CN113841636A - 一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法 - Google Patents

一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，涉及水产养殖技术领域，包括以下步骤：选取不携带病毒的苗种培育后备亲本，通过免疫和定期病毒检测；筛选出不携带病毒的后备亲本；选取性成熟的后备亲本，依次进行人工催产和人工干法授精，对受精卵采用病毒灭活剂进行净化处理，病毒灭活剂的浓度为20ppm‑50ppm，经清水漂洗后进行孵化；出膜并平游后的水花苗种进行病毒检测，对不携带病毒的鱖鱼苗种进行培育，培育期间进行病毒检测，结果阴性即得鱖鱼无病毒苗种。本申请利用先进的病原检测技术筛查亲本，并配以病毒净化手段，杜绝病毒的引入和侵染，避免鱖鱼苗种携带病毒，提高鱖鱼苗种质量，有助于鱖鱼产业的稳定健康发展。

Description

一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法
技术领域
本发明涉及水产养殖领域，尤其涉及一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法。
背景技术
鳜鱼(Siniperca chuatsi)又名桂花鱼，属鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、鳜属(Siniperca)，是我国名贵的特种淡水养殖品种，自古以来深受广大消费者和养殖户的喜欢。中国2020年鳜鱼的年产量约35万吨，年产值超200亿元。然而随着鳜鱼养殖规模的扩大、养殖集约化程度的增高，养殖密度的提高以及养殖水环境的恶化，鳜鱼养殖病害日益严重，特别是鳜鱼的病毒性病害问题也日益突出，鳜蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒等导致的的病毒病目前已成为威胁鳜鱼养殖业健康发展的主要因素之一，每年造成的死亡量非常大，经济损失惨重。
经过长期的鳜鱼病害监测和风险评估发现，鳜鱼苗种的病毒携带率非常高，苗种是否携带病毒已成为鳜鱼养殖的最大制约因素之一。目前我国得鳜鱼苗种繁育主要关注苗种的产卵率和孵化率，并没有从病害防控的层面进行生产管理，导致很多苗企生产的苗种病毒携带率高，孵化率受影响，产量不稳定。
发明内容
本发明提供了一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，从鱖鱼的后备亲本进行病毒追踪，杜绝了病毒的入侵和传播，提高鱖鱼的孵化率和苗种质量，有利于鱖鱼产业的稳定健康发展。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，包括以下步骤：
S1、选取不携带病毒的苗种培育后备亲本，通过疫苗免疫，随后放养进行培育，在培育过程中定期检测病毒，淘汰含有携带病毒后备亲本的培育空间中全部苗种；
S2、筛选出不携带病毒的后备亲本；
S3、选取性成熟的后备亲本，依次进行人工催产和人工干法授精，取得受精卵；
S4、对所述受精卵采用病毒灭活剂进行浸泡处理，浸泡时间为30min，所述病毒灭活剂的浓度为20ppm-50ppm，经清水漂洗后进行孵化；
S5、出膜并平游后的水花进行病毒检测，淘汰携带病毒的水花，对不携带病毒的鱖鱼苗种进行培育，培育期间进行病毒检测，淘汰携带病毒苗种的全部苗种，结果阴性即得鱖鱼无病毒苗种；
其中，所述病毒灭活剂包括聚六亚甲基双胍、戊二醛、大黄提取物、壳聚糖、去离子水。
通过采用上述方案，发明人从鱖鱼苗种的后备亲本进行监测，利用先进的病原检测技术在多个繁育阶段进行病毒筛选，挑选获得无病毒的亲本，并通过人工催产、受精的方式减少鱼群之间病毒的感染和传播，同时提高鱼群自身的免疫能力；同时将受精卵经过病毒灭活剂杀灭病毒和细菌，提高了受精卵的孵化率，将病毒灭活剂的浓度控制在指定范围内，可以使病毒灭活剂对受精卵本身机能造成的毒性影响降到最低，同时满足对病毒和细菌消杀的目的，提高鱖鱼的孵化率和苗种质量，有利于鱖鱼产业的稳定健康发展。
作为优选方案，所述病毒灭活剂包括以下重量份的原料：
聚六亚甲基双胍：20份-30份；
戊二醛：10份-20份；
大黄提取物：5份-10份；
壳聚糖：2份-3份；
去离子水：37份-63份。
作为优选方案，在所述S5中，鱖鱼苗种出膜后第四天开始投喂饵料鱼，所述饵料鱼投喂前经检测不携带病毒，且经过浓度为10ppm-20ppm的病毒灭活剂浸泡10min。
作为优选方案，在所述S5中，所述饵料鱼为白鲢水花、团头鲂水花、草鱼水花、鲮鱼水花中的一种或多种。
作为优选方案，在所述S1中，采用不携带病毒的饵料鱼对所述后备亲本苗种进行培育。
通过采用上述方案，采用病毒灭活剂同时对饵料鱼进行净化处理，可以从鱖鱼食物的源头得到控制，杜绝了病毒的入侵，加强鱖鱼繁殖的生物安保措施。
作为优选方案，在所述S2中，选取1kg以上的后备亲本每隔10天进行病毒检测，淘汰阳性结果的后备亲本，共进行3轮以上病毒抽检；
作为优选方案，在所述S3中，所述人工催产为采用性激素对父本和母本进行一次注射，所述父本的注射量为后备母本的50％，所述父本的注射量为2ml/kg，随后用水流刺激发情，所述性激素为绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮中的一种；
所述人工授精为轻压母本腹部有卵子流出后，对父本生殖孔消毒，擦干后挤出精子到精子保存液中，对母本生殖孔消毒，擦干后挤出卵子，立即与所述精子混合，搅拌后倒入清水，受精2-5min。
通过采用上述方案，由于鱖鱼亲本经过本方案的培育后，亲本的性腺发育成熟，采用性激素采用一次注射即可满足催产的要求，受精过程中的精子和卵子利用清水进一步刺激，加速受精的进程。
作为优选方案，在所述S5中，培育用水消毒处理，培育用工具和培育场所均采用50ppm-100ppm过氧化酸溶液消毒处理，所述培育用工具消毒时间为6h-8h，所述培育场所消毒时间为30min-60min，培育人员操作时手脚消毒，进入培育场所前替换消毒过的工作服和胶鞋。
作为优选方案，所述病毒包括鱖鱼蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鱖鱼弹状病毒中的一种或多种，在所述S1中，采用鱖鱼传染性脾肾坏病毒、弹状病毒二联灭活疫苗和鱖鱼蛙虹彩病毒灭活疫苗进行免疫。
作为优选方案，在所述S5中，所述鱖鱼苗种在隔离的水泥池中培育，控制溶氧不低于8mg/L，控制水流速度为0.1m/s，培育密度为1.0-1.5万尾/m3。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
1、发明人从鱖鱼苗种的后本亲本进行监测，利用先进的病原检测技术在多个繁育阶段进行病毒筛选，并通过人工催产、受精的方式减少鱼群之间病毒的感染和传播，将受精卵经过病毒灭活剂消灭病毒和细菌，提高了受精卵的孵化率，可以获得高产量且无病毒的鱖鱼苗种，有助于鱖鱼繁殖产业的推广和扩大。
2、采用病毒灭活剂同时对饵料鱼进行净化处理，可以使鱖鱼食物的源头得到控制，杜绝了病毒的入侵，加强鱖鱼繁殖的生物安保措施。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明利用先进的病原检测技术筛选亲本，并采用病毒净化，配以严格的生物安保措施进行鳜鱼无特定病毒苗种的繁育。主要包括：无病毒后备亲本培育；无病毒亲本的筛选；鳜鱼受精、卵病毒净化与孵化；无病毒苗种的培育。采用本发明繁育的鳜鱼苗种不携带特定病毒，可以提升苗种培育成活率，提高鳜鱼苗种的产量，有利于鳜鱼产业的稳定健康发展。
制备例一
一种病毒灭活剂，包括以下原料组分：
聚六亚甲基双胍：30g；
戊二醛：10g；
大黄提取物：5g；
壳聚糖：3g；
去离子水：63g。
制备例二
一种病毒灭活剂，包括以下原料组分：
聚六亚甲基双胍：20g；
戊二醛：20g；
大黄提取物：10g；
壳聚糖：2g；
去离子水：37g。
实施例一
一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，具体包括以下步骤：
1、无特定病毒后备亲本的培育
1.1、场地的选择
2019年在清远某鳜鱼养殖场养殖了一批鳜鱼，养殖场环境偏僻独立，周围无其他养殖户，近3年未发生过鳜鱼病毒病，鳜鱼后备亲本培育塘的面积为5亩，共投放体长5cm-8cm的鳜鱼后备亲本苗种10000尾，放养密度为1500-2000尾/亩。
1.2、鳜鱼后备亲本苗种放养前准备
鳜鱼后备亲本苗种投放前进行病毒检测，确定不携带鳜鱼蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鳜鱼弹状病毒，随后用鳜鱼传染性脾肾坏病毒和弹状病毒二联灭活疫苗和鳜鱼蛙虹彩病毒灭活疫苗进行免疫接种，免疫剂量和免疫方法按照疫苗说明书进行操作。
1.3、后备亲本的培育
每天按照2-3天的量投喂适口的饵料鱼，饵料鱼均自己培育，经检测确定不携带鳜鱼蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鳜鱼弹状病毒。
1.4、病毒定期监测
每3个月对后备亲本进行病毒抽检，每个鱼塘随机挑选30尾鱼，取鳃拭子提取核酸后，用数字PCR检测方法检测鳜鱼蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鳜鱼弹状病毒，保留检测结果均为阴性的后备亲本，淘汰检测结果为阳性的后备亲本，并采取紧急无害处理。
2、无特定病毒后备亲本的筛选
2.1、亲本筛选：开春后，挑选500尾体重1kg以上，体格健壮、无畸形、花纹明显的鳜鱼进入5×4×2m3暂养网箱；
2.2亲本第一轮筛选：每尾亲本植入电子芯片，并用拭子从后备亲本的鳃处采集样品，采用数字PCR方法进行病毒检测，留下检测结果未阴性的批次后备亲本；
2.3、亲本第二轮筛选：10天后，将第一轮筛选留下的亲本进行第二次采样和检测，检测方法同上，留下检测结果为阴性的后备亲本；
2.4、亲本第三轮筛选：10天后，将第二轮筛选留下的亲本进行第三次采样和检测，检测方法同上，留下检测结果为阴性的后备亲本；
3、鱖鱼亲本受精、卵病毒净化和孵化
3.1、检查待催产亲本
当水温稳定达到20℃且超过一周时间时，检测亲本的性腺发育情况，挑选出生殖孔呈红色、腹部膨大、柔软的母本，以及生殖孔呈淡色、轻挤腹部有白色精液流出的父本，父本和母本的比例为1∶3。
3.2、人工催产
用绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素释放激素类似物(LRH-A)和马来酸地欧酮(DOM)中的一种进行人工催产，在本实施例方案中，优选为绒毛膜促性腺激素(HCG)，父本注射剂量为2ml/kg，父本的注射量为母本的50％，均采用胸腔注射，因亲本性腺成熟度好，在本实施例均采用一次注射，注射激素后将亲本放在水泥池中用水流剌激促使发情。
3.3、人工受精
注射激素24小时后，开始检查，每隔1-2小时检查一次，当轻压母本的腹部有卵流出时，则进行干法授精。
先捞起父本，用碘酒消毒其生殖孔，再用干净的毛巾擦干后，挤出精液到含有精子保存液的容器中；再起捕母本，用碘酒消毒其生殖孔，用干净的毛巾擦干后将卵子挤在盆中，并立即倒入父本的精液，经充分搅拌后，倒入清水，激活精子，使鱼卵充分受精。
3.4、受精卵病毒净化
授精5分钟后，将受精卵转移至含制备例1获得的病毒灭活剂的容器中进行浸泡净化，然后用清水漂清后转运至孵化池进行孵化，病毒灭活剂的使用浓度为50ppm。
3.5、受精卵孵化
受精鱼卵在直径4m、水深1m的圆形环道内孵化，使用前经过严格消毒；孵化用水使用前经沉淀、过滤和消毒后处理，溶氧不低于8mg/L；控制好环道的水流速度，保证水流均匀快速，鱼出膜后降低流速，得到水花苗种，分别从3个环道池中观察10万颗受精卵观察孵化情况，孵化率的统计结果如表1所示，经统计计算，水花苗种的孵化率超过90％。
表1-受精卵孵化率统计结果
环道 受精卵数(万颗) 孵化出苗数量(万尾) 孵化率
1 10 9.25 92.5％
2 10 9.17 91.7％
3 10 9.08 90.8％
3.6、水花苗种的病毒检测
待水花苗种可以平游后，每个孵化池采集不少于30尾幼苗，进行病毒检测，保留检测结果呈阴性的水花，并转移至水泥池进行苗种培育，淘汰检测结果呈阳性的水花，并采取紧急无害处理。
4、鳜鱼无病毒苗种的培育
4.1、培育方式
本实例苗种的培育在隔离的20m3水泥池中完成，配备有增氧设备，溶氧不低于8mg/L，用水泵控制水流，池中水流速度控制在0.1m/s左右，共放养了25万尾水花，培育密度为1.0-1.5万尾/m3。
4.2、培育前生物安保处理
1)所有的养殖用水都经过严格消毒处理；
2)所有的培育池和工具在使用前都要严格消毒，消毒方法为将培育池冲洗干净后，用100ppm的过氧化酸溶液全面泼洒消毒60分钟；
3)所有工具、气管、气石用100ppm的过氧化酸溶液浸泡8个小时后，冲洗干净方可用；
4)培育人员进入车间操作前要换上干净的工作服和车间专用的胶鞋，手脚用消毒液消毒。
4.3、鳜鱼苗种培育
本实例从苗种出膜后第4天开始投喂饵料鱼，投喂的饵料鱼可以是白鲢水花、团头鲂水花、草鱼水花或鲮鱼水花等，在本实施例方案中，优选为白鲢水花，第一次投喂150万刚出膜的白鲢水花；随着鳜鱼苗的长大，投喂的饵料鱼的规格也相应增加，但规格控制在鳜鱼体长的0.5-0.6倍为宜，宁小勿大；投喂量也随着鳜鱼苗的长大逐渐增加，开始投喂的量为鳜鱼的6倍，然后逐渐增到10倍的量。
4.4、饵料投喂前处理
饵料鱼经检测均不携带鳜鱼蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鳜鱼弹状病毒，饵料鱼投喂前都经过10ppm的病毒灭活剂浸泡10min。
4.5、鳜鱼无病毒苗种的获得
待鳜鱼长至1.0cm-1.5cm时，随机选取30尾鳜鱼进行病毒检测鳜鱼蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鳜鱼弹状病毒，检测结果均为阴性，获得鳜鱼无病毒苗种。
本实施例方案共在4×5m的水泥池中放入步骤3.5获得的10万尾鱖鱼水花苗种，经过15天的培育，共获得8.3万尾平均体长未1.4cm的鱖鱼苗种，经检测不携带鱖鱼蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鱖鱼弹状病毒，经统计鱖鱼苗种的成活率达到了83％。
实施例二
一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，各步骤和各步骤的试剂、参数均与实施例一相同，不同的地方在于：
在步骤3.4受精卵病毒净化中，病毒灭活剂采用制备例二获得的病毒灭活剂替代，病毒灭活剂的使用浓度为20ppm；
在步骤4.2培育前生物安保处理中，所有的培育池和工具在使用前都要严格消毒，消毒方法为将培育池冲洗干净后，用50ppm的聚维酮碘溶液全面泼洒消毒30分钟；所有工具、气管、气石用50ppm的聚维酮碘浸泡6个小时后，冲洗干净方可用；
在步骤4.4饵料投喂前处理中，饵料鱼投喂前都经过20ppm的病毒灭活剂浸泡10min。
效果验证试验
本申请采用不同浓度的病毒灭活剂和浸泡时间依次对500个鱖鱼受精卵进行试验，以比较验证不同病毒灭活剂浓度和浸泡时间对鱖鱼受精卵孵化效果的影响，试验结果如下：
表1-不同浓度的病毒灭活剂和浸泡时间对受精卵孵化率的影响
Figure BDA0003226235190000091
由表1可知，高浓度的病毒灭活剂和过长时间的浸泡会降低鳜鱼受精卵的孵化率，因此，本申请采用浓度为20ppm和50ppm的病毒灭活剂对鱖鱼受精卵进行30min浸泡，浸泡的时候保证溶氧充足，可以获得保证鱖鱼受精卵的孵化率达到80％以上，满足繁育的要求。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、选取不携带病毒的苗种培育后备亲本，通过疫苗免疫，随后放养进行培育，在培育过程中定期检测病毒，淘汰含有携带病毒后备亲本的培育空间中全部苗种；
S2、筛选出不携带病毒的后备亲本；
S3、选取性成熟的后备亲本，依次进行人工催产和人工干法授精，取得受精卵；
S4、对所述受精卵采用病毒灭活剂进行浸泡处理，浸泡时间为30min，所述病毒灭活剂的浓度为20ppm-50ppm，经清水漂洗后进行孵化；
S5、出膜并平游后的水花进行病毒检测，淘汰携带病毒的水花，对不携带病毒的鱖鱼苗种进行培育，培育期间进行病毒检测，淘汰携带病毒苗种的全部苗种，结果阴性即得鱖鱼无病毒苗种；
其中，所述病毒灭活剂包括聚六亚甲基双胍、戊二醛、大黄提取物、壳聚糖、去离子水。
2.如权利要求1所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，所述病毒灭活剂包括以下重量份的原料：
聚六亚甲基双胍：20份-30份；
戊二醛：10份-20份；
大黄提取物：5份-10份；
壳聚糖：2份-3份；
去离子水：37份-63份。
3.如权利要求1或2所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S5中，鱖鱼苗种出膜后第四天开始投喂饵料鱼，所述饵料鱼投喂前经检测不携带病毒，且经过浓度为10ppm-20ppm的病毒灭活剂浸泡10min。
4.如权利要求3所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S5中，所述饵料鱼为白鲢水花、团头鲂水花、草鱼水花、鲮鱼水花中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S1中，采用不携带病毒的饵料鱼对所述后备亲本苗种进行培育。
6.如权利要求1所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S2中，选取1kg以上的后备亲本每隔10天进行病毒检测，淘汰阳性结果的后备亲本，共进行3轮以上病毒抽检。
7.如权利要求1所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S3中，所述人工催产为采用性激素对父本和母本进行一次注射，所述父本的注射量为母本的50％，所述父本的注射量为2ml/kg，随后用水流刺激发情，所述性激素为绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮中的一种；
所述人工授精为轻压母本腹部有卵子流出后，对父本生殖孔消毒，擦干后挤出精子到精子保存液中，对母本生殖孔消毒，擦干后挤出卵子，立即与所述精子混合，搅拌后倒入清水，受精2-5min。
8.如权利要求1所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S5中，培育用水消毒处理，培育用工具和培育场所均采用50ppm-100ppm过氧化酸溶液消毒处理，所述培育用工具消毒时间为6h-8h，所述培育场所消毒时间为30min-60min，培育人员操作时手脚消毒，进入培育场所前替换消毒过的工作服和胶鞋。
9.如权利要求1所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，所述病毒包括鱖鱼蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒和鱖鱼弹状病毒中的一种或多种，在所述S1中，采用鱖鱼传染性脾肾坏病毒、弹状病毒二联灭活疫苗和鱖鱼蛙虹彩病毒灭活疫苗进行免疫。
10.如权利要求1所述的一种鱖鱼无病毒苗种繁育方法，其特征在于，在所述S5中，所述鱖鱼苗种在隔离的水泥池中培育，控制溶氧不低于8mg/L，控制水流速度为0.1m/s，培育密度为1.0-1.5万尾/m3。
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