CN102017911B

CN102017911B - 一种节能减排的大菱鲆育苗方法

Info

Publication number: CN102017911B
Application number: CN2010102710261A
Authority: CN
Inventors: 蔡俊鹏; 何伟杰
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2010-08-31
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2030-08-31
Also published as: CN102017911A

Abstract

本发明公开了一种节能减排的大菱鲆育苗方法。该方法包括步骤：(1)亲鱼的选择；(2)亲鱼强化培养；(3)采卵、受精和孵化；(4)布池；(5)投饵；(6)养成。本发明采用蛭弧菌游泳体和蛭质体预防和调节、环境调控相结合的方案，在育苗池中添加蛭弧菌游泳体和蛭质体混合体菌液，使水体中混合体菌液浓度为10～10⁷pfu/mL，同时饲料用10～10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体和蛭质体混合体菌液浸泡，平均育苗成活率达到50％以上，白化率降至3.4％，畸形率降至2.3％，并且能有效控制水体中的细菌数，改善水质，可长达40天不换水，节约了成本，大大提高了经济效益，是一种绿色低碳的新型无公害育苗新方法。

Description

一种节能减排的大菱鲆育苗方法

技术领域

本发明属于海水鱼类育苗技术领域，特别涉及一种提高大菱鲆育苗率和免疫力，促进大菱鲆苗种的快速生长、改善水质、节水节能和绿色低碳的无公害育苗方法。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmus maximus)属于海水底栖鲆鲽鱼类。欧洲已达到产业化养殖水平，它性格温顺，很少互相残咬，适应低水温生活，生长迅速，易接受配合饲料，易于集约化养殖。在山东、河北、辽宁沿渤海地区已形成养殖高潮，人工苗种需求量很大，目前育苗成活率普遍偏低，严重制约着大菱鲆养殖业的发展。

大菱鲆在仔鱼期非常脆弱，而且苗种存在严重的质量问题：白化率、畸形率、变态死亡率极高，病害频繁发生。大菱鲆对细菌很敏感，细菌病是仔鱼期危害最大的疾病，大菱鲆育苗的困难点主要是开口初期和仔鱼“开鳔”。开鳔期间会有较大损失，死亡率在50％以上。目前主要靠抗生素来预防和治疗，不但容易形成抗药性，还会导致一些流行病反复发作，难以根治，影响苗种质量。

“温室+深井水育苗”是目前大菱鲆育苗最普遍的模式。这种育苗模式需要大量的水循环，地下井水的过度开采使用，不仅浪费资源和能源，导致水资源枯竭，还会严重影响地质概况，为地质灾害埋下隐患。大量的养殖废水排放，也造成海洋水体的严重污染。

蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主细菌裂解的一类细菌。比一般细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用。蛭弧菌的生活史可分为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在宿主细菌内生长发育的蛭质体状态。

将蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体用于大菱鲆的育苗，对育苗水体和饵料进行处理，可有效消除水体中的潜在致病菌，兼具游泳体起效快，活力强和蛭质体制备、保存容易，杀菌作用时间更久和环境耐受力更强的优点。从而克服了抗生素滥用带来的副作用和常规消毒剂残留带来的鱼苗质量问题。同时在蛭质体发育期间，所入侵的宿主虽已无活性，但蛭弧菌并不改变宿主细胞的表面结构，使原宿主仍具有抗原作用，因此不影响宿主的免疫原性，可刺激生物体，产生免疫应答反应。故蛭质体形式是潜在的疫苗在育苗过程中有提高苗种的免疫力的功能。

另一方面蛭弧菌能提高幼苗免疫力，促进幼苗发育和生长，提高苗种成活率。

已有的研究表明，作为一种有益微生物制剂，无论是在食品工业还是在(海洋)水产养殖等领域，蛭弧菌的应用均是安全的。例如：在国外，Lenz and Hespell(1978)研究发现，蛭弧菌及对动物及人的细胞不具侵染性[Lenz R.W.，Hespell R.B.Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives of Microbiology，1978，119(3)：245-248]。在国内，林茂等(2006)研究了蛭弧菌对鱼类细胞的作用，发现它对鱼类细菌没有侵染作用[林茂，杨先乐，薛晖，曹海鹏，邱军强。蛭弧菌BDH21 02对鱼类细胞及病原菌的作用。微生物学通报，2006，33(1)：7-11]。

到目前为止，国内外尚没有对大菱鲆幼体发育过程中使用蛭弧菌蛭质体和游泳体的混合菌液的研究报道。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种节能减排的大菱鲆育苗方法；该育苗方法有效地降低了大菱鲆发病率、畸形率和白化率，成活率高，苗种质量好，改善水质，节水节能，绿色低碳。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：一种节能减排的大菱鲆育苗方法，包括以下操作步骤：

(1)亲鱼的选择：

从养殖的2龄大菱鲆成鱼中选择体形完整、色泽正常、健康活泼、体表光亮、生长速度快和体重在1.7～2.2kg的亲体作为亲鱼；

(2)亲鱼强化培养：

将亲鱼按雌雄2∶1的比例，在亲鱼培育池中进行培育；在培育池中加入蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液，使池水中的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液的起始浓度达10～10⁷pfu/mL；饵料在投入培育池前用浓度为10～10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液浸泡15～30min；

(3)采卵、受精和孵化：

大菱鲆经强化培养达到性成熟后，采集卵子和精液，进行人工受精；将受精卵放入装有海水的育苗池中；在育苗池中加入蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液，使池水中的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体的浓度达10～10⁷pfu/mL；受精卵经过3～5天孵化出初孵仔鱼；

(4)布池：

在培苗池中加入蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液，使池水中的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体的起始浓度达10～10⁷pfu/mL；将初孵仔鱼放入培苗池内进行培育，初孵仔鱼的布池密度为2～3万粒/m³；

(5)投饵：

投喂的饲料包括轮虫、卤虫无节幼虫、卤虫和颗粒饲料；饲料在投入培苗池前用浓度为10～10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液浸泡15～30min；

(6)每隔5～40天换掉池水(全池)一次，换(全池)水后重新添加蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液，使池水中蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体的浓度达10～10⁷pfu/mL；鱼苗经过80～90天的饲养，进入养成阶段。

步骤(2)所述亲鱼优选从进口鱼苗的养殖过程中优选健康、生长快速的鱼苗作为亲鱼。

步骤(2)所述培育池中的水经过精细过滤；所述饵料每日投喂3次；所述亲鱼池中水温控制在19～20℃，光照调控在1500～2500lux，光照时间是：前2周每天9～11小时，两周后每天19～20小时，经过2～3个月的温光调控，亲鱼达到性成熟。

步骤(3)所述育苗池为是长为4m，宽为3m，深为1.5m的长方形水泥池，池内设置6个气石，微充气。

步骤(4)所述培苗池中培育苗种过程中的水温为18～20℃，盐度为26～28‰，pH为8.0～8.2，溶解氧5.0～7.0mg/L；苗种培育期间不断充气，前10天充气量控制在20～40L/h/m²，仔鱼开鳔后逐渐增加充气量至50～70L/h/m²。

步骤(5)所述投饵是第9～15日龄投喂轮虫，投喂密度为10个/mL；第10～25日龄投喂卤虫无节幼虫，投喂密度为由0.2个/mL；第20～35日龄投喂卤虫，投喂密度为1个/mL；第35日龄以后投喂颗粒饲料，颗粒饲料的投喂量为1g/ml。

步骤(2)～(5)所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，所述蛭弧菌于2009年8月7日保藏于湖北省武汉市珞珈山武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209172。

对所述蛭弧菌BDFM05进行负染后于电子显微镜下进行形态观察：BDFM05呈单细胞，椭圆形，大小为1.43×0.53um，端生鞭毛，鞭毛长度至少2um；所述蛭弧菌BDFM05以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2～3mm的透明圆形噬菌斑。

步骤(2)～(5)所述混合体菌液为蛭弧菌游泳体菌液和蛭弧菌蛭质体菌液按细菌个数1∶1混合而成。

所述蛭弧菌蛭质体菌液按照以下方法制备得到：在含有宿主菌的DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000ml蒸馏水中，pH值为7.2～7.6)中接入蛭弧菌，于20～35℃、150～300rpm培养36～48h，培养液经4℃6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，沉淀即是蛭质体；

蛭弧菌游泳体菌液按照以下方法制备得到：将蛭弧菌蛭质体制备方法中的含蛭弧菌游泳体的上清经16000～18000rpm离心15～20min后，沉淀用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到蛭弧菌游泳体菌液。

所述宿主菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)所述DNB液体培养基是将营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.6。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)蛭弧菌的生活史可分为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在宿主细菌内生长发育的蛭质体状态。蛭弧菌游泳体侵入宿主的周质空间的同时失去鞭毛。蛭弧菌游泳体侵入宿主时，在宿主细胞壁上产生一个孔隙，当蛭弧菌侵入到宿主的周质空间后孔隙重新封闭。游泳体失去鞭毛，和宿主细胞一起被称为″蛭质体″。与游泳体相比，蛭质体不仅具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，作用时间虽略慢但更久的特点，同时还具有潜在的灭活疫苗功能。当蛭弧菌游泳体入侵宿主细胞后，宿主细胞的呼吸作用(respiration)很快被停止。蛭弧菌也进入蛭质体状态，开始分泌多种酶，消解宿主细胞的大分子为小分子物质，进而整合为自身的营养物质，使自身生长，变长。最终，长条状的蛭质体分成很多短的节段，长出鞭毛，重新成为游泳体。之后，它们分泌必需的酶类，破壁而出，再次成为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体。在此蛭质体发育期间，蛭弧菌并不改变宿主细胞的表面结构，使原宿主仍具有抗原作用，可刺激生物体，产生免疫应答反应。可有效预防鱼类细菌病的产生，提高育苗成活率等。

本发明所述蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液兼具有游泳体和蛭质体的共同优点，效果更佳。

(2)本发明亲鱼培育时在水中和饵料中添加蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，促进了亲鱼的营养吸收和快速生长，保证性腺发育正常、培育出优良的受精卵。

(3)本发明采用蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液预防和调节、环境调控相结合的方案，平均育苗成活率达到49％以上，白化率降至2.5％，畸形率降至1％，40天换(全池)水一次，节约了成本，提高了经济效益。

(4)本发明在仔鱼阶段加强水质、水温、光照等环境因素的调控，并在水中和饲料中投放一定浓度的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，改善了水质，提高了育苗成活率和种苗的免疫力，降低了白化率和畸形率，防止了病害的发生。

(5)本发明所述蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液在大菱鲆的应用中安全性好：蛭弧菌游泳体通过裂解而消除致病菌的方法是生物方法，绿色、安全、无污染。蛭弧菌可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，且其在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，从而克服了抗生素滥用带来的副作用。现有的研究表明蛭弧菌对鱼类无毒性作用，对人类无致病性。

用蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体来育种是一种有发展前景的新方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：提高大菱鲆育苗成活率的养殖方法，具体步骤如下：

1、亲鱼选择：

在山东省某养殖场，从50000只养殖的2龄大菱鲆(Scophthalmus maximus)成鱼中选择体形完整、色泽正常、健康活泼、体表光亮、生长速度快、体重在1.7～2.2kg的亲体800条作为亲鱼。雌雄合理搭配，以避免近亲授精，防止种质退化。

2、亲鱼强化培育

亲鱼按照雌雄2∶1比例进行优选。亲鱼在35m²的培育池中进行强化培养，平均4条/m²。培育池中的水先经过二级砂滤后，剧烈曝气后使用。加入蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，使初始菌体浓度分别达到10、10³、10⁵、10⁷pfu/mL。所用配合饲料中同时添加亲鱼性腺发育所必须的卵磷脂和不饱和脂肪酸。投饵前，所用饲料要用浓度为10、10³、10⁵、10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液浸泡30min，分批投饵，每日投喂3次。

温度和光照控制：亲鱼池中水温控制在19～20℃，光照调控在2000lux，光照时间是：前2周每天9～11小时，两周后每天19～20小时，在合适的光照调控和营养强化培育条件下，加上蛭弧菌混合菌液的作用，亲鱼性腺发育加快，经过2个月的温光调控，亲鱼即可达到成熟产精产卵。蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液促进了亲鱼的营养吸收和快速生长，保证性腺发育正常、培育出优良的受精卵。

3、进行采卵、受精、孵化

大菱鲆在上述条件下培育至性成熟以后，将雌雄分开，分别采集精液和卵子，人工受精。受精后，将沉浮卵分开，将孵卵(受精卵)1000g移入孵化箱内进行孵化。受精卵在14℃进行孵化，经过3天的时间完成孵化，获得初孵仔苗。

4、育苗用水的处理

在育苗池中注入经砂滤、沉降的海水，达到有效水位后，加入适量的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，并加大曝气量至90L/h/m³，混合均匀，使水体中蛭弧菌混合菌液的浓度分别达到10、10³、10⁵、10⁷pfu/mL。

5、布池

将初孵仔鱼放入培苗池内进行培育，初孵仔鱼的布池密度为2万粒/m³，苗种培育过程中的水温为18～20℃，盐度为26～28‰，PH为8.0～8.2，溶解氧5.0～7.0mg/L，苗种培育期间不断充气，前10天充气量控制在20～40L/h/m²，仔鱼开鳔后逐渐增加充气量至50～70L/h/m²

6、投饵

投喂的饲料包括轮虫、卤虫无节幼虫、卤虫和颗粒饲料。9-15日龄投喂轮虫，投喂密度为10个/mL，10-25日龄投喂卤虫无节幼虫，投喂密度为0.2个/mL，20～35日龄投喂卤虫，要少投勤投，吃饱即可。投饵前，饵料都分别用浓度为10、10³、10⁵、10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液浸泡30min。

7、管理

育苗期间的温度、光照可控，随时观察，及时清除池底部的沉淀物及水表面的杂物，及时分苗。试验设置不同的换全池池水的频率：5天换水一次、10天换水一次、15天换水一次、20天换水一次、25天换水一次、30天换水一次、35天换水一次、40天换水一次，每次换(全池)水后加蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，使水体中的菌体浓度达到10～10⁷pfu/mL。加菌方法为：用相应的池水稀释菌液后，均匀泼洒全池，并加大曝气，从而使菌液混合均匀。鱼苗经过80-90天的饲养，即可进入养成阶段。

8、试验结果分析

试验按以下方式分组，在试验结束时分别测量各组的成活率、白化率、畸形率及免疫活性指标和水质情况；

平均分为A-D 4个试验组，B、C、D每个试验组有8个小组，分别为B1、C1、D1；B2、C2、D2；、B3、C3、D3；B4、C4、D4；B5、C5、D5；B6、C6、D6；B7、C7、D7；B8、C8、B8；B1-D8每小组再分为4组，即B1-1～B1-4…D8-1～D8-4，每组2个重复。试验的处理如下：

A组：工厂正常流水的育苗模式，投喂正常饲料

B组：水体中泼洒蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，使水体中蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液浓度分别达到10、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，投喂未经过蛭弧菌浸泡过的颗粒饲料

C组：水中不泼洒蛭弧菌，但投喂的颗粒饲料则经过放浓度为10、10³、10⁵、10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液浸泡

D组：水体中泼洒蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，使菌体浓度分别达到10、10³、10⁵、10⁷pfu/mL，同时相应地投喂经浓度为10、10³、10⁵、10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液浸泡后的颗粒饲料；

B1、C1、D1组每5天换(全池)水一次，换水后重新加菌；

B2、C2、D2组每10天换(全池)水一次，换水后重新加菌；

B3、C3、D3组每15天换(全池)水一次，换水后重新加菌；

B4、C4、D4组每20天换(全池)水一次，换水后重新加菌；

B5、C5、D5组每25天换(全池)水一次，换水后重新加菌；

B6、C6、D6组每30天换(全池)水一次，换水后重新加菌；

B7、C7、D7组每35天换(全池)水一次，换水后重新加菌；

B8、C8、D8组每40天换(全池)水一次，换水后重新加菌；

B1-1、C1-1、D1-1…D8-1投放的菌液浓度为10pfu/mL；

B1-2、C1-2、D1-2…D8-2投放的菌液浓度为10³pfu/mL；

B1-3、C1-3、D1-3…D8-3投放的菌液浓度为10⁵pfu/mL；

B1-4、C1-4、D1-4…D8-4投放的菌液浓度为10⁷pfu/mL；

1、溶菌酶活力测定

血清溶菌酶活性通过浊度比色法测定(Ellis A E.Lysozymeassays.[M]//Stolen J S，Fletcher T C，Anderson D P，et al.Techniques in FishImmunology I.USA：SOS Publications，1990：101-103.)：实验条件下，每mL血清每min吸光值减少0.001为1个酶活性单位(U)。

2、酚氧化酶(PO)活力的测定

酚氧化酶活性测定采用Hernández-López等(Hernández-López J，Gollas-Galvan T.Vargas-Albores F.Activation of the prophenoloxidase system ofthe brown Penaeus californiensis Holmes[J].Comp Biochem Physiol，1996.113C：61-66.)的方法。以实验条件下，每mL血清每min吸光增加0.001，定义为1个酶活性单位(U)。

3、超氧化物歧化酶(SOD)活力

超氧化物歧化酶(SOD)活力按邓碧玉等改进的连苯三酚自氧化法进。(邓碧玉，袁勤生，李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J].生物化学与生物物理进展，1991，18(2)：163～163)

4、感染实验

感染试验于预先消毒的盛有1吨砂滤海水(盐度29～30‰)的水池中进行。从实验A组、B1-1、B1-2…D8-3、D8-4共97组中每个组随机取大菱鲆100只，体重10±1g/条。用无菌1mL注射器经大菱鲆腹腔注射0.1mL浓度为10⁸cfu/mL嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1.172)，对大菱鲆幼苗进行感染。试验水温保持在18～20℃，流水养殖，每天保持8个水交换量，充气培养。人工感染后，记录大菱鲆的体表变化、运动、摄食及死亡情况。连续观察10天，最终计算成活率，采用相对存活率(Relative Percent Survival，RPS)计算式：

RPS(％)＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％

成活率、白化率、畸形率及免疫活性指标的测定结果见表一～表四：

从表中可以看出，A组成活率、溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力最高分别达到26.21％、1.496U/mL、99.89U/mL、1.697U/mL。白化率、畸形率分别为10.35％、8.97％；与A组相比，C、D、E组的成活率、溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力都有明显的提高，白化率、畸形率明显降低。说明在常规的育苗方式下，不换水会影响大菱鲆的成活率、溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力。在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体的浓度升高，成活率、溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力都在逐渐升高，白化率、畸形率明显降低；说明蛭弧菌蛭质体的浓度越高，大菱鲆的免疫力越强，成活率越高，患病机率越小。B1-1～B8-1…D1-4～D8-4之间的成活率、溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力、白化率、畸形率几乎无明显差异，说明在水中或者是在饲料中添加浓度为10～10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，5-40天换(全池)水一次，对育苗成活率、溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力白化率、畸形率影响不明显，均可提高成活率和免疫力。

感染实验的结果显示，A组的相对存活率(Relative Percent Survival，RPS) 为0，与A组相比，B、C、D组的相对存活率均有明显提高，从表五可以看出，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体菌液浓度的升高，相对存活率逐渐升高，且都明显高于工厂生产的A组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的育苗方法，能明显提高大菱鲆的相对存活率，即提高大菱鲆的免疫抵抗力；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组大菱鲆相对存活率没有显著的变化。说明新型育苗方法中，5-40天不换水，蛭弧菌蛭质体菌液都能增强大菱鲆的免疫能力。就B、C、D三组不同处理方式而言，均能提高大菱鲆幼苗的相对存活率，且在水体与饲料中同时添加，效果最佳。

因此，无论在水中还是饲料中添加一定浓度的蛭弧菌蛭质体菌液，长达40天不换水，都会提高大菱鲆幼苗的免疫抵抗力，在水中与饲料中同时添加，效果最好。从而进一步表明蛭弧菌蛭质体具有潜在的疫苗作用，能够刺激大菱鲆产生免疫应答反应，抵御气单胞菌的侵害，有助于提高大菱鲆的成活率。

因此，B、C、D组的育苗方式能够达到提高育苗成活率和种苗的免疫力、促进摄食和快速生长的目的，且D组效果最佳。即：无论在水中还是在饲料中添加浓度为10～10⁷pfu/mL蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，40天换(全池)水一次，均可显著提高大菱鲆的育苗成活率、溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力等免疫指标，降低白化率和畸形率；在水中和饲料中同时添加，效果更佳。5-40天之间换(全池)水一次，对溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力、白化率、畸形率均无明显影响。

A组的细菌总数和弧菌总数分别高达1.8×10³cfu/mL和1.05×10²cfu/mL。B、C、D组的细菌总数分别为1.68×10²cfu/mL、1.79×10²cfu/mL、1.03×10²cfu/mL；弧菌总数7.5×10cfu/mL、8.2×10cfu/mL、3.6×10cfu/mL，比A组相比，都降低了1个数量级。A、B、C、D组的PH都在7.78～8.12之间。

由此可见，无论在水中还是在饲料中添加浓度为10～10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合菌液，均能提高种苗的免疫力和育苗成活率，且能控制水体中细菌的数量，改善水质。在水中和在饲料中同时添加，效果更佳。即能够节约地下水资源，保护环境，又能够节省成本，提高经济效益，促进养殖业的快速发展。

表一成活率、白化率、畸形率及免疫活性指标

表二成活率、白化率、畸形率及免疫活性指标

表三成活率、白化率、畸形率及免疫活性指标

表四成活率、白化率、畸形率及免疫活性指标

表五攻毒感染实验相对存活率

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种节能减排的大菱鲆育苗方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)亲鱼的选择：

从养殖的2龄大菱鲆成鱼中选择体重在1.7～2.2kg的亲体作为亲鱼；

(2)亲鱼强化培养：

将亲鱼按雌雄2∶1的比例，在亲鱼培育池中进行培育；在培育池中加入蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液，使池水中的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体的浓度达10～10⁷pfu/mL；饵料在投入培育池前用浓度为10～10⁷pfu/mL的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液浸泡15～30min；

(3)采卵、受精和孵化：

大菱鲆经强化培养达到性成熟后，采集卵子和精液，进行人工受精；将受精卵放入装有海水的育苗池中；在育苗池中加入蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液，使池水中的蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液的浓度达10～10⁷pfu/mL；受精卵经过3～5天孵化出初孵仔鱼；

(4)布池：

(5)投饵：

(6)每隔5～40天换掉池水一次，换水后重新添加蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合体菌液，使池水中混合体菌液的浓度达10～10⁷pfu/mL；鱼苗经过80～90天的饲养，进入养成阶段；

所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，所述蛭弧菌于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209172。

2.根据权利要求1所述的一种节能减排的大菱鲆育苗方法，其特征在于：步骤(2)所述培育池中的水经过精细过滤，紫外线杀菌；所述饵料每日投喂3次；所述亲鱼池中水温控制在19～20℃，光照调控在1500～2500lux，光照时间是：前2周每天9～11小时，两周后每天19～20小时，经过2～3个月的温光调控，亲鱼达到性成熟。

3.根据权利要求1所述的一种节能减排的大菱鲆育苗方法，其特征在于：步骤(3)所述育苗池是长为4m，宽为3m，深为1.5m的长方形水泥池，池内设置6个气石，微充气。

4.根据权利要求1所述的一种节能减排的大菱鲆育苗方法，其特征在于：步骤(4)所述培苗池中培育苗种过程中的水温为18～20℃，盐度为26～28％0，pH为8.0～8.2，溶解氧5.0～7.0mg/L；苗种培育期间不断充气，前10天充气量控制在20～40L/h/m²，仔鱼开鳔后逐渐增加充气量至50～70L/h/m²。

5.根据权利要求1所述的一种节能减排的大菱鲆育苗方法，其特征在于：步骤(5)所述投饵是第9～15日龄投喂轮虫，投喂密度为10个/mL；第10～25日龄投喂卤虫无节幼虫，投喂密度为0.2个/mL；第20～35日龄投喂卤虫，投喂密度为1个/mL；第35日龄以后投喂颗粒饲料，颗粒饲料的投喂量为1g/ml。

6.根据权利要求1所述的一种节能减排的大菱鲆育苗方法，其特征在于：步骤(2)～(5)所述混合体菌液为蛭弧菌游泳体菌液和蛭弧菌蛭质体菌液按细菌个数1∶1混合而成。

7.根据权利要求6所述的一种节能减排的大菱鲆育苗方法，其特征在于：所述蛭弧菌蛭质体菌液按照以下方法制备得到：在含有宿主菌的DNB液体培养基中接入蛭弧菌，于20～35℃、150～300rpm培养36～48h，培养液经4℃6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，沉淀即是蛭质体；

8.根据权利要求7所述的一种节能减排的大菱鲆育苗方法，其特征在于：所述宿主菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)；所述DNB液体培养基是将营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.6。