行病毒检测，淘汰检测结果呈阳性的鱼塘中后备亲本，要求后备亲本暂养时间不低于30天，病毒检测次数不低于3批次，且病毒检测结果呈阴性，最终共选择了7000尾无病毒后备亲本。
2.2、大口黑鲈亲本产前营养强化
1)经过严格筛选获得的亲本，在繁殖配对前，还需要再次进行病毒核酸检测，病毒检测结果需均呈阴性，按照雌雄比例为1：1.2挑选性腺发育较成熟、个体均匀、体质健壮、无明显畸形、体表无损伤的亲本个体；
2)选择产卵池塘面积以5-8亩为宜，池塘水深1.5米以上，放养密度400尾/亩,待产亲本的培育水温为18～24℃，亲本的饲料日投喂量为亲本总体重的3％，并在人工配合饲料中补充营养强化剂，人工配合饲料中按重量添加0.5％的营养强化剂，营养强化剂由复合维生素、黄芪多糖和N-氨甲酰谷氨酸(NCG)按质量比为1：2：1的比例混合。
3、大口黑鲈的自然受精、受精卵病毒净化和孵化
3.1、亲本的产卵
1)当进入到繁殖季节，用流水对大口黑鲈亲本进行冲击刺激，以促进性腺发育；
2)制作鱼巢，鱼巢为50×30cm的长方形棕榈片，鱼巢使用前用浓度为5PPM高锰酸钾溶液浸泡24小时以上，然后更换清水漂洗3次以上；
3)监测亲本的性腺发育情况，母本的性腺发育达到Ⅳ期卵巢，就开始投放鱼巢，鱼巢架设在离池塘边1.5m-2m位置，用竹竿插入塘底，使用绑绳拴住鱼巢，垂直于水体，入水深度50cm-60cm处，以供产卵。
3.2、受精卵的病毒净化
将产卵池内附着有受精卵的鱼巢棕榈片，转运至制备例一获得的浓度为50ppm的病毒灭活剂中浸泡净化30min，然后清水漂清后转运至孵化池。
3.3、受精卵的孵化
1)孵化用水选择经过沉淀、过滤、消毒后的储备用水，孵化池的溶氧要求24h不低于8mg/L，水温控制在20℃-25℃，共孵化了35批次的受精卵，共孵化体长规格为0.5-1.0cm的大口黑鲈水花约1亿尾，孵化率达到了90％以上；
2)受精卵孵化72h后，每个孵化池采集300尾以上的水花进行病毒检测，检测结果呈阴性的孵化池内水花即可出售或转运至培育池进行苗种培育，淘汰检测结果呈阳性的孵化池中的水花，并进行无害化处理，本方案中的水花经病毒检测无毒率为100％。
4、大口黑鲈无病毒苗种的培育
1)选取100万水花全程在封闭的车间中完成培育，所使用养殖用水都经过严格消毒处理；
2)所用培育池在使用前，均经严格消毒，消毒方法为将培育池冲洗干净后，用100ppm的过氧化酸溶液全面泼洒消毒60分钟；
3)所用工具、气管、气石在使用前用100ppm的过氧化酸溶液浸泡8个小时，冲洗干净后备用；
4)培育人员进入车间操作前要换上干净的工作服和车间专用的胶鞋，手脚用消毒液消毒；
5)培育用开口饵料前期采用不携带病毒的丰年虫进行饲养，随着苗种的生长，逐步调整为人工配合饲料为饵料，所有饵料必须经过检测确定不携带病毒才能进入车间投喂；
6)培育50天后，获得体长为3cm-5cm的大口黑鲈苗种41万尾，经统计成活率为41％，检测大口黑鲈苗种的病毒结果为阴性，即得大口黑鲈无病毒苗种。
实施例二
一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，具体包括以下步骤：
1、大口黑鲈无病毒后备亲本培育；
1.1、场地的选择：
进行后备亲本培育的养殖场，选择在水源独立，周围无其他养殖场的区域，远离大口黑鲈苗种繁殖和成鱼养殖区域，本方案于2020年选择广州市增城区某大口黑鲈养殖场作为繁育监测地点，该养殖场环境偏僻独立，周围无其他养殖户，近3年未发生过大口黑鲈病毒案例。
1.2、大口黑鲈后备亲本培育前准备及管理：
1)检测用于培育后备亲本的苗种是否携带大口黑鲈蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和弹状病毒，确定检测结果为阴性即不携带病毒，随后用针对特定病毒的疫苗对用于后备亲本培育的苗种实施免疫；
2)各功能区生产工具独立，所有生产鱼塘和生产工具严格消毒后方可使用，养殖全程不使用鲜活饵料，所有投入品检测病毒均为阴性。
1.3、病毒检测：
每个月每个鱼塘随机挑选30尾后备亲本苗种进行病毒检测，淘汰含有检测结果为阳性的鱼塘中的后备亲本，并对阳性鱼塘及其中的后备亲本进行应急处置，保留检测结果均为阴性的鱼塘中的后备亲本。
2、无病毒后备亲本的筛选和营养强化
2.1、后备亲本的筛选
1)选择无病毒性疾病发病史，规格要求体重650g以上，个体均匀、体质健壮，无明显体表畸形，作为待选后备亲本；
2)随机挑选30尾待选后备亲本，用拭子从肠道采集样品，用数字PCR检测方法每10天进行病毒检测，淘汰检测结果呈阳性的的鱼塘中的后备亲本，要求后备亲本暂养时间不低于30天，病毒检测次数不低于3批次，且病毒检测结果呈阴性，最终共选择了15000尾无病毒后备亲本。
1.3、大口黑鲈亲本产前营养强化
1)经过严格筛选获得的亲本，在繁殖配对前还需要再次进行病毒检测，病毒检测结果需均呈阴性，按照雌雄比例为1：1.2挑选性腺发育较成熟、个体均匀、体质健壮、无明显畸形、体表无损伤的亲本个体；
2)选择产卵池塘面积以5-8亩为宜，池塘水深1.7米以上，放养密度500尾/亩,待产亲本的培育水温为18～24℃，亲本的饲料日投喂量为亲本总体重的5％，并在人工配合饲料中补充营养强化剂，人工配合饲料中按重量添加0.3％的营养强化剂，营养强化剂由复合维生素、黄芪多糖和N-氨甲酰谷氨酸(NCG)按质量比为1：2：1的比例混合。
3、大口黑鲈的自然受精、受精卵病毒净化和孵化
3.1、亲本的产卵
1)当进入到繁殖季节，用流水对大口黑鲈亲本进行冲击刺激，以促进性腺发育；
2)制作鱼巢，鱼巢为50×30cm的长方形棕榈片，鱼巢使用前用浓度为5PPM高锰酸钾溶液浸泡24小时以上，然后更换清水漂洗3次以上；
3)监测亲本的性腺发育情况，母本的性腺发育达到Ⅳ期卵巢，就开始投放鱼巢，鱼巢架设在离池塘边1.5m-2m位置，用竹竿插入塘底，使用绑绳拴住鱼巢，垂直于水体，入水深度50cm-60cm处，以供产卵。
3.2、受精卵的病毒净化
将产卵池内附着有受精卵的鱼巢棕榈片，转运至制备例二获得的浓度为20ppm的病毒灭活剂中浸泡30min，然后清水漂清后转运至孵化池。
3.3、受精卵的孵化
1)孵化用水选择经过沉淀、过滤、消毒后的储备用水，孵化池的溶氧要求24h不低于8mg/L，水温控制在20℃-25℃，共孵化了35批次的受精卵，共孵化体长规格为0.5-1.0cm的大口黑鲈水花约1.2亿尾，孵化率达到90％以上；
2)受精卵孵化72h后，每个孵化池采集300尾以上的大口黑鲈水花进行病毒检测，检测结果呈阴性的孵化池内水花即可出售或转运至培育池进行苗种培育，淘汰含有检测结果呈阳性的孵化池中的水花，并进行无害化处理，本方案中的水花经病毒检测无毒率为100％。
4、大口黑鲈无病毒苗种的培育
1)选取20万水花全程在封闭的车间中完成培育，所有的养殖用水都经过严格消毒处理；
2)所用培育池在使用前，均经严格消毒，消毒方法为将培育池冲洗干净后，用50ppm的过氧化酸溶液全面泼洒消毒30分钟；
3)所有工具、气管、气石在使用前用50ppm的过氧化酸溶液浸泡6个小时，冲洗干净后备用；
4)培育人员进入车间操作前要换上干净的工作服和车间专用的胶鞋，手脚用消毒液消毒；
5)培育用开口饵料前期采用不携带病毒的丰年虫进行饲养，随着苗种的生长，逐步调整为人工配合饲料为饵料，所有饵料必须经过检测确定不携带病毒才能进入车间投喂；
6)培育52天后，获得体长为3.5cm-4.5cm的大口黑鲈苗种11.1万尾，经统计成活率为55.5％，检测大口黑鲈苗种的病毒结果为阴性，即得大口黑鲈无病毒苗种。
效果验证试验
本申请采用不同浓度的病毒灭活剂和浸泡时间依次对500个大口黑鲈受精卵进行试验，以比较验证不同病毒灭活剂浓度和浸泡时间对大口黑鲈受精卵孵化效果的影响，试验结果如下：
表1-不同浓度的病毒灭活剂和浸泡时间对受精卵孵化率的影响
由表1可知，高浓度的病毒灭活剂和过长时间的浸泡时间会降低大口黑鲈受精卵的孵化率，因此，本申请采用浓度为20ppm和50ppm的病毒灭活剂对大口黑鲈受精卵进行30min浸泡，浸泡的时候保证溶氧充足，可以获得保证大口黑鲈受精卵的孵化率达到90％以上，满足繁育的要求。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、病毒检测后选取不携带病毒的苗种培育后备亲本，通过疫苗免疫和定期病毒检测，淘汰携带病毒的全部苗种，获得不携带病毒的后备亲本；
S2、筛选个体建康、成熟且不携带病毒的后备亲本，并进行产前营养强化；
S3、对亲本进行自然受精，受精卵采用浓度为20ppm-50ppm的病毒灭活剂进行浸泡，浸泡时间为30min，随后进行孵化，随后对孵化后水花进行病毒检测，淘汰携带病毒水花；
S4、对水花进行培育，培育期间进行病毒检测，淘汰携带病毒的全部苗种，结果为阴性即得大口黑鲈无病毒苗种；
其中，所述病毒灭活剂包括聚维酮碘、大黄提取物、柠檬酸和乙二胺四二酸。
2.如权利要求1所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，所述病毒灭活剂包括以下重量份原料：
聚维酮碘：20份-30份；
大黄提取物：5份-10份；
柠檬酸：2份-3份；
乙二胺四二酸：0.2份-0.4份。
3.如权利要求1所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S1中，采用不携带病毒的人工配合饲料饲养后备亲本。
4.如权利要求1所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S2中，筛选不携带病毒的后备亲本包括每隔10天对后备亲本进行病毒检测，淘汰含有携带病毒的后备亲本的培育空间中全部苗种，病毒检测批次不少于3次。
5.如权利要求1所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，所述病毒包括大口黑鲈蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和弹状病毒中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S2中，对亲本进行产前营养强化包括在人工配合饲料中添加0.3wt％-0.5wt％的营养强化剂，所述营养强化剂由复合维生素、黄芪多糖和N-氨甲酰谷氨酸按质量比为1：2：1的比例混合。
7.如权利要求1所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S3中，所述水花孵化后先用丰年虫投喂，随后用人工配合饲料投喂，所述丰年虫和人工配合饲料投喂前经检测不携带病毒。
8.如权利要求1所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S4中，培育用水消毒处理，培育用工具和培育场所均采用50ppm-100ppm过氧化酸溶液消毒处理，所述培育用工具消毒时间为6h-8h，所述培育场所消毒时间为30min-60min，培育人员操作时手脚消毒，进入培育场所前替换消毒过的工作服和胶鞋。
9.如权利要求1所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S3中，所述后备亲本的自然受精包括以下步骤：
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10.如权利要求9所述的一种大口黑鲈无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S3中，所述鱼巢为50×30cm的长方形棕榈片，所述鱼巢使用前用浓度为5ppm的高锰酸钾溶液浸泡24小时以上，然后更换清水漂洗3次以上。
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