CN109496914B - 一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法 - Google Patents
一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法，包括亲鱼选择、亲鱼驯养、人工受精、受精卵孵化和幼体培育5个步骤。本发明通过不断改变和优化日本七鳃鳗的人工繁育条件，解决了包括亲鱼选择、亲鱼驯养、人工受精、受精卵孵化、幼体培育及病害防治等过程中涉及的一系列问题，实现了胚胎和苗种规模化生产，为科研及规模化养殖日本七鳃鳗创造了条件。此外，发明有利于保护这一濒危物种，也为其他洄游性鱼类难以人工繁育问题的解决提供一定的参考。
Description
技术领域
本发明涉及七鳃鳗的养殖技术领域，更具体地，涉及一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法。
背景技术
日本七鳃鳗(Lethenteron japonicum)为七鳃鳗科七鳃鳗属的水生动物，体型狭长，体长40～60cm，重量300～500g。分布于太平洋北部、南至日本朝鲜沿岸、北至阿拉斯加及黑龙江水系。日本七鳃鳗繁殖地及其幼体的栖息地均在我国东北地区(虽然被称为日本七鳃鳗)，是我国的一种珍惜濒危野生水生生物。日本七鳃鳗是最原始的无颌类脊椎动物，距今已有5亿年历史，具有非常重要的应用价值。
日本七鳃鳗肌肉中可检测出15种脂肪酸，不饱和脂肪酸的总量高，而且碳链较短，易被吸收，具有重要的营养价值，且肌肉中谷氨酸的含量丰富。其维生素A的含量比一般鱼类高，特别是维生素B1与维生素B12的含量远高于其他鱼类。作为一种美食，欧洲的上流社会从中世纪就视七鳃鳗为珍馐。在南欧的部分国家以及东亚的韩国等，其是一道昂贵的名菜，味道鲜美，风味极佳。
日本七鳃鳗也有很好的药用价值，主治滋补壮阳、夜盲症、角膜干燥，口眼歪斜等。此外，在其他方面日本已经开发出以七鳃鳗油为主要原料的保健品，现已上市，对明目具有很好的作用。
此外，日本七鳃鳗体内含有一种独特的抗原识别受体可变淋巴细胞受体(VLR)，具有很广阔的应用前景，比如抗原识别灵敏性高及治疗免疫性疾病等。其作为最原始的无颌类脊椎动物，被称为“活化石”，是研究脊椎动物进化的关键物种，也是研究脊椎动物胚胎发育，器官分化等的最佳模型。
但是，由于过度捕捞，加上多年来生态环境的改变，日本七鳃鳗的数量一直在减少，目前已列入中国濒危鱼类目录，成为我国珍惜濒危水生野生动物之一。实现日本七鳃鳗的人工繁育有助于解决这一问题，但该工作存在着很多的技术难题。这是因为日本七鳃鳗与陆封型东北七鳃鳗有很大不同：(1)两者的胚胎发育阶段不同(表1)；(2)日本七鳃鳗属于江海洄游性鱼类，在海洋中生长但需要在淡水中才能繁殖，洄游性鱼类由于生活史非常复杂，其人工繁育一直非常具有难度，至今仍有很多江海洄游性鱼类无法被成功人工繁育；(3)日本七鳃鳗对环境质量要求又很苛刻。因此日本七鳃鳗的人工繁育同样具有比较大的难度，目前还没有人工成功繁育日本七鳃鳗的报道。
此外，日本七鳃鳗会经历一个变态发育的过程，消化系统等会发生变化，其幼年和成年的习性和生活区域有很大的差别，更进一步造成了日本七鳃鳗人工繁育的困难。
表1：
发明内容
本发明的目的是为了克服目前日本七鳃鳗无法进行人工繁育的难题，提供一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种日本七鳃鳗的人工繁育方法，包括以下步骤：
S1.亲鱼选择：1月份，捕捞并筛选活力好且未受损伤、体重为300～500g且性腺发育良好的日本七鳃鳗作为亲本，以数量计，按雌鱼：雄鱼＝2:1～5:1配组；
S2.亲鱼驯养：驯养用水经过除氯和爆气处理，每天换水一次，光/暗周期为9/15～13/11h，所有材料均需要保证不携带致病菌，不需要给食；
S3.人工受精：先轻柔按摩挤压雌鱼腹部，将卵细胞挤入干净的容器中，再将雄鱼的精液挤到有卵细胞的容器中，注入无菌水轻轻摇匀，静置5～20min使精子和卵子充分受精，然后再用无菌水轻轻冲洗掉多余的精子；
S4.受精卵孵化：15～20℃恒温孵化，500～1000lux光照强度，9/15～13/11h光/暗周期，5～10盐度，每天换水一次并及时清除死卵，并加入抗生素；
S5.幼体培育：刚破膜孵化出的尾芽日本七鳃鳗置于有循环流水系统的15～20℃恒温饲养环境中，培育15～20天，至其体内卵黄吸收完毕，消化系统发育成熟，开始投喂酵母50～100μg/条，每1～3天投喂一次，每天换水一次，获得日本七鳃鳗幼体。
优选地，步骤S1中，捕捞并筛选体重为350g的日本七鳃鳗作为亲本。
优选地，步骤S1中，在黑龙江进行捕捞。
优选地，步骤S1中，所述捕捞方法为日本七鳃鳗亲本数量雌鱼：雄鱼＝3:1。
优选地，步骤S2中，保留运输后状态良好的亲本进行驯养。
优选地，步骤S2中，换水时保留原来一半体积的水，同时加入等体积的水。
优选地，步骤S2中，驯养前驯养环境消毒灭菌。
优选地，步骤S2中，驯养期间每周对亲鱼进行杀菌消毒处理。
更优选地，步骤S2中，驯养期间每周对亲鱼进行盐浴杀菌消毒处理。
优选地，步骤S2中，所述光/暗周期为12/12h。
优选地，步骤S3中，静置10min使精子和卵子充分受精。
优选地，步骤S3中，亲鱼培育半年，6月份左右待亲鱼性成熟后，开始进行人工授精。
优选地，步骤S4中，孵化温度为17℃。
优选地，步骤S4中，孵化光照强度为800lux。
优选地，步骤S4中，光/暗周期为12/12h。
优选地，步骤S4中，盐度为8。
优选地，步骤S4中，所述抗生素为链霉素和青霉素，，使用浓度分别为0.1～0.3mg/ml和50～200U/ml。。
更优选地，步骤S4中，链霉素和青霉素的使用浓度分别为0.2mg/ml和100U/ml。
优选地，步骤S5中，17℃恒温饲养环境培育。
优选地，步骤S5中，投喂酵母50μg/条，每2天投喂一次。
优选地，步骤S5中，培育15天开始投喂酵母。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过不断改变和优化日本七鳃鳗的人工繁育条件，解决了包括亲鱼选择、亲鱼驯养、人工受精、受精卵孵化、幼体培育及病害防治等过程中涉及的一系列问题，实现了胚胎和苗种规模化生产，为科研及规模化养殖日本七鳃鳗创造了条件。此外，发明有利于保护这一濒危物种，也为其他洄游性鱼类难以人工繁育问题的解决提供一定的参考。
附图说明
图1为本发明一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法
一、繁育方法
包括以下步骤：
S1.亲鱼选择
日本七鳃鳗的繁育季节为5～7月份，但在1月份就应该开始采捕，具体方法是在黑龙江上破冰下网捕获，2天后起网，筛选活力好且未受损伤的日本七鳃鳗，复筛再从中选择体重在350g左右且性腺发育良好的雌性和雄性日本七鳃鳗作为亲本，亲鱼按雌鱼：雄鱼＝3:1配组。
S2.亲鱼驯养
从东北地区空运至本实验室的日本七鳃鳗先挑选出因运输或相互撕咬造成伤害的日本七鳃鳗，然后将状态良好的日本七鳃鳗放入消毒灭菌后的专用培育箱中，培育用水经过除氯和爆气处理，换水时保留原来一半体积的水，同时加入等体积的水，每天换水一次。培育箱中持续并保持充足的供氧。光照条件通过日光灯控制，光/暗周期为12/12h。由于日本七鳃鳗在繁殖期即停止进食，因此不需要给食。亲鱼培育期间每周对其进行盐浴杀菌消毒处理。亲鱼培育的整个环节和过程中涉及的所有材料均需要保证不携带致病菌。
S3.人工受精
亲鱼培育半年，6月份左右待亲鱼性成熟后，开始进行人工授精。性成熟的雌性日本七鳃鳗腹部开始变得饱满，雄性日本七鳃鳗则出现好动的特点。人工受精开始时，先轻柔按摩挤压雌性日本七鳃鳗腹部，将卵细胞挤入干净的结晶皿中，再将雄性日本七鳃鳗的精液挤到有卵细胞的结晶皿中，注入无菌水轻轻摇匀，静置10min使精子和卵子充分受精，然后再用无菌水轻轻冲洗结晶皿中多余的精子。
S4.受精卵孵化
日本七鳃鳗受精卵的孵化条件与东北七鳃鳗有很大的不同，经过团队大量的研究，确定了日本七鳃鳗受精卵适宜条件：即温度为17℃，光照强度为800lux，光照周期12/12h，盐度为8。每天换水一次并及时清除死卵，并加入链霉素和青霉素防止染菌，使用浓度分别为0.2mg/ml和100U/ml。
S5.幼体培育
刚破膜孵化出的尾芽日本七鳃鳗置于有循环流水系统的17℃恒温饲养箱中，培养15天后，待其体内卵黄吸收完毕，消化系统发育成熟，开始投喂酵母50μg/条，每2天投喂一次，每天换水一次，保持饲养箱清洁，从而获得日本七鳃鳗幼体。
统计日本七鳃鳗的受精率、孵化率和成活率。
二、结果
结果如表1所示，受精率为80％、孵化率为50％和成活率为78％，获得了很好的繁育效果。
实施例2一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法
一、繁育方法
包括以下步骤：
S1.亲鱼选择
日本七鳃鳗的繁育季节为5～7月份，但在1月份就应该开始采捕，具体方法是在黑龙江上破冰下网捕捞，2天后起网，筛选活力好且未受损伤的日本七鳃鳗，复筛再从中选择体重在500g左右且性腺发育良好的雌性和雄性日本七鳃鳗作为亲本，亲鱼按雌鱼：雄鱼＝4:1配组。
S2.亲鱼驯养
从东北地区空运至本实验室的日本七鳃鳗先挑选出因运输或相互撕咬造成伤害的日本七鳃鳗，然后将状态良好的日本七鳃鳗放入消毒灭菌后的专用培育箱中，培育用水经过除氯和爆气处理，换水时保留原来一半体积的水，同时加入等体积的水，每天换水一次。培育箱中持续并保持充足的供氧。光照条件通过日光灯控制，光/暗周期为12/12h。由于日本七鳃鳗在繁殖期即停止进食，因此不需要给食。亲鱼培育期间每周对其进行盐浴杀菌消毒处理。亲鱼培育的整个环节和过程中涉及的所有材料均需要保证不携带致病菌。
S3.人工受精
亲鱼培育半年，6月份左右待亲鱼性成熟后，开始进行人工授精。雌性日本七鳃鳗腹部开始变得饱满，雄性日本七鳃鳗则出现好动的特点。人工受精开始时，先轻柔按摩挤压雌性日本七鳃鳗腹部，将卵细胞挤入干净的结晶皿中，再将雄性日本七鳃鳗的精液挤到有卵细胞的结晶皿中，注入无菌水轻轻摇匀，静置10min使精子和卵子充分受精，然后再用无菌水轻轻冲洗结晶皿中多余的精子。
S4.受精卵孵化
日本七鳃鳗受精卵的孵化条件与东北七鳃鳗有很大的不同，经过团队大量的研究，确定了日本七鳃鳗受精卵适宜条件：即温度为15℃，光照强度为500lux，光照周期12/12h，盐度为5。每天换水一次并及时清除死卵，并加入链霉素和青霉素防止染菌，使用浓度分别为0.1mg/ml和200U/ml。
S5.幼体培育
刚破膜孵化出的尾芽日本七鳃鳗置于有循环流水系统的15℃恒温饲养箱中，培养15天后，待其体内卵黄吸收完毕，消化系统发育成熟，开始投喂酵母100μg/条，每1天投喂一次，每天换水一次，保持饲养箱清洁，从而获得日本七鳃鳗幼体。
统计日本七鳃鳗的受精率、孵化率和成活率。
二、结果
结果如表1所示，受精率为68％、孵化率为45％和成活率为65％，获得了很好的繁育效果。
实施例3一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法
一、繁育方法
包括以下步骤：
S1.亲鱼选择
日本七鳃鳗的繁育季节为5～7月份，但在1月份就应该开始采捕，具体方法是在黑龙江上破冰下网捕捞，2天后起网筛选活力好且未受损伤的日本七鳃鳗，复筛再从中选择体重在300g左右且性腺发育良好的雌性和雄性日本七鳃鳗作为亲本，亲鱼按雌鱼：雄鱼＝2:1配组。
S2.亲鱼驯养
从东北地区空运至本实验室的日本七鳃鳗先挑选出因运输或相互撕咬造成伤害的日本七鳃鳗，然后将状态良好的日本七鳃鳗放入消毒灭菌后的专用培育箱中，培育用水经过除氯和爆气处理，换水时保留原来一半体积的水，同时加入等体积的水，每天换水一次。培育箱中持续并保持充足的供氧。光照条件通过日光灯控制，光/暗周期为9/15h。由于日本七鳃鳗在繁殖期即停止进食，因此不需要给食。亲鱼培育期间每周对其进行盐浴杀菌消毒处理。亲鱼培育的整个环节和过程中涉及的所有材料均需要保证不携带致病菌，使用浓度分别为0.3mg/ml和50U/ml。
S3.人工受精
亲鱼培育半年，6月份左右待亲鱼性成熟后，开始进行人工授精。性成熟的雌性日本七鳃鳗腹部开始变得饱满，雄性日本七鳃鳗则出现好动的特点。人工受精开始时，先轻柔按摩挤压雌性日本七鳃鳗腹部，将卵细胞挤入干净的结晶皿中，再将雄性日本七鳃鳗的精液挤到有卵细胞的结晶皿中，注入无菌水轻轻摇匀，静置10min使精子和卵子充分受精，然后再用无菌水轻轻冲洗结晶皿中多余的精子。
S4.受精卵孵化
日本七鳃鳗受精卵的孵化条件与东北七鳃鳗有很大的不同，经过团队大量的研究，确定了日本七鳃鳗受精卵适宜条件：即温度为20℃，光照强度为1000lux，光照周期9/15h，盐度为10。每天换水一次并及时清除死卵，并加入链霉素和青霉素防止染菌。
S5.幼体培育
刚破膜孵化出的尾芽日本七鳃鳗置于有循环流水系统的20℃恒温饲养箱中，培养15～20天后，待其体内卵黄吸收完毕，消化系统发育成熟，开始投喂酵母50μg/条，每2天投喂一次，每天换水一次，保持饲养箱清洁，从而获得日本七鳃鳗幼体。
统计日本七鳃鳗的受精率、孵化率和成活率。
二、结果
结果如表1所示，受精率为59％、孵化率为43％和成活率为67％，获得了很好的繁育效果。
实施例4一种野生日本七鳃鳗的人工繁育方法
一、繁育方法
包括以下步骤：
S1.亲鱼选择
日本七鳃鳗的繁育季节为5～7月份，但在1月份就应该开始采捕，具体方法是在黑龙江上破冰下网捕捞，2天后起网筛选活力好且未受损伤的日本七鳃鳗，复筛再从中选择体重在350g左右且性腺发育良好的雌性和雄性日本七鳃鳗作为亲本，亲鱼按雌鱼：雄鱼＝5:1配组。
S2.亲鱼驯养
从东北地区空运至本实验室的日本七鳃鳗先挑选出因运输或相互撕咬造成伤害的日本七鳃鳗，然后将状态良好的日本七鳃鳗放入消毒灭菌后的专用培育箱中，培育用水经过除氯和爆气处理，换水时保留原来一半体积的水，同时加入等体积的水，每天换水一次。培育箱中持续并保持充足的供氧。光照条件通过日光灯控制，光/暗周期为13/11h。由于日本七鳃鳗在繁殖期即停止进食，因此不需要给食。亲鱼培育期间每周对其进行盐浴杀菌消毒处理。亲鱼培育的整个环节和过程中涉及的所有材料均需要保证不携带致病菌。
S3.人工受精
性成熟的雌性日本七鳃鳗腹部开始变得饱满，雄性日本七鳃鳗则出现好动的特点。人工受精开始时，先轻柔按摩挤压雌性日本七鳃鳗腹部，将卵细胞挤入干净的结晶皿中，再将雄性日本七鳃鳗的精液挤到有卵细胞的结晶皿中，注入无菌水轻轻摇匀，静置10min使精子和卵子充分受精，然后再用无菌水轻轻冲洗结晶皿中多余的精子。
S4.受精卵孵化
日本七鳃鳗受精卵的孵化条件与东北七鳃鳗有很大的不同，经过团队大量的研究，确定了日本七鳃鳗受精卵适宜条件：即温度为17℃，光照强度为800lux，光照周期13/11h，盐度为5。每天换水一次并及时清除死卵，并加入链霉素和青霉素防止染菌，使用浓度分别为0.2mg/ml和100U/ml。
S5.幼体培育
刚破膜孵化出的尾芽日本七鳃鳗置于有循环流水系统的17℃恒温饲养箱中，培养15天后，待其体内卵黄吸收完毕，消化系统发育成熟，开始投喂酵母100μg/条，每1天投喂一次，每天换水一次，保持饲养箱清洁，从而获得日本七鳃鳗幼体。
二、结果
结果如表2所示，受精率为59％、孵化率为43％和成活率为67％，获得了很好的繁育效果。
表2：
| 实施例 | 受精率(％) | 孵化率(％) | 成活率(％) |
| 1 | 80 | 50 | 78 |
| 2 | 68 | 45 | 65 |
| 3 | 59 | 43 | 67 |
| 4 | 70 | 50 | 69 |
对比例
以下各组对比例的方法与实施例1基本相同，不同之处在于：
组1：用于人工繁殖的日本七鳃鳗亲鱼状态不好。
组2：日本七鳃鳗精子和卵子受精时间低于10min。
组3：受精卵没有及时换水和清理死卵。
组4：水中未加入链霉素和青霉素防菌。
组5：破膜的幼体20天后投喂饵料。
组6：日本七鳃鳗幼鱼投喂蛋黄而不是投喂酵母。
本发明对上述6组对比例所得到的日本七鳃鳗的受精率、孵化率、成活率这三种指标也进行了统计，结果如表3所示。
表3：
| 组别 | 受精率(％) | 孵化率(％) | 成活率(％) |
| 1 | 5 | 30 | 10 |
| 2 | 60 | 50 | 30 |
| 3 | 80 | 30 | 35 |
| 4 | 85 | 20 | 25 |
| 5 | 88 | 65 | 40 |
| 6 | 80 | 60 | 45 |
Claims (2)
1.一种日本七鳃鳗的人工繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.亲鱼选择：1月份，捕捞并筛选活力好且未受损伤、体重为300～500g且性腺发育良好的日本七鳃鳗作为亲本，以数量计，按雌鱼：雄鱼＝3：1配组；
S2.亲鱼驯养：驯养用水经过除氯和爆气处理，每天换水一次，光/暗周期为12/12h，所有材料均需要保证不携带致病菌，不需要给食；
S3.人工受精：先轻柔按摩挤压雌鱼腹部，将卵细胞挤入干净的容器中，再将雄鱼的精液挤到有卵细胞的容器中，注入无菌水轻轻摇匀，静置10min使精子和卵子充分受精，然后再用无菌水轻轻冲洗掉多余的精子；
S4.受精卵孵化：17℃恒温孵化，800lux光照强度，12/12h光/暗周期，8盐度，每天换水一次并及时清除死卵，并加入抗生素；
S5.幼体培育：刚破膜孵化出的尾芽日本七鳃鳗置于有循环流水系统的17℃恒温饲养环境中，培育1天，至其体内卵黄吸收完毕，消化系统发育成熟，开始投喂酵母50μg/条，每2天投喂一次，每天换水一次，获得日本七鳃鳗幼体。
2.根据权利要求1所述的人工繁育方法，其特征在于，步骤S4中，所述抗生素为链霉素和青霉素，使用浓度分别为0.1～0.3mg/ml和50～200U/ml。
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