CN110771536B - 一种全雌黄姑鱼的规模化培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种全雌黄姑鱼的规模化培育方法，主要步骤包括：（1）黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导；（2）伪雄鱼的诱导和鉴定；（3）伪雄鱼与正常雌鱼交配规模化生产全雌鱼。本发明在已经建立了黄姑鱼雌核发育技术的基础上，采用芳香化酶抑制剂来曲唑诱导伪雄鱼的产生，首次利用伪雄鱼和正常雌鱼交配获得全雌黄姑鱼鱼苗。本发明建立了规模化培育全雌黄姑鱼的方法，具有操作简单、安全高效等优点，培育的全雌黄姑鱼具有生长快、性状稳定等优势，为实现黄姑鱼的单性化养殖提供强有力的技术支撑。

Description

一种全雌黄姑鱼的规模化培育方法
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种全雌黄姑鱼的规模化培育方法。
背景技术
在水产养殖中，由于很多鱼类的雌性生长速度较快，个体大，因此培育全雌鱼群体对提高养殖产量、缩短养殖周期、增加经济效益都有着十分重要的意义。全雌鱼的培育在世界范围内受到极大重视。日本利用雌核发育和激素改变性别相结合的方法培育出全雌鱼，已在大马哈鱼、虹鳟、比目鱼等鱼类中取得成功。我国在鱼类性别控制上也取得了一些的成果，在多种鱼类中建立了雌核发育和诱导伪雄鱼的方法，如在罗非鱼、牙鲆等鱼类中实现了单性养殖，极大的提高了养殖效益。
黄姑鱼隶属于石首鱼科，黄姑鱼属，属于暖水性近海中、下层肉食性鱼类。具有生长快、抗逆性强、繁殖力强等特点，是我国浙江、福建沿海等地重要的海产经济鱼类之一。研究表明，黄姑鱼雌性生长速度比雄性快30％。其雌鱼养殖18个月可以达到上市规格，而雄鱼则至少需要2年。因此，培育黄姑鱼的全雌群体对于提高黄姑鱼的养殖产量和经济效益都非常重要。而关于黄姑鱼全雌鱼规模化培育技术，在国内外尚且未见报道。
黄姑鱼是具有XY性别决定系统的鱼类，可以通过两种不同的方式实现全雌性种群的产生：第一种方法是采用雌激素处理以诱导全雌鱼，但这种方法由于使用了类固醇激素所以无法在生产上进行推广；第二种方法通过诱导雌核发育苗种，但该技术需要在胚胎发生过程中施加外部冲击，苗种成活率低，因此也不适用于全雌性种群的大规模生产。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供了一种全雌黄姑鱼的培育方法，具体是指利用伪雄鱼和正常雌鱼进行自然产卵授精的方式来生产全雌黄姑鱼的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种全雌黄姑鱼的规模化培育方法，所述培育方法包括以下步骤：
（1）黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导
条石鲷精子的遗传物质灭活：将条石鲷精液用精子稀释液稀释，置于紫外线下照射；
未受精卵与灭活精子的授精：将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子混合，轻轻摇动混匀，加入海水后继续混匀并置于室温下放置；
黄姑鱼鱼卵的染色体加倍：将授精后的受精卵浸入0～4.5 ℃的海水浴中进行冷休克处理，取出处理后的卵在12～15 ℃海水过渡5-8 min，然后放入22～23 ℃海水中准备进行孵化、培育；
（2）伪雄鱼的诱导和鉴定
雌核发育鱼苗自30日龄起开始投喂含有来曲唑的饲料，投喂至90日龄，此后采用不含来曲唑的正常饲料投喂，直至性成熟；
在120日龄和210日龄时取黄姑鱼的性腺以制备组织切片来观察性腺发育情况，伪雄鱼的性腺呈现出正常雄性精巢的形态特征；
（3）全雌黄姑鱼的培育
挑选已经性成熟的1~2龄伪雄鱼和正常雌鱼放置在水泥池中，对伪雄鱼和正常雌鱼进行营养调控和光温调控；在自然状态下产卵授精，收集受精卵进行培育直至获得全雌黄姑鱼。
进一步的：所述步骤（1）中精子稀释液包含NaCl 0.75％，KCl 0.02％，CaCl20.04％，余量为水，pH值8.2。
进一步的：所述步骤（1）中将条石鲷精液用精子稀释液稀释30~40倍。
进一步的：所述步骤（1）中稀释后的条石鲷精液的紫外线强度为30～50 mJ/mm2。
进一步的：所述步骤（1）中将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子混匀，加入5～10 mL海水后继续混匀，再加入20～200 mL海水置于22～23 ℃室温下放置2min。
进一步的：所述冷休克处理的时间为8min。
进一步的：所述步骤（2）中含有来曲唑的饲料配方为：将来曲唑溶于95%乙醇，以10-100mg/kg的剂量加入到饲料中混匀，随后在室温下自然晾干。
进一步的：所述步骤（3）中营养调控是指以冰鲜小黄鱼和鱿鱼为饵料，添加饵料重量的3～5%的维生素C、1～2%维生素E，日投喂2次。
进一步的：所述步骤（3）中光温调控是采用65 W白炽灯控制亲鱼池的表面光照，光照强度为60～650 lux，光照时间由12小时过渡到16小时长光照，水温为18～22 ℃。
进一步的：所述步骤（3）中培育仔、稚、幼鱼培育水温为20～24 ℃，盐度28～32‰，pH 8.0～8.2，换水量和充气量随鱼苗生长而逐渐增大。
进一步的：所述步骤（3）中苗种培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
1、本发明采用芳香化酶抑制剂来曲唑投喂法诱导雌核发育的鱼苗实现性逆转，诱导成为伪雄鱼后与正常雌鱼进行交配，从而可以规模化培育全雌鱼。芳香化酶抑制剂来曲唑是一种抑制肿瘤的药物，对鱼体几乎没有危害，可以很好的替代雄激素来诱导鱼类的性逆转。本方法建立了全雌黄姑鱼的规模化培育方法，为黄姑鱼的单性养殖提供技术支撑，同时，该方法也可以推广到其它鱼类中，促进海水鱼类的性别控制研究与应用。
2、本发明采用芳香化酶抑制剂来曲唑（letrozole）投喂法来诱导伪雄鱼，替代传统的激素浸泡或投喂的方法，这种方法更为安全有效，而且能够减少环境污染，易于操作。
3、采用伪雄鱼和正常雌鱼交配生产全雌黄姑鱼的方法，具有操作简便、易于规模化生产等优点；本发明所述培育方法培育的鱼种具有生长快、性状稳定等优点。
附图说明
图1中A为210日龄正常黄姑鱼性腺组织（精巢）；B为210日龄来曲唑10 mg/kg组黄姑鱼性腺组织（精巢），图中标尺为50 μm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本发明所述的全雌黄姑鱼的规模化培育方法包括以下步骤：
1、黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导
（1）条石鲷精子的遗传物质灭活：利用浙江省海水增养殖重点实验室培育的黄姑鱼雌鱼10尾和条石鲷雄鱼（采集自舟山海域）5尾，经人工催产后采集精子和卵子。
将条石鲷精液用精子稀释液（以质量比计，NaCl 0.75％，KCl 0.02％，CaCl20.04％，余量为水，pH值8.2）稀释30倍，平铺于培养皿中，调整稀释液厚度，用45 mJ/cm2紫外线强度照射45 s以灭活精子遗传物质。
（2）未受精卵与灭活精子的授精：将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子混合，轻轻摇动混匀，加入5～10mL海水后继续混匀，再加入20～200mL海水置于22～23℃室温下放置2 min。
（3）黄姑鱼鱼卵的染色体加倍：受精后2 min，将受精卵转移到4℃的海水中进行冷休克处理8 min。冷休克处理后的卵取出后首先经12～15 ℃海水过渡至5 min，然后转移到22～23 ℃的200 L的水槽中准备进行孵化。在孵化后25天，将鱼苗转移到4个养殖用桶（200L，n = 300）中，并适应5天，然后开始性逆转实验。
因为冷休克处理的时间会直接影响到受精卵的存活率，但是时间太短达不到冷休克处理的效果，如果时间太长则会使受精卵的存活率大大降低，所以本发明是经过试验最终确定采用冷休克处理的时间为8min。
2、伪雄鱼的诱导和培育
（1）配制饲料：伪雄鱼的诱导是通过投喂含有来曲唑的配合饲料进行处理的。饲料配方为：称取定量的芳香化酶抑制剂来曲唑溶于少量95%乙醇，以10mg/kg和100mg/kg的剂量分别加入饲料中混匀配置混合饲料，随后在室温下晾干过夜以便挥发乙醇。
（2）将30日龄的雌核发育黄姑鱼鱼苗随机分为2组，来曲唑10 mg/kg和100 mg/kg，分别设置两个平行组，每组平行300尾，饲料于上午（9：00）和下午（15：00）各投喂一次，从30日龄到90日龄共投喂60天，此后采用正常饲料投喂。投喂时尽可能均匀投饵并尽量使鱼饱食，每天按时换水，每次换水量不低于200%。在来曲唑投喂期间，每天监控实验鱼的死亡率并做好记录。
（3）分别在85日龄、120日龄、150日龄、210日龄时对两组实验组取样并通过组织切片来鉴定性别，经显微观察分析发现其均为雄性。来曲唑投喂组均呈现出与正常组雄性相同的精巢特征，出现精母细胞和精小叶结构等。表明投喂剂量为10~100 mg/kg的来曲唑能够有效诱导黄姑鱼伪雄鱼的产生（如图1所示）。
3、伪雄鱼与正常雌鱼交配获得全雌鱼
挑选性成熟的伪雄鱼和正常雌鱼各20尾，置于5吨水泥池中自然交配，收集受精卵进行孵化，培育直至获得全雌黄姑鱼。
仔、稚、幼鱼培育水温为20～24 ℃，盐度28～32‰，pH 8.0～8.2，换水量和充气量随鱼苗生长而逐渐增大。苗种培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料。培育体长5 cm的全雌苗种共20000尾。待苗种培育至3月龄时，随机取样50尾，解剖取其性腺，利用波恩式液固定，通过组织切片观察全部为雌鱼，证明培育的苗种为全雌苗种。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种全雌黄姑鱼的规模化培育方法，其特征在于所述培育方法包括以下步骤：
（1）黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导
条石鲷精子的遗传物质灭活：将条石鲷精液用精子稀释液稀释，置于紫外线下照射；
未受精卵与灭活精子的授精：将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子混合，轻轻摇动混匀，加入海水后继续混匀并置于室温下放置；
黄姑鱼鱼卵的染色体加倍：将授精后的受精卵浸入0～4.5 ℃的海水浴中进行冷休克处理，取出处理后的卵在12～15 ℃海水过渡5-8 min，然后放入22～23 ℃海水中准备进行孵化、培育；
（2）伪雄鱼的诱导和鉴定
雌核发育鱼苗自30日龄起开始投喂含有来曲唑的饲料，投喂至90日龄，此后采用不含来曲唑的正常饲料投喂，直至性成熟；
在120日龄和210日龄时取黄姑鱼的性腺以制备组织切片来观察性腺发育情况，伪雄鱼的性腺呈现出正常雄性精巢的形态特征；
（3）全雌黄姑鱼的培育
挑选已经性成熟的1~2龄伪雄鱼和正常雌鱼放置在水泥池中，对伪雄鱼和正常雌鱼进行营养调控和光温调控；在自然状态下产卵授精，收集受精卵进行培育直至获得全雌黄姑鱼；
所述步骤（2）中含有来曲唑的饲料配方为：将来曲唑溶于95%乙醇，以10-100mg/kg的剂量加入到饲料中混匀，随后在室温下自然晾干；
所述步骤（3）中培育仔、稚、幼鱼培育水温为20～24 ℃，盐度28～32‰，pH 8.0～8.2，换水量和充气量随鱼苗生长而逐渐增大。
2.根据权利要求1所述的全雌黄姑鱼的规模化培育方法，其特征在于：所述步骤（1）中精子稀释液包含NaCl 0.75％，KCl 0.02％，CaCl2 0.04％，余量为水，pH值8.2。
3.根据权利要求2所述的全雌黄姑鱼的规模化培育方法，其特征在于：所述步骤（1）中将条石鲷精液用精子稀释液稀释30~40倍。
4.根据权利要求3所述的全雌黄姑鱼的规模化培育方法，其特征在于：所述步骤（1）中稀释后的条石鲷精液的紫外线强度为30～50 mJ/mm2。
5.根据权利要求1所述的全雌黄姑鱼的规模化培育方法，其特征在于：所述步骤（1）中将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子混匀，加入5～10 mL海水后继续混匀，再加入20～200 mL海水置于22～23 ℃室温下放置2 min。
6.根据权利要求1所述的全雌黄姑鱼的规模化培育方法，其特征在于：所述步骤（3）中营养调控是指以冰鲜小黄鱼和鱿鱼为饵料，添加饵料重量的3～5%的维生素C、1～2%维生素E，日投喂2次。
7.根据权利要求1所述的全雌黄姑鱼的规模化培育方法，其特征在于：所述步骤（3）中光温调控是采用65 W白炽灯控制亲鱼池的表面光照，光照强度为60～650 lux，光照时间由12小时过渡到16小时长光照，水温为18～22 ℃。
8.根据权利要求1所述的全雌黄姑鱼的规模化培育方法，其特征在于：所述步骤（3）中苗种培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料。
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