CN101911918B - 牙鲆抗病优良品系选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牙鲆抗病优良品系选育方法，包括牙鲆群体选育；牙鲆家系选育；其特征在于还包括牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育；或包括牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育；或包括牙鲆抗病家系的近交选育。本发明综合采用群体选育、种内杂交、家系选育、分子标记辅助选育、人工雌核发育和近交等多种生物技术，以牙鲆为材料首次建立了我国海水鱼类抗病优良品系选育方法，培育出抗鰻弧菌病力明显提高的牙鲆优良品系，养殖存活率提高20-47％，生长率提高20％以上。本发明为鱼类抗病品种选育开辟了新的技术途径，适宜在所有养殖鱼类上进行推广应用，对养殖鱼类抗病良种培育具有重要意义和应用价值，将产生巨大的经济和社会效益。

Description

牙鲆抗病优良品系选育方法

技术领域

本发明属于水产养殖业的鱼类遗传育种领域，特别涉及一种牙鲆抗病优良品系选育方法。

背景技术

鱼类是重要的水产养殖种类，也是人类重要的食品来源。我国是世界上水产养殖产量最高的国家，目前养殖鱼类的年产量达到2000多万吨，除满足国内市场外，每年约有30万吨鱼产品出口国外，是出口创汇的主要农产品之一。不过，近年来随着鱼类养殖业的快速发展，病害频发、种质退化、苗种成活率低，给鱼类养殖业造成的经济损失每年高达150多亿元人民币，从而极大地限制了鱼类养殖业的发展。

目前危害鱼类的主要病害是细菌性和病毒性疾病，前者造成的危害更大，其中危害最大的一种细菌性疾病，是由鳗弧菌引起的弧菌病(周丽等，1997)。虽采取抗菌素类药物等传统的防病措施，但仍无法从根本上解决牙鲆等鱼类养殖的病害问题；并且抗菌素类药物具有容易在鱼体内积累、对消费者的健康具有潜在危害、容易使病原菌产生抗药性以及严重污染养殖环境等问题，因而在鱼类养殖业中的应用越来越受到限制；同时抗菌素的使用也不能满足人们日益增长对无药物残留绿色水产品的需求。鳗弧菌病每年造成养殖鱼类的经济损失高达近50亿元人民币。

因此，采用现代生物技术培育抗病力强、生长速度快的养殖鱼类新品种，已成为水产科技必须解决的重大课题，也是解决鱼类病害问题的根本途径。在鱼类遗传育种方面，国内自二十世纪80年代开始，在淡水鲤科鱼类上开展了一些杂交育种的研究工作，通过不同鲤鱼之间的杂交相继培育出快速生长的颖鲤(潘光碧等，1989)、建鲤(张建森等1994)等新品种。在海水鱼类遗传育种研究方面，主要在牙鲆、大黄鱼和大菱鲆上开展了人工雌核发育培育单性苗种的研究工作(王新成等，1997；王晓清等，2006；苏鹏志等2008)；同时，还开展了一些分子标记筛选和遗传多样性评价、种质鉴定以及抗病相关MHC基因标记筛选等方面的研究工作，(邹曙明等，2000)采用RAPD技术对牙鲆和大菱鲆养殖群体遗传结构进行的检测分析；(尤峰等，2001)采用同工酶技术对山东近海牙鲆和养殖牙鲆的遗传多样性进行的分析；(Liu等2005a，b)利用微卫星标记和AFLP技术评价牙鲆养殖群体和野生群体的遗传结构，表明养殖群体的遗传多样性具有一定程度的下降；(陈微等，2005)开展了牙鲆微卫星标记筛选和遗传多样性的分子研究；(张玉喜等2006)分析了牙鲆抗病鱼和不抗病鱼的MHC基因多态性，初步筛选到抗病相关的MHC基因型。(陈松林等，2008)开展了牙鲆抗病群体构建和抗病性能初步测定的研究。但由于对鱼类抗病优良品种选育技术缺乏长期系统的研究，至今我国还没有一套有关鱼类抗病优良品系选育的技术方法的报道，也没有建立人工选育的抗病优良品种，而有关海水鱼类牙鲆抗病优良品种选育，特别是抗鰻弧菌病优良品系选育的研究，目前国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了建立牙鲆抗病优良品系选育方法，弥补现有技术的不足，为鱼类抗病良种品种培育提供方法，解决水产养殖中缺乏抗病优良品系选育的问题，

本发明首先采用群体选育技术从病原菌感染的牙鲆鱼苗中筛选出抗鰻弧菌病的鱼作为抗病群体，随后，收集了不同地理群体(如日本群体和黄海野生群体等)，采用种内杂交技术将抗病群体与不同地理群体进行交配建立家系，然后采用家系选育技术从大量的家系中筛选出抗鰻弧菌病的家系，又采用微卫星分子标记技术筛选出抗病家系特有的微卫星标记，用这些特异标记进一步指导抗病家系的选育；为了建立纯系，使抗病性状尽快固定化，本发明又采用人工雌核发育或近交技术使抗病家系尽快纯化，经过这样的2-3代选育，获得了抗病力提高20-47％的牙鲆抗病新品系。

一种牙鲆抗病优良品系选育方法，包括一)、牙鲆群体选育；二)、牙鲆家系选育；其特征在于还包括三)、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育；该辅助选育包括1)抗病家系特异分子标记的筛选以得到抗病家系的特异微卫星标记，然后利用该特异微卫星标记进行2)抗病分子标记辅助选育，得到具有抗病家系特异微卫星标记的家系或个体；且上述一)、牙鲆群体选育包括：牙鲆抗病群体选育和/或不同地理群体的选育，以得到牙鲆抗病选育的第一代；上述二)、牙鲆家系选育包括1)、通过种内杂交建立抗病家系，以及2)、抗病家系的筛选，和3)、抗病家系的生长性状选育，以得到牙鲆抗病选育的第二代。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于还包括四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育，该人工雌核发育选育是1)将抗病选育的第二代的抗病家系进行人工雌核发育诱导；以及2)人工雌核发育家系的抗病性能选育；和3)人工雌核发育家系的生长性状选育，以得到牙鲆抗病选育的第三代。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于还包括五)、牙鲆抗病家系的近交选育；该近交选育是1)抗病家系的近交家系的培育；以及2)近交家系抗病性能和生长性状选育，以得到牙鲆抗病选育的第三代。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于一)、牙鲆群体选育是1)、牙鲆抗病群体选育和/或2)、牙鲆不同地理群体选育：

且1)、牙鲆抗病群体选育又是以下两种方法的其中一种：

(1)从养殖的牙鲆发病鱼苗中选育抗病群体：在7-10月份，确认是因鳗弧菌感染而造成鱼苗死亡的养殖池塘，收集那些85-90％以上的鱼苗死亡、而只有10-15％的鱼苗存活的养殖池的鱼苗，培育成亲鱼并达到性成熟，并作为牙鲆抗病选育第一代；

(2)通过细菌感染选育牙鲆抗病群体：选取3.5-5.5月龄牙鲆鱼苗2000-3000尾，饲养于水泥池；将鳗弧菌培养物稀释成50、100、200、400，800倍的不同浓度，再将400-600尾鱼苗浸泡在不同浓度鳗弧菌的海水中，浸泡感染2-6小时后转到新鲜海水中养殖观察；2天后鱼苗开始死亡，死亡持续4-8天，10-30天后，计算不同浓度组的存活率，并收集死亡率为60-80％的鱼池中存活的鱼苗，并作为牙鲆抗病选育第一代；

2)、牙鲆不同地理群体的选育：

收集来自不同国家或海域的牙鲆鱼苗，选择各地理群体中规格整齐、体质健壮的鱼苗进行培育和筛选，当鱼苗生长至10-13厘米时，以5％为选择强度，从3000-5000尾鱼苗中选出个体大的150-250尾进行单独养殖直至成熟，并作为牙鲆抗病选育第一代。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述二)、牙鲆家系选育中的1)、通过种内杂交建立家系是：将抗病群体的雄鱼或雌鱼分别与不同地理群体的雌鱼或雄鱼进行配对繁殖建立家系，或将一个地理群体与另一个地理群体杂交建立家系；在鱼苗临近孵化出膜时，将其转移到育苗缸中进行培育，每缸培育一个家系，且每立方米水体培育5000-10000尾仔鱼；

上述二)、牙鲆家系选育中的2)、牙鲆抗病家系的筛选是采用以下两种方法其中之一：

(1)通过细菌感染筛选抗病家系：当鱼苗培育到3.5-5.5月龄时，从各家系中选取150-250尾鱼苗进行鳗弧菌浸泡感染；首先进行预感染实验确定半致死浓度，即选取来自各个家系的相同数量鱼苗的混合群体，用生理盐水稀释已培养好的鳗弧菌菌液至浓度为20-30OD，将上述菌液用海水稀释成50、100、200、400、800倍的不同浓度，再将100-200尾混合家系鱼苗放在不同浓度菌液的海水中，浸泡感染2-6小时后转到新鲜海水中养殖观察，在随后的5-15天内计算不同浓度组的鱼苗死亡率，将引起40-50％的鱼苗死亡的浓度确定为半致死浓度；随后采用半致死浓度进行正式感染，方法同预感染；每个家系每次感染75-125尾鱼苗，重复实验1次；每个家系感染用鱼养殖在1-2m³的水槽中；感染10-30天后，计算各家系鱼苗的存活率，根据家系的存活率、交配方式、父母本来源以及家系建立时间，采用SAS软件中Logistic模块计算各家系抗病力的优势比；将抗病力优势比在7以上的家系定为抗病家系，在3-7之间的家系定为较抗病家系，在1-3之间的家系定为抗病力一般家系，在1以下的家系定为不抗病家系；将抗病家系鱼苗作为抗病牙鲆选育第二代，以进行繁育养殖或进一步选育；

(2)通过家系鱼苗养殖存活率筛选抗病家系：

将3.5-5.5月龄的不同家系鱼苗300-500尾放在规格相同的水泥池中养殖，保持养殖条件相同，测量鱼苗放养时的体长和体重，养殖10-15个月以后计算各家系鱼苗的存活率；将存活率高于其它家系或对照组的家系确定为抗病家系，将抗病家系鱼苗作为牙鲆抗病选育第二代，以进行繁育和养殖或进一步选育。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述三)、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育中的1)抗病家系特异分子标记的筛选方法是：

根据已发表的微卫星序列筛选多态性微卫星标记，采用8-15个多态性标记对牙鲆家系进行基因组分析，每个家系分析10-20个以上个体，DNA采自鱼苗尾鳍；根据不同家系微卫星DNA片段的大小和数量确定不同家系的基因型；从8对多态性标记引物中筛选出一对微卫星标记引物JF7，F：TCTACTCAGAGCCAACAAG，R：ATCAGTCTGCACCTGAATG，该对引物在牙鲆抗病家系-鲆抗1号中扩增出2种特异的等位基因型，256bp/264bp和258bp/264bp，2种基因型组合用作抗病家系鲆抗1号的特异微卫星标记，用于抗病分子标记辅助选育；

上述三)、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育中的2)抗病分子标记辅助选育方法是：

利用抗病家系特异微卫星标记对不同家系进行筛选，选择抗病家系中具有特异微卫星标记的个体，作为亲本进行繁殖，产生抗病家系后代家系鱼苗；随后用该特异分子标记检测抗病家系后代家系，从中选择出具有抗病家系特异微卫星标记的家系或个体，用于繁育养殖或进一步选育。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育中的1)抗病家系的人工雌核发育诱导是：利用牙鲆抗病家系即抗病选育第二代亲鱼进行雌核发育诱导，培育抗病家系的雌核发育家系；雌核发育诱导采用异种鱼类精子进行，选用与牙鲆亲缘关系较远的异源鱼类新鲜或冷冻精子作为诱导雌核发育的精子；

在牙鲆繁殖季节，选择腹部膨大的牙鲆抗病家系雌性亲鱼，通过人工挤压腹部法采集未受精卵，置于干燥的烧杯中待用，随后从液氮罐中取出冷冻保存的异种海水鱼精子，放在37-39℃水浴中快速解冻，并用MPRS或TS-2稀释液稀释，将稀释后的冻精用80-100mJ/cm²紫外线照射，然后与未受精卵混合，3-6min后，将卵转入静水压机压力缸中，采用66-68Mpa的静水压力，处理6-7分钟，诱导染色体加倍，然后将卵转入14-20℃海水中孵化；将来自一条雌鱼的卵放在一个网箱中孵化，即建立了一个雌核发育家系；

上述四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育中的2)人工雌核发育家系的抗病性能选育是：当雌核发育家系鱼苗生长至3.5-5.5月龄时进行鳗弧菌浸泡感染，从每个家系中随机取样150-250尾，每次感染75-125尾，感染后10-30天计算各家系的存活率；将存活率在51-60％以上的家系定为抗病家系，存活率在31-50％之间的家系定为较抗病家系，存活率在21-30％之间的家系定为中等抗病家系，存活率在20％以下的家系定为不抗病家系；将存活率高的雌核发育家系筛选出来作为牙鲆抗病选育的第三代进行繁殖和养殖；

上述四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育中的3)、人工雌核发育家系的生长性状选育是：当雌核发育家系鱼苗生长至3.5-5.5月龄时进行生长性状选育，将生长性能良好的雌核发育家系筛选出来，培育成熟后进行繁殖。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述五)、牙鲆抗病家系的近交选育中的1)抗病家系的近交家系的培育是：

采用筛选出的抗病家系特异的微卫星标记引物，从选育出的抗病家系成熟个体中选取具有抗病家系特异基因型组合的雌鱼和雄鱼，采用常规方法收集雌鱼的卵子和雄鱼的精液，将来自同一家系的一尾雄鱼的精液和一尾雌鱼的卵子进行授精，将授精卵置于2-3立方米的水槽中进行孵化和育苗，即得到近交家系；

上述五)、牙鲆抗病家系的近交选育中的2)近交家系抗病性能和生长性状选育是：当近交家系鱼苗生长至3.5-5.5月龄时，进行抗病性能和生长性状的选育，将存活率高、抗病力强、生长较快的近交家系筛选出来，作为牙鲆抗病选育第三代，以进行大量繁殖和养殖。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述五)、牙鲆抗病家系的近交选育还包括3)抗病家系的生长性状选育，该选育方法是：

当抗病家系鱼苗生长至3.5-5.5月龄时，进行生长性能评价，即随机取200-300尾，每个家系采样40-60尾鱼苗测量体长和体重，作为放养时的体长和体重，按照常规方法进行分池养殖，或者对不同家系进行标记后放在同一水泥池中进行养殖；在养殖8-15个月后收集各家系鱼苗进行体长和体重测量，每个家系的鱼苗全部测完或采样40-60尾鱼苗进行测量，计算各个家系体长、体重的平均数，利用日增重率评价不同家系的生长性能，将生长速度快的近交家系选择出来，作为牙鲆抗病选育的第三代，以进行大量繁殖和养殖。

本发明综合采用群体选育、种内杂交、家系选育、分子标记辅助选育、人工雌核发育和近交等多种生物技术和传统选育技术，以牙鲆为材料首次建立了我国海水鱼类抗病优良品系选育方法，培育出抗鰻弧菌病力明显提高的牙鲆优良品系，养殖存活率较对照组提高20-47％，生长率提高20％以上。与已有技术相比，本发明具有针对性强、选育效率高、操作简单、效果明显等特点，而将牙鲆的养殖产量提高30％左右。我国牙鲆养殖业每年的产值约为30亿元，本发明推广后每年将增加产值10多亿元。本发明为鱼类抗病品种选育开辟了新的技术途径，对养殖鱼类抗病良种培育具有重要意义和应用价值，适宜在所有养殖鱼类上进行推广应用，必将产生巨大的经济和社会效益。

附图说明

图1是牙鲆抗病群体与不同群体交配产生的家系抗病力的优势比示意图。

图中：A：抗病家系：A1：鲆抗1号；A2：鲆抗2号；A3：鲆抗3号；

B：比较抗病家系；C：一般抗病家系；D：不抗病家系

图2是牙鲆抗病群体与不同群体交配产生的抗病家系鱼苗养殖存活率比较示意图。

图3是牙鲆不同地理群体间交配产生的抗病家系鱼苗养殖存活率示意图。

图4是牙鲆抗病家系鱼苗生长性能比较示意图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的技术内容进行详细叙述：

本发明包括一)、牙鲆群体选育；二)、牙鲆家系选育；其特征在于还包括三)、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育；该辅助选育包括1)抗病家系特异分子标记的筛选以得到抗病家系的特异微卫星标记，然后利用该特异微卫星标记进行2)抗病分子标记辅助选育，得到具有抗病家系特异微卫星标记的家系或个体；且上述一)、牙鲆群体选育包括：牙鲆抗病群体选育和/或不同地理群体的选育，以得到牙鲆抗病选育的第一代；上述二)、牙鲆家系选育包括1)、通过种内杂交建立抗病家系，以及2)、抗病家系的筛选，和3)、抗病家系的生长性状选育，以得到牙鲆抗病选育的第二代。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于还包括四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育，该人工雌核发育选育是1)将抗病选育的第二代的抗病家系进行人工雌核发育诱导；以及2)人工雌核发育家系的抗病性能选育；和3)人工雌核发育家系的生长性状选育，以得到牙鲆抗病选育的第三代。

上述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于还包括五)、牙鲆抗病家系的近交选育；该近交选育是1)抗病家系的近交家系的培育；以及2)近交家系抗病性能和生长性状选育，以得到牙鲆抗病选育的第三代。

下面将从一)、牙鲆群体选育；二)、牙鲆家系选育；三)、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育；四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育；五)、牙鲆抗病家系的近交选育等五个方面分别进行详细说明：

一)、牙鲆群体选育，包括：牙鲆抗病群体和/或不同地理群体的选育，其中：

1、牙鲆抗病群体的选育，采用如下2种方法或其中一种进行抗病群体的筛选：

1).从养殖的发病鱼苗中选育抗病群体：在每年7-10月份，通过调查山东沿海地区多个牙鲆养殖场的牙鲆鱼苗患病情况，在确认某个养殖池塘的牙鲆鱼苗是因鳗弧菌感染死亡后存活下来的，应选择那些85-90％以上的鱼苗死亡、而只有约10-15％的鱼苗存活下来的才收集起来进行培养。将这些鱼苗培育成亲鱼，达到性成熟，作为牙鲆抗鳗弧菌病群体。抗病群体一般应由至少100尾以上抗病个体组成。抗病群体的养殖和繁殖按照常规方法进行。

2003年7-10月，共调查了山东沿海地区的4个牙鲆养殖场，收集到患鰻弧菌病后存活的牙鲆鱼苗300多尾，经过一年的养殖后，又有一些鱼苗相继死去，最后选择了近200尾体质好的鱼作为抗病群体进行培养和繁殖。

2)、通过人工感染选育抗病群体

在每年的8-10月份，从山东牙鲆养殖场人工繁殖的中国牙鲆苗种中选取3.5-5.5月龄牙鲆鱼苗2000-3000尾，饲养在水泥池中，采用人工培养的鳗弧菌进行浸泡感染，将鳗弧菌(Vibrio anguillarum)接种在灭菌的特定培养基中(配方为：蛋白胨5g，酵母提取物1g，FePO4·4H2O 0.1g，陈海水1000mL)，于28℃培养约18-20h，将培养好的鳗弧菌离心后，收集菌体用生理盐水洗涤1次，然后用生理盐水将细菌沉淀稀释成浓度为20-30OD的菌液。将上述菌液用海水稀释成不同的浓度(稀释50、100、200、400，800倍)，采用浸泡方法将鳗弧菌感染给鱼体，即将400-600尾鱼苗浸泡在含有不同浓度鳗弧菌的海水中，感染2-6小时后，将鱼苗转到新鲜海水中进行养殖观察。2天后，逐渐开始有鱼苗死亡，鱼苗死亡大概持续4-8天，从死亡率达60-80％的感染组中收集存活的个体，继续培育直至性成熟，用作牙鲆抗病群体。抗病群体一般应由100尾以上抗病个体组成。采用这种方法获得抗病牙鲆鱼苗150多尾，其中近100尾培育成亲鱼，作为牙鲆抗病选育第一代。

2、不同地理群体的选育

收集来自不同国家或中国不同海域的牙鲆鱼苗，例如日本、韩国群体、中国黄海、东海沿岸地区野生或养殖的牙鲆鱼苗等，放在室内水泥池中进行养殖。选择各地理群体中规格比较整齐、体质健壮的鱼苗进行培育和筛选，当鱼苗生长至10-13厘米时，从3000-5000尾鱼苗中选出个体较大的150-250尾进行单独养殖，选择强度约为5％，将这些鱼苗培育至性成熟，作为不同地理群体用于牙鲆家系的构建。

本发明中，从日本沿海地区收集牙鲆日本群体鱼苗，经过人工培育后选择其中的30多尾，培育至性成熟，从而建立了牙鲆日本群体(JS)；从韩国沿海地区收集了韩国群体鱼100多尾培育至性成熟，建立了韩国群体(KS)。同时，从黄海水域收集的牙鲆野生鱼苗中选育出体质健壮、生长快的鱼苗100多尾，培育至性成熟，称为黄海群体(YS)，另外还选育了一批中国养殖群体(CCS)鱼苗200多尾。经过3年多的培育，上述各群体牙鲆鱼生长到体长为40～70cm，体重为1.2～3.5kg；其中部分鱼达到性成熟。

将抗病群体(RS)、日本群体(JS)、韩国群体(KS)、中国养殖群体(CCS)以及黄海野生群体(YS)等5个不同来源的牙鲆基础群体亲鱼养殖在不同水泥池中，或者采用电子标记法对其进行个体标记，每尾亲鱼给一个标记号，以便配对繁殖时识别亲鱼来源。

二、牙鲆家系选育：主要包括：1、通过种内杂交建立牙鲆家系；2、牙鲆抗病家系的筛选；3、抗病家系的生长性状选育，其中

1、通过种内杂交建立牙鲆家系

在家系鱼苗临近孵化出膜时，将其转移到育苗缸中进行苗种培育，每缸培育一个家系；每立方米水体培育5000-10000尾仔鱼；

利用上面建立的牙鲆抗鳗弧菌病群体和/或来自不同地理区域的牙鲆群体作为基础群体，通过种内不同群体杂交的方法建立牙鲆家系。将抗病群体的雄鱼或雌鱼分别与不同地理群体的雌鱼或雄鱼进行配对繁殖建立家系，或将一个地理群体与另一个群体杂交建立家系。从抗病群体和不同地理群体中选取达性成熟的亲鱼，利用来自1尾雄鱼的精液和来自1尾雌鱼的卵子进行授精，将受精卵孵化成鱼苗，这样长成的鱼苗即为一个家系；精卵采集、授精和孵化按常规方法进行。本发明中主要采用牙鲆抗病群体的雄鱼或雌鱼分别与不同地理群体的雌鱼或雄鱼进行配对繁殖建立家系；同时，也将来源于一个地理群体的亲鱼与另一个地理群体的亲鱼进行交配，建立家系。大多数情况下，是将一尾雄鱼的精液与一尾雌鱼的卵授精，建立全同胞家系；有时是将同一尾雄鱼的精液分别与多尾雌鱼的卵进行授精，建立半同胞家系；或将1尾雌鱼的卵分成多份，分别与多尾雄鱼的精子进行授精建立半同胞家系。牙鲆精卵的采集和人工授精按常规方法进行。将来自一尾雄鱼和一尾雌鱼交配产生的受精卵(即一个家系)放在一个置于水泥池中的网箱中或一个水槽中进行孵化。在家系鱼苗临近孵化出膜时，将其转移到育苗缸中进行苗种培育，每缸培育一个家系；每立方米水体培育5000-10000尾仔鱼；牙鲆鱼苗的培育和管理按照常规方法进行。一般每次应该建立20-70个家系用于抗病家系的选育。

本发明于2006-2009年4月中、下旬进行牙鲆家系的建立工作。在此期间，选取能挤出卵子的雌鱼和能挤出精液的雄鱼作为家系建立的亲鱼。采用抗病群体x抗病群体、抗病群体x日本群体；抗病群体x黄海群体、韩国群体x日本牙鲆、韩国群体x中国养殖群体等交配策略建立家系，近几年来，利用抗病群体雄鱼和雌鱼交配，或者分别与日本群体雌鱼和雄鱼、黄海野生群体雌鱼和雄鱼进行交配授精，共建立了牙鲆家系50多个。利用不同地理群体交配建立了家系近20个，将上述家系经过2年的培育后，有一些家系的个体于2009年达性成熟，即进行了家系的繁殖。

2、牙鲆抗病家系的筛选：采用如下2种方法筛选牙鲆抗病家系：

1)通过人工感染方法筛选牙鲆抗病家系：

当家系鱼苗培育到3.5-5.5月龄时，从各家系中选取150-250尾鱼苗进行鳗弧菌感染，采用浸泡方法进行鱼苗感染，感染用菌株及弧菌的培养按照前面描述的方法进行。首先进行预感染实验确定半致死浓度，预感染实验用鱼为来自各个家系的相同数量鱼苗的混合群体；将培养好的菌液用生理盐水稀释成浓度为20-30OD的菌液，将上述菌液用海水稀释成不同的浓度(稀释50、100、200、400、800倍)，将100-200尾混合家系鱼苗放在不同浓度菌液的海水中浸泡2-6小时，然后将鱼苗转到新鲜海水中养殖，在随后的5-15天内计算不同浓度组的鱼苗死亡率，将引起40-50％的鱼苗死亡的浓度确定为半致死浓度；随后采用半致死浓度进行正式感染，感染方法同预感染实验；每个家系每次感染75-125尾鱼苗，重复实验1次；每个家系感染用鱼养殖在1-2m³的水槽中；感染10-30天后，计算各家系鱼苗的存活率，根据存活率采用SAS软件中Logistic模块计算各家系抗病力的优势比，根据优势比确定各家系的抗病能力；将抗病力优势比在7以上的家系定为抗病家系，在3-7之间的家系定为较抗病家系，在1-3之间的家系定为抗病力一般家系，在1以下的家系确定为不抗病家系；将抗病家系鱼苗培育成熟后就可以大量生产抗病的牙鲆苗种或用于进一步选育；

按照上述标准，从50多个来自于抗病群体生产的牙鲆家系中，经过感染实验初步筛选出抗病能力强的家系3个，分别命名为鲆抗1号、鲆抗2号和鲆抗3号，这3个家系抗鳗弧菌病能力的优势比分别为8.5、8.5、7.4；抗病力比较强的家系15个，其抗病力优势比为3.3-5.3之间；抗病力一般的家系30个，抗病力差的家系7个；现将其中24个代表性家系的抗病力优势比列于图1。其中，鲆抗1号家系的父本为抗病群体46号个体，母本则为日本群体的15号个体；鲆抗2号家系的父本为抗病群体12号个体，母本为日本群体的21号个体；鲆抗3号家系的父本为日本群体的18号个体，母本为抗病群体的7号个体。由此可见，3个抗病家系都是由抗病群体和日本群体组合交配产生的。

同时，对日本群体、韩国群体及中国黄海养殖群体相互交配产生的近20个家系也进行了抗病家系筛选。通过鳗弧菌菌感染，发现2个家系(15号和17号)的抗病力优势比分别为30.9和19.3，为抗病家系，分别命名为鲆抗15和鲆抗17，这2个抗病家系分别为韩国群体与日本群体和中国养殖群体交配产生的家系；从中还筛选出抗病力比较强的家系3个；抗病力一般的家系4个；不抗病的家系6个(表1)。

表1：牙鲆不同地理群体交配产生的家系抗病力的优势比

JS：日本群体；KS：韩国群体；YS：黄海群体

2)通过家系鱼苗养殖存活率筛选牙鲆抗病家系：

通过观察不同家系鱼苗在养殖过程中的存活率，也可以评价不同家系鱼苗的抗病能力。将3.5-5.5月龄的牙鲆不同家系鱼苗300-500尾左右放在规格相同的水泥池中养殖，保持不同家系鱼苗养殖条件相同，测量鱼苗放养时的体长和体重，养殖10-15个月以后，计数各家系鱼苗的存活率；将存活率高于其它家系或对照组的家系确定为抗病家系，选择出来进行繁育，用于大量生产抗病的牙鲆新品系苗种或用于进一步选育；上述抗病家系作为牙鲆抗病选育第二代；投喂管理按常规方法进行。

2007年初步选育出的3个抗病候选家系鱼苗(鲆抗1号、鲆抗2号和鲆抗3号)，经过近14个月的养殖后，统计各家系存活鱼苗的数量，鲆抗1号家系鱼苗的存活率为73％，明显高于对照组和鲆抗2号以及鲆抗3号的存活率(P≤0.05)，而鲆抗2号和鲆抗3号家系鱼苗的存活率为32％左右，比对照组稍高一些(图2)。由此可以看出，鲆抗1号家系的抗病能力高于其它各家系，属于抗病力强的家系，将鲆抗1号家系选择出来进行繁育，就可以大量生产抗病的牙鲆新品系苗种或用于进一步选育。

通过对不同地理群体产生的家系进行养殖表明，日本群体和黄海群体交配产生的家系中有2个家系鱼苗在养殖1年后的存活率分别为70％和68％，明显高于对照组(32％)，这2个由不同群体产生的抗病家系分别命名为鲆抗4号和鲆抗5号(图3)，分别由日本群体12号和日本群体4号与黄海养殖群体27号和9号交配产生。由此表明，通过检测不同地理群体杂交产生的家系的养殖存活率，也可以筛选出抗病力强的牙鲆家系。

3.抗病家系的生长性状选育：鱼类抗病和生长性状往往较难集中在一个个体身上，有时候一个家系的抗病能力强，但生长速度却并不快。因此，在选择抗病性状的时候，也不能忽略了生长性状，如果选育出来的抗病家系的生长速度很慢，那也没有很大的推广应用价值。最好是选育出来的抗病家系也具有良好的的生长性状，至少其生长速度不能下降。因此在进行抗病家系选育时，有必要对选育出来的抗病家系进行生长性状的评价，选育出抗病能力强、生长也较快的优良品系。

具体方法是，当抗病家系鱼苗生长至9-12厘米时，随机取200-300尾鱼，每个家系采样40-60尾鱼苗测量体长和体重，作为放养时的体长和体重，按照常规方法进行分池养殖，或者对不同家系进行标记后放在同一水泥池中进行养殖；在养殖8-15个月后收集各家系鱼苗进行体长和体重测量，每个家系的鱼苗全部测完或采样40-60尾鱼苗进行测量，计算各个家系体长、体重的平均数，利用日增重率(养殖期间增加的重量(或体长)/实际养殖时间)评价不同家系的生长性能，日增重率越大，生长越快，将生长快的抗病家系选择出来，进行繁育，用于大量生产抗病的牙鲆新品系苗种或用于进一步选育；通过这种方法就可以筛选出抗病能力强、生长性能好的鱼类新品系。

按照上述方法，对选育出的鲆抗1号、鲆抗2号和鲆抗3号3个抗病家系的生长性状进行了选育。经过近14个月的养殖后，鲆抗1号、2号和3号3个抗病家系的日增重率分别为：0.3、0.27和0.19。由此可见，尽管鲆抗1号、2号和3号鱼苗在进行人工感染时的抗病力优势比都在7以上，但经过严格的生长对比实验表明鲆抗1号鱼苗的日增重率高于鲆抗2号和鲆抗3号，同时也高于3个对照组(图4)。因此，本发明将鲆抗1号作为生长速度较快的抗病家系，可以用于大量生产抗病的牙鲆新品系苗种或用于进一步选育。

同时对来自不同地理群体交配产生的牙鲆抗病家系的生长性能也进行分析，发现抗病家系鲆抗15和鲆抗17的日增重率分别为0.214和0.23，高于同期实验的其它家系(表2)。

表2：不同地理群体交配产生的牙鲆家系鱼苗的生长比较

三、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育，包括：1)抗病家系特异分子标记的筛选，2)抗病分子标记辅助选育，其中：

1.抗病家系特异微卫星标记的筛选

对筛选出的牙鲆抗病家系进行微卫星标记分析，选取20-30尾牙鲆抗病家系的鱼苗，按常规方法采集鳍条DNA样品，用8-10个多态性牙鲆微卫星标记，对抗病家系和不抗病家系鱼苗DNA进行分析，找出抗病家系特有的微卫星分子标记，用作抗病家系选育的分子标记。

1).微卫星标记引物

本项发明中所采用的微卫星标记主要是8对多态性微卫星引物(JF1：F：GTTTGCACTAATGCGTGTCTC，R：AGGCTAAACAACA ACAATGTCC；JF2：F：GATGAATCACCTGCCAAAAG，R：GCTTCATCA GTTTGAATGGT；JF3：F：GTTCAAAAACACTGCGACAG，R：CTCT ATTTTGTCGACGTTCC；JF4：F：GGACCAGCAGGTGTTCTA，R：TTC TCCAGCTCAGAGATGAT；JF5：F：GCCCTCCCTCCATCAG CCATAA，R：GAGACTGTCCATTCGGGGGTTCA；JF6：F：GTCGAGCTTTTTCAAGATGA，R：TACTTGTCATCCAGAGCAG；JF7：F：TCTACTCAGAGCCAACAAG，R：ATCAGTCTGCACCTGAATG；JF8：F：CATACAGTAATCGGCATGTG，R：TTCAAAAGAGAGGGACACAG)。

这些多态性微卫星标记的信息见表3。

表3：牙鲆家系鉴定用多态性微卫星标记信息表

2)微卫星标记的分析

(1)、基因组DNA的提取

采用常规方法提取已经收集保存的牙鲆鳍条DNA样品。简言之，主要采用酚/氯仿法提取基因组DNA，取50-100mg鳍条置于1.5ml离心管中，加500μl组织提取液(Tris-C110mmol/L，EDTA 0.1mol/L，SDS 0.5％，pH 8.0)，10μl蛋白酶K(20mg/mL)，5μlRNA酶，充分混匀，于55℃水浴锅消化至澄清。向离心管中加入500μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，缓慢摇动离心管，充分混合10min，12000r/min离心10min；吸取上清于另一离心管中，加入等体积的酚氯仿抽提，缓慢摇动，充分混合10min，12000r/min离心10min；再吸取上清于另一离心管中，加2倍体积的冰无水乙醇沉淀DNA，轻轻摇晃离心管，可见有絮状沉淀产生，12000r/min离心10min；小心倒掉冰乙醇，用70％乙醇洗2次；待酒精挥发干后，用TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA)溶解DNA。

(2)、PCR扩增

PCR反应体系为25μl，包括1×PCR buffer，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，0.4μM引物，1U的Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，约100ng基因组DNA。PCR扩增条件94℃预变性4min；然后94℃变性30s，52～59℃退火50s，72℃延伸50s，共32个循环；最后72℃终延伸7min。

(3)、聚丙烯酰胺凝胶电泳

在PCR产物中加入1/2体积的甲酰胺上样液(0.01M EDTA，1mg/ml溴芬蓝，1mg/ml二甲苯青)于95℃变性5分钟，然后立刻放在冰上。在6％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以pBR322DNA/Msp I(TIANGEN)为标记。采用银染法染色。

3).本发明采用8个微卫星标记对9个牙鲆家系进行了分析，筛选抗病家系特异微卫星分子标记。在8个微卫星标记中，有一个标记引物JF7，在2007年建立的一个牙鲆抗病家系

(鲆抗1号)中发现了2种特异的等位基因型组合，256bp/264bp和258bp/264bp，在检测的20个个体中，这2种基因型组合各占50％，而其它家系则都不含有这2种基因型组合，因此，这2种基因型组合可以作为鲆抗1号的特异分子标记，通过这2个特异分子标记就可以将选育出的抗病家系-鲆抗1号与其它家系区分开来，该特异标记随后用于牙鲆抗病新品系的选育。鲆抗1号特异等位基因-特异微卫星标记在鲆抗1号家系中的电泳结果见表4。

表4  牙鲆2007年家系微卫星标记分析

采用上述方法可以从2007年的家系中将鲆抗1号家系鱼苗筛选出来，用于下一步的抗病良种选育。

2.抗病分子标记辅助选育

利用抗病家系特有微卫星标记对不同家系进行筛选，选择抗病家系中具有特异微卫星标记的个体，作为亲本进行繁殖，产生抗病家系后代家系鱼苗；随后用该特异分子标记检测抗病家系后代家系，同时对抗病家系后代家系鱼苗的抗病性能进行选育，将具有抗病家系特异标记，同时抗病能力强的个体选择出来，从中选择出具有抗病家系特异微卫星标记的家系或个体，用于繁育养殖或进一步选育，就可以大量生产抗病的牙鲆新品系苗种。

例如，本发明采用2007年筛选出的牙鲆抗病家系进行繁殖，于2009年又建立了牙鲆抗病家系的后代家系10多个。采用抗病家系特异的微卫星标记对2009年建立的牙鲆抗病家系进行微卫星标记分析，选取20-50尾牙鲆抗病家系的鱼苗，按照常规方法采集鳍条DNA样品，采用鲆抗1号牙鲆抗病家系特异的微卫星标记引物JF7，对来源于鲆抗1号的7个家系鱼苗DNA进行分析，表明在鲆抗1号家系的后代中，不管是近交家系(2009-5和2009-90)、雌核发育家系(2009-27)，都检测到鲆抗1号特异微卫星标记的存在，在有的后代家系中存在3种或4种基因型，这些基因型包括256/256，256/258，256/264，258/264，264/264等5种类型(表5)，同时，这些家系的抗鳗弧菌病的能力都较强，因此，可以通过检测抗病家系特异微卫星标记的存在与否辅助牙鲆抗病优良品系的选育。

表5鲆抗1号家系后代(抗病选育第三代)的基因型检测

四、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育

通过人工雌核发育技术对牙鲆抗病家系进行纯化和进一步的选育，包括：1、牙鲆抗病家系的人工雌核发育诱导；2、人工雌核发育家系的抗病性能选育；3、人工雌核发育家系的生长性状选育，其中：

1、牙鲆抗病家系的人工雌核发育诱导

利用选育出的牙鲆抗病家系(牙鲆抗病选育第二代)培育出的亲鱼进行繁殖产卵，进而进行雌核发育诱导，培育出抗病牙鲆第二代的雌核发育家系(牙鲆抗病选育第三代)。雌核发育诱导采用异源鱼类精子进行，异源鱼类精子来自与牙鲆亲缘关系较远的鱼类，如鲈鱼、大菱鲆等，因为这些鱼类精子与牙鲆卵杂交后子代不能存活，因此诱导出的雌核发育鱼苗非常可靠。异源精子可以用新鲜精子，也可以用长期冷冻保存的精子。鱼类精子的冷冻保存采用MPRS稀释液(NaCl 60.35mM，NaH₂PO₄1.8mM；NaHCO₃3mM，KCl 5.23mM，CaCl₂.2H₂O1.13mM，MgCl₂.6H₂O 1.13mM，D-Glucose 55.55mM)，或TS-2稀释液(Tris-Cl 9-11mM，pH 8.0，蔗糖105-115mM，KHCO₃95-105mM，9-11％胎牛血清(体积比))。在鲈或大菱鲆繁殖季节采集成熟的精子，将在4-8℃预冷的MPRS稀释液与市售二甲亚砜DMSO溶液按8∶2比例混合，然后将新鲜精液与MPRS-DMSO混合液按体积比1∶1的比例进行混合，随后将稀释后的精子分装在2.0ml冷冻管中，采用快速冷冻法放在液氮中进行冷冻保存。

本发明中选育出的牙鲆抗病家系(鲆抗1号)鱼苗经过2年培育后，于2009年3-4月达到性成熟。选择腹部明显膨大、手摸腹部感觉柔软的抗病牙鲆雌鱼，通过人工挤压腹部法采集未受精卵。将采集的未受精卵置于干燥的烧杯中待用，随后，从液氮罐中取出冷冻保存的异种海水鱼精子，放在37-39℃水浴中快速解冻，并用MPRS或TS-2稀释液将精子以1∶10的比例稀释，将稀释后的冻精1ml平铺在直径为10cm的培养皿中，置于80-100mJ/cm²紫外线下照射，使精子遗传物质失活，然后加入牙鲆未受精卵中，添加少量海水完成“受精”过程。通常，1毫升冷冻精液可以与100-200毫升卵子“受精”。在精卵混合后3-6min后，将卵转入静水压机压力缸中，采用62，64、66、68和72Mpa的静水压力，分别处理4，5，6，7，8，9分钟，诱导染色体加倍，然后将卵转入14-20℃海水中孵化；将来自一条雌鱼的卵放在一个网箱或者水槽中孵化，这样就建立了一个雌核发育家系。通过比较发现，只有在66-68Mpa压力下，休克处理6-7分钟，牙鲆胚胎染色体加倍率最高，达60-80％。采用这种方法共建立了鲆抗1号雌核发育家系2个，其它牙鲆雌核发育家系2个。将雌核发育家系鱼苗进行培育和养殖。

2、人工雌核发育家系的抗病性能选育：

当牙鲆抗病家系的雌核发育家系鱼苗生长至3.5-5.5月龄时进行鳗弧菌浸泡感染，评价各家系的抗鰻弧菌病性能。从每个家系中随机取样150-250尾，每次感染75-125尾，感染方法按前面描述的浸泡法进行。感染后10-30天计算各家系的存活率。将鰻弧菌感染后存活率在51-60％以上的家系称为抗病家系，存活率在31-50％之间的家系称为较抗病家系，存活率在21-30％之间的家系称为中等抗病家系，存活率在20％以下的家系称为不抗病家系。将存活率高的雌核发育家系筛选出来，作为牙鲆抗病选育的第三代，培育成熟后就可以大量生产抗病的牙鲆新品系苗种。

本发明中于2009年建立的抗病牙鲆“鲆抗1号”家系的雌核发育家系的存活率达到65％，显著高于其它雌核发育家系和对照组的存活率，同时也高于鲆抗1号或鲆抗3号与其它家系杂交产生的家系的存活率(p＜0.05)(表6)，表明来源于抗病家系鱼卵的雌核发育鱼苗的抗鳗弧菌病力也高于对照组，证明2007年选育出的鲆抗1号抗病家系的抗病性能通过一代雌核发育得到了加强和纯化，雌核发育是进行抗病品种选育的有效手段。将上述雌核发育鱼苗培育成熟后进行繁殖就可以大量生产抗病的牙鲆新品系苗种。

表6：2009牙鲆雌核发育家系(牙鲆抗病选育第三代)抗鳗弧菌病能力比较

*差异显著(P＜0.05)

3、人工雌核发育家系的生长性状选育

当抗病牙鲆家系的雌核发育家系鱼苗生长至体长为3.5-5.5月龄左右时进行生长对比试验，进行雌核发育家系的生长性状选育。在体积为3立方米的水槽中饲养1000-1500尾鱼苗，每个家系饲养在一个水槽中，每个水槽中放养的鱼苗密度相同。养殖管理按照常规方法进行。经过2个半月到4个月的养殖后，测量鱼体长、称量体重，计算日增重率。日增重率越大、生长性能越好。按此方法，实验表明来源于2007年抗病家系(鲆抗1号)雌核发育家系鱼苗的日增重率为0.113，高于同期的对照组(0.080)。说明雌核发育在强化抗病性状的同时，也保留了抗病家系的生长优势。

五、牙鲆抗病家系的近交选育，包括：1.牙鲆抗病近交家系的制备；2.近交家系抗病性能和生长性状的选育，其中：

1.抗病牙鲆近交家系的制备：采用筛选出的抗病家系特异的微卫星标记引物JF7，从2007年选育出的抗病家系成熟个体中选取具有256bp/264bp或258bp/264bp特异基因型组合的雌鱼和雄鱼，采用常规方法收集雌鱼的卵子和雄鱼的精液，将来自同一家系的一尾雄鱼的精液和一尾雌鱼的卵子进行授精，将授精卵置于2-3立方米的水槽中进行孵化和育苗，这样制作的家系为近交家系，将近交家系鱼苗按常规方法进行培育和养殖；2009年共建立鲆抗1号近交家系2个、鲆抗3号近交家系1个、其它牙鲆近交家系1个。

2.近交家系抗病性能和生长性状的选育。

当抗病牙鲆的近交家系鱼苗培育到3.5-5.5月龄时，进行鳗弧菌感染，评价各家系的抗鰻弧菌病性能。从每个家系中随机取样150-250尾，每次感染75-125尾，感染方法按前面描述的浸泡法进行。感染后10-30天计算各家系的存活率。根据存活率高低评价近交家系的抗病能力。按照前面介绍的标准进行评价。2009年采用2007年选育出的鲆抗1号抗病家系建立了2个近交家系，其平均存活率为65％，明显高于来源于2007年其他家系建立的近交家系(32％和22％)，也明显高于普通牙鲆对照组的存活率(18-23％)(表7)。因此，采用近亲交配技术可以将牙鲆抗病家系的抗病性能进一步加强和纯化，是培育牙鲆抗病优良品种的重要手段。采用鲆抗1号抗病家系或其近交后代家系亲鱼进行繁殖就可以大量生产抗病的牙鲆新品种苗种。

表7：2009年牙鲆近交家系(抗病牙鲆选育第三代)抗鳗弧菌病能力比较

同时，采用前面描述的方法，测定了近交家系的日增重率，进行了近交家系的生长性状选育。表明来源于2007年抗病家系(鲆抗1号)的2个近交家系鱼苗的日增重率分别为0.134和0.115，与生长最快的一个近交家系(2009-92)的生长率相当，但高于鲆抗3号的近交家系的日增重率0.110，也明显高于同期的对照组(0.080)(表8)。说明，近亲交配在加强和纯化抗病性状的同时，也保留了抗病家系的生长优势。将鲆抗1号或其近交家系培育成熟后进行繁殖就可大量生产牙鲆抗病新品系苗种。

表8：2009年牙鲆近交家系(牙鲆抗病选育第三代)鱼苗的生长性能比较

经过上述群体选育、家系选育、抗病分子标记辅助选育、人工雌核发育选育或近交选育出来的牙鲆抗病家系和/或其雌核发育或近交后代家系鱼苗具有稳定的抗病性能和生长性状，可作为抗病优良品系苗种进行大量繁殖和推广应用。

2009年在山东海阳黄海水产有限公司生产牙鲆抗病家系后代苗种80万尾，这些苗种分别在山东日照、山东威海、烟台、辽宁营口等地进行对比养殖实验。现将在其中2个养殖场进行的生产性对比养殖试验结果总结如下；

1).山东日照全国水产技术推广总站实验基地进行的抗病牙鲆对比试验：2009年6月底放养抗病牙鲆苗种规格为8.52±1.1，共放养13360尾；对照组放养牙鲆普通鱼苗规格为8.32±1.2，共养殖6000尾；在11月初进行测定，抗病牙鲆鱼苗平均体长为22.2厘米，体重平均为112.5克，数量为10342尾，成活率为77.4％；而对照组体长平均为17.1厘米，体重平均为46.4克，成活鱼数量为1801尾，成活率为30％。由此可见，采用本发明技术选育出的牙鲆抗病优良品种的成活率比对照组高47％、体长增长比对照组高29.8％以上，表现出明显的抗病和生长优势(表9)。

表9：鲆抗1号后代鱼苗生产性对比养殖试验

2).2009年7月，将在海阳黄海水产有限公司培育的牙鲆抗病家系苗种运送到辽宁营口盖州市华威养殖有限责任公司进行生产性对比养殖实验。2009年7月5日放养抗病牙鲆鱼苗10000尾，同时放养当地牙鲆普通苗种10000尾，经过近5个月的养殖，在收获时，抗病牙鲆鱼苗存活8750尾，存活率为87.5％；普通牙鲆鱼苗存活6490尾，存活率为64.9％；抗病苗种比对照组成活率提高22.6％。显然，本发明选育出的牙鲆抗病优良品系具有明显的抗病优势。

Claims (8)

1.一种牙鲆抗病优良品系选育方法，包括一)、牙鲆群体选育；二)、牙鲆家系选育；其特征在于还包括三)、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育；该辅助选育包括1)抗病家系特异分子标记的筛选以得到抗病家系的特异微卫星标记，然后利用该特异微卫星标记进行2)抗病分子标记辅助选育以得到具有抗病家系特异微卫星标记的家系或个体；且上述一)、牙鲆群体选育包括：牙鲆抗病群体选育和/或不同地理群体的选育以得到牙鲆抗病选育的第一代；上述二)、牙鲆家系选育包括1)、通过种内杂交建立抗病家系，以及2)、抗病家系的筛选，和3)、抗病家系的生长性状选育以得到牙鲆抗病选育的第二代。

2.如权利要求1所述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于还包括四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育，该人工雌核发育选育是1)将抗病选育的第二代的抗病家系进行人工雌核发育诱导；以及2)人工雌核发育家系的抗病性能选育；和3)人工雌核发育家系的生长性状选育以得到牙鲆抗病选育的第三代。

3.如权利要求1或2所述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于还包括五)、牙鲆抗病家系的近交选育；该近交选育是1)抗病家系的近交家系的培育；以及2)近交家系抗病性能和生长性状选育以得到牙鲆抗病选育的第三代。

4.如权利要求1所述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于一)、牙鲆群体选育是1)、牙鲆抗病群体选育和/或2)、牙鲆不同地理群体选育：

且1)、牙鲆抗病群体选育又是以下两种方法的其中一种：

(1)从养殖的牙鲆发病鱼苗中选育抗病群体：在7-10月份，确认是因鳗弧菌感染而造成鱼苗死亡的养殖池塘，收集那些85-90％以上的鱼苗死亡、而只有10-15％的鱼苗存活的养殖池的鱼苗，培育成亲鱼并达到性成熟，并作为牙鲆抗病选育第一代；

(2)通过细菌感染选育牙鲆抗病群体：选取3.5-5.5月龄牙鲆鱼苗2000-3000尾，饲养于水泥池；将鳗弧菌培养物稀释成50、100、200、400，800倍的不同浓度，再将400-600尾鱼苗浸泡在不同浓度鳗弧菌的海水中，浸泡感染2-6小时后转到新鲜海水中养殖观察；2天后鱼苗开始死亡，死亡持续4-8天，10-30天后，计算不同浓度组的存活率，并收集死亡率为60-80％的鱼池中存活的鱼苗，并作为牙鲆抗病选育第一代；

2)、牙鲆不同地理群体的选育：

收集来自不同国家或海域的牙鲆鱼苗，选择各地理群体中规格整齐、体质健壮的鱼苗进行培育和筛选，当鱼苗生长至10-13厘米时，以5％为选择强度，从3000-5000尾鱼苗中选出个体大的150-250尾进行单独养殖直至成熟，并作为牙鲆抗病选育第一代。

5.如权利要求1所述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述二)、牙鲆家系选育中的1)、通过种内杂交建立家系是：将抗病群体的雄鱼或雌鱼分别与不同地理群体的雌鱼或雄鱼进行配对繁殖建立家系，或将一个地理群体与另一个地理群体杂交建立家系；在鱼苗临近孵化出膜时，将其转移到育苗缸中进行培育，每缸培育一个家系，且每立方米水体培育5000-10000尾仔鱼；

上述二)、牙鲆家系选育中的2)、牙鲆抗病家系的筛选是以下两种方法的其中一种进行：

(1)通过细菌感染筛选抗病家系：当鱼苗培育到3.5-5.5月龄时，从各家系中选取150-250尾鱼苗进行鳗弧菌浸泡感染；首先进行预感染实验确定半致死浓度，即选取来自各个家系的相同数量鱼苗的混合群体，用生理盐水稀释已培养好的鳗弧菌菌液至浓度为20-30OD，将上述菌液用海水稀释成50、100、200、400、800倍的不同浓度，再将100-200尾混合家系鱼苗放在不同浓度菌液的海水中，浸泡感染2-6小时后转到新鲜海水中养殖观察，在随后的5-15天内计算不同浓度组的鱼苗死亡率，将引起40-50％的鱼苗死亡的浓度确定为半致死浓度；随后采用半致死浓度进行正式感染，方法同预感染；每个家系每次感染75-125尾鱼苗，重复实验1次；每个家系感染用鱼养殖在1-2m³的水槽中；感染10-30天后，计算各家系鱼苗的存活率，根据家系的存活率、交配方式、父母本来源以及家系建立时间，采用SAS软件中Logistic模块计算各家系抗病力的优势比；将抗病力优势比在7以上的家系定为抗病家系，在3-7之间的家系定为较抗病家系，在1-3之间的家系定为抗病力一般家系，在1以下的家系定为不抗病家系；将抗病家系鱼苗作为牙鲆抗病选育第二代，以进行繁育养殖或进一步选育；

(2)通过家系鱼苗养殖存活率筛选抗病家系：

将3.5-5.5月龄的不同家系鱼苗300-500尾放在规格相同的水泥池中养殖，保持养殖条件相同，测量鱼苗放养时的体长和体重，养殖10-15个月以后计算各家系鱼苗的存活率；将存活率高于其它家系或对照组的家系确定为抗病家系，将抗病家系鱼苗作为抗病牙鲆选育第二代，以进行繁育养殖或进一步选育。

6.如权利要求1所述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述三)、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育中的1)抗病家系特异分子标记的筛选是：

采用8-15个多态性微卫星标记对牙鲆家系进行基因组分析，每个家系分析10-20个以上个体，DNA采自鱼苗尾鳍；根据不同家系微卫星DNA片段的大小和数量确定不同家系的基因型；从8对多态性标记引物中筛选出一对微卫星标记引物JF7，F：TCTACTCAGAGCCAACAAG，R：ATCAGTCTGCACCTGAATG，该对引物在1个牙鲆抗病家系中扩增出2种特异的等位基因型，256bp/264bp和258bp/264bp，2种基因型组合用作抗病家系的特异微卫星标记，用于抗病分子标记辅助选育；

上述三)、牙鲆抗病家系的分子标记辅助选育中的2)抗病分子标记辅助选育是：

利用抗病家系特异微卫星标记对不同家系进行筛选，选择抗病家系中具有特异微卫星标记的个体，作为亲本进行繁殖，产生抗病家系后代家系鱼苗；随后用该特异分子标记检测抗病家系后代家系，从中选择出具有抗病家系特异微卫星标记的家系或个体，用于繁育养殖或进一步选育。

7.如权利要求2所述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育中的1)抗病家系的人工雌核发育诱导是：利用牙鲆抗病家系即抗病选育第二代亲鱼进行雌核发育诱导，培育抗病家系的雌核发育家系；雌核发育诱导采用异种鱼类精子进行，选用与牙鲆亲缘关系较远的异源鱼类新鲜或冷冻精子作为诱导雌核发育的精子；在牙鲆繁殖季节，选择腹部膨大的牙鲆抗病家系雌性亲鱼，通过人工挤压腹部法采集未受精卵，置于干燥的烧杯中待用，随后从液氮罐中取出冷冻保存的异种海水鱼精子，放在37-39℃水浴中快速解冻，并用MPRS或TS-2稀释液稀释，将稀释后的冻精用80-100mJ/cm²紫外线照射，然后与未受精卵混合，3-6min后，将卵转入静水压机压力缸中，采用66-68Mpa的静水压力，处理6-7分钟，诱导染色体加倍，然后将卵转入14-20℃海水中孵化；将来自一条雌鱼的卵放在一个网箱中孵化，即建立了一个雌核发育家系；

上述四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育中的2)人工雌核发育家系的抗病性能选育是：当雌核发育家系鱼苗生长至3.5-5.5月龄时进行鳗弧菌浸泡感染，从每个家系中随机取样150-250尾，每次感染75-125尾，感染后10-30天计算各家系的存活率；将存活率在51-60％以上的家系定为抗病家系，存活率在31-50％之间的家系定为较抗病家系，存活率在21-30％之间的家系定为中等抗病家系，存活率在20％以下的家系定为不抗病家系；将存活率高的雌核发育家系筛选出来作为牙鲆抗病选育的第三代进行繁殖和养殖；

上述四)、牙鲆抗病家系的人工雌核发育选育中的3)、人工雌核发育家系的生长性状选育是：当雌核发育家系鱼苗生长至3.5-5.5月龄时进行生长性状选育，将生长性能良好的雌核发育家系筛选出来，培育成熟后进行繁殖。

8.如权利要求3所述的牙鲆抗病优良品系选育方法，其特征在于上述五)、牙鲆抗病家系的近交选育中的1)抗病家系的近交家系的培育是：

采用筛选出的抗病家系特异的微卫星标记，从抗病家系成熟个体中选取具有特异基因型组合的雌鱼和雄鱼，进行交配，将来自同一家系的一尾雄鱼的精液和一尾雌鱼的卵子进行授精，将授精卵置于2-3立方米的水槽中进行孵化和育苗，即得到近交家系；

上述五)、牙鲆抗病家系的近交选育中的2)近交家系抗病性能和生长性状选育是：当近交家系鱼苗生长至3.5-5.5月龄时，进行抗病性能和生长性状的选育，将存活率高、抗病力强、生长较快的近交家系筛选出来，作为牙鲆抗病选育的第三代，以进行大量繁殖和养殖。

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