SU1243657A1

SU1243657A1 - Способ индуцировани диплоидного гиногенеза у пел ди

Info

Publication number: SU1243657A1
Application number: SU843806409A
Authority: SU
Inventors: Лидия Александровна Полякова; Марина Анатольевна Андрияшева; Тамара Игоревна Кайданова; Анна Борисовна Локшина
Original assignee: Научно-производственное объединение по промышленному и тепловодному рыбоводству
Priority date: 1984-10-29
Filing date: 1984-10-29
Publication date: 1986-07-15

Description

Изобретение относитс к рыбному хоз йству на внутренних водоемах, в частности к генетическим способам селекции рыб, а именно к способу индуцированного; диплоидного гиногене- за у пел ди.

Целью изобретени вл етс получение массовых количеств диплоидных гиногенетических личинок пел ди.

Сущность способа состоит в том, что спермии пел ди подвергают генетической инактивации УФ-облучением, осемен ют ими икру и последнюю на стадии ранней анафазы - II подвергают тепловому воздействию в течение . 30-40 мин при 15-17°С, начина с 18- 22 мин после осеменени .

Параметры теплового воздействи наиболее существенны дл достижени эффекта, так как тепловое воздейст- ,вие разрушает нити веретена деле-/ ни , в результате чего хромосомы второго редукционного тельца вт гиваютс в цитоплазму йца и происходит восстановление диплоидности за счет обьединени женского пронуклеуса со вторым редукционным тельцем. В св зи с этим особенно важным в способе вл етс определение момента начала теплового воздействи .

С целью получени массовых гиногенетических партий пел ди производ т узконапра.вленное непродолжительное тегшовое воздействие, которое захватьшает только стадию анафазы - II, котора поступает при темпера- i туре воды 2-6 С через 18-22 мин после осеменени (табл.1).

Подтверждением правильности предл . гаемых параметров вл ютс результаты опытов, проведенных при запредельных режимах (табл.2). Из табл.2 видно, что более раннее начало шока (табл.2, опыты 1-5) или более позднее (табл.2 опыты 7-11) значительно .снижает вход диплоидных гиногенетических личинок. Изменение температуры шока выше 15-1У С и удлинение ил сокращение длительности шока хот и привод т к значительному увеличению частоты диплоидизации (до 59,2% ( табл.2, опыты 9-11), но резко снижают выживаемость икры в целом, что ведет к значительному сокращению числа гиногенетических диплоидов (д нескольких штук) уже на стадии пигментации глаз. Снижение температуры шока ниже оптимааьного значени так

2 (36572

же приводит к уменьшению выхода .гиногенетических диплоидных личинок. Пример 1. Получили и перемешали спер от 10 самцов пел ди в

IJ возрасте 3+. Из полученной смеси отобрали 5 капель, которые суспендировали в ча.шке Петри в 12 мл раствора Гольтфретера двойной концентрации . Дл генетической инактивации

)0 дер сперматозоидов использовали ультрафиолетовые лучи от ртутной лампы типа БУВ-30 с длиной волны 257 мм. Лампа была откалибрована в институте Цитологии АН СССР. Дл

15 облучени чашку Петри со спермой помещали под лампу на магнитную мешалку . Рассто ние от лампы до поверхности раствора спермы было 45 см. При токе 0,4А в этом случае мощность до-,

зы

12 9 5

I jl. Xл

см

5

0

5

Экспозици облучени

м

2 МИН. Доза облучени за две минуты составл ла 15,0 мДж/см. Энерги дозы сохран лась на рассто нии +15 см от осей лампы. Подвижность спермы определ ли до и после облучени при активации, их водой. Дл чего в каплю воды.на предметном стекле, помещенном на предметном столике микроскопа , вносили спермиев препаровальной иглой, при этом наблюдали их активные вихревые движени . После облучени , как правило, подвижность спермиев несколько снижалась.

Икру получили от одной самки пел ди в возрасте 3+. Вз ли в контроль и в опыт по 7,5 тыс. шт. икринок, - осеменили облученной спермой обычным сухим методом. Контрольную икру не подвергали температурным воздействи м , ее развитие происходило при температуре воды 1 - . Опытную икру через 20 мин после осеменени поместили 3 воду с температурой 16°С на 40 мин Дл того, чтобы температура шока бьша посто нной, миску с опытной икрой поместили в термостатированную вод ную баню. Температуру во врем опыта контролировали при помо:щи термометра с точностью до О,1°С. После окончани срока теплового воздействи теплую воду слили, залили икру водой оптимальной дл пел ди температуры 5°С и -инкубировали в стандартных услови х в аппара- тах Вейса. Наблюдени за развитием эмбрионов вели в течение всего инкубационного периода вплоть до вы- луплени личинок.

0

5

0

Число гиногенетических диплоидов высчитывали в процентах от количества приступивших к развитию эмбрионов и определ ли на двух эмбриональных стади х и на стадии личинок. Частоту диплоидизации определ ли на стадии бластулы средних клеток (4 сут эмбрионального развити ) , дл чего икру фиксировали в уксуснокислом спирте (3:1). В контроле и опыте было исследовано по 50 эмбрионов. Окраску хромосом и приготовление давленых препаратов проводили по общеприн той методике. На препаратах каждый эмбрион располагали и исследовали отдельно. Определ ли плоид- ностъ и процент клеток с аберрантными митозами. На стадии пигментации ,глаз проводились отбор и подсчет тиногенетических диплоидов, диплоиды отбирали по признакам размера и степени окраски глаз. На стадии личинок

подсчитывали число вьшупившихс нормальных диплоидных гиногенетических личинок. В результате теплового шока частота диплоидизации повысилась от 3,4% в контроле до 36,0% в опыте , количество гиногенетических диплоидов на 100-е сутки увеличилось от 0,1% в котроле до 10,6% в опыте, а число нормальных диплоидных гиногенетических личинок возросло от 0,03% в контроле до 6,4% в опыте. Таким образом, использование приведенных в этом примере параметров температурных воздействий позволило получить наилучшие результаты.

П.р и м е р 2. Получили и перемешали икру от 11 самок. Использовали в контроле 6,0 тыс. шт. икринок , в опыте 270,0 тыс.шт. Сперму получили от 10 самцов. Экспозици облучени 12 мин. Дрза УФ-облучени спермы 90,0 мДж/см. Опытную партию

икры через 18 мин после осеменени

прогревали 30 мин при , в результате чего частота диплоидизации повысилась от 3,2% в контроле до 35,7% в опыте. Количество гиногенетических диплоидов на 100-е сутки

эмбрионального развити в опыте состав л ло 6,7%, а число гиногенетических личинок 3,5%.

Пример 3. Получили икру от

2самок -И сперму от 7 самцов. В контроле и в опыте использовали по

7,5 тыс. икринок. Экспозици облуче- ни 12 мин. Доза облучени 90 ЬЩж/см. Опытную икру через 22 мин после oce-i

4

в воду

с тейпера10

15

20

25

30

35

менени поместили турой 17 С. Длительность прогрева 40 мин. В результате частота дипло- тизации 11,0%, количество гиногенетических диплоидов на 100-е сутки эмбрионального развити в контроле 1,2%, а в опыте 5,2%. Число гиногенетических личинок возросло от 0,08% в контроле до 3,4% опыте.

Согласно предлагаемому способу возможно получение массовых гиноге- нeт чecкиx партий нормально развивающихс диплоидных гиногенетических по- томко.д, пел ди, которые вл ютс ценным селекционным и экспериментальным материалом.

Способ может найти применение при получении второго и последующих гиногенетических поколений пел ди, кроме того, при воспроизводстве гибрида пелчира в себе и получении триплоидных особей пел ди.

Получение диплоидных гиногенетических личинок пел ди в массовых количествах позвол ет .внедрить метод индуцированного диплоидного гиноге- неза в практику селекционных работ с пел дью и ускорить в 2-3 раза процесс селекции. Использование этого эффективного генетического метода при разведении пел ди дает возможность проводить промышленные скрещивани гиногенетических линий и получать гетерозисный эффект при товарном выращивании пел ди в пру- довых и озерных хоз йствах северо- запада .

Таблица

Скорость прохождени второго мейотического делени в осемененной йцеклетке пел ди при температуре воды (+2)-(+6)С,.

45

50

О Метафаза второго мейотического делени

20-40 Ранн анафаза второго мейотического делени

60 Поздн анафаза второго мейотического делени

Продолжение табл.1

Ранн теплофаза второго мейотического делени

Отделение второго редукционного тельца По вление си ни около мужского пронуклеуса

Таблица 2

Результаты экспериментальных исследований по разработке технологии получени массовых гиногенетических партий у лел ди путем дозированных тепловых шоков .на определенной стадии развити

йцеклетки

Продолжение табл,1

120--160 Погружение женского

и мужского пронуклеу- сов вглубь цитоплазмы

180-210 Сближение и контакт женс- кого и мужского пронуклеуСОВ

В св зи с невозможностью проинкубировать до вылуплени небольшие количества икры, которые оставались в некоторых опытах к концу инкубации, живые икринки (50-200 шт) из разных опытных вариантов объедин ли дл завершени инкубации в один аппарат, поэтому данные по выходу личинок в этих вариантах опытов отсутствуют.

Редактор. Т.Парфенова

Составитель О.Якименко

Техред Л.Олейник Корректор М.Пожо

Заказ 3729/1Тираж 679Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г.Ужгород, ул.Проектна ,4

Продолжение табл.2

Claims

1.СПОСОБ ..ИНДУЦИРОВАНИЯ ДИПЛОИДНОГО ГИНОГЕНЕЗА У ПЕЛЯДИ, включающий генетическую инактивацию спермиев и шоковое температурное воздействие на осемененную идру, отличающийся тем, что, с целью получения массовых количеств диплоидных гиногенетических личинок, шоковому температурному воздействию подвергают яйцеклетки, находящиеся на .стадии ранней анафазы - II, при . этом яйцеклетки прогревают при 1517^йС в течение 30-40 мин, начиная с 18-22 мин после осеменения.

2.Способ по п.1, отличающ и й с я тем, что генетическую инактивацию спермы проводят радиационным облучением.

SU ,„1243657 А1