CN105746388A - 建立抗病草鱼纯系的两筛两诱技术体系 - Google Patents

Abstract

建立抗病草鱼纯系的两筛两诱技术体系包括：(1)通过在一、二龄阶段进行人工感染筛选出具有优良抗病基因组合的杂合体草鱼；(2)选择与草鱼卵子杂交致死的鲤鱼精子，经遗传彻底失活处理后激活抗病杂合体草鱼卵子发育，再经冷休克处理使其染色体加倍而获得基因组高度纯合的草鱼；(3)在一、二龄阶段对所获得的雌性单性生殖纯合体草鱼进行人工感染，筛选出遗传了优良抗病基因组合的纯合体草鱼；(4)在所获得的抗病纯合体草鱼群体性成熟后，选择体型好、生长快的个体人工催产获得卵子，再用遗传失活的鲤鱼精子激活其发育和进行染色体人工加倍处理，制备生长性能优良的抗病草鱼纯系。实践证明，纯系抗病草鱼平均成活率达到70％以上。

Description

建立抗病草鱼纯系的两筛两诱技术体系

技术领域

本发明是筛选和建立具有优良生产性能抗病草鱼纯系的新技术体系。

背景技术

草鱼是我国主要的淡水养殖鱼类，在我国水产养殖业和国民经济中占有重要的地位。但在草鱼的人工养殖中，一、二龄草鱼病害非常严重，商品鱼养殖的平均成活率不到30％，严重降低了养殖的经济效益。

长期的研究已经证明草鱼至病的主要病因是病毒性的，因此，很难找到有效的防治药物和方法。目前所用的药物治疗方法只对细菌性病害有一定作用，但会污染环境和降低所养殖草鱼的商品品质；用疫苗接种方法操作不便，效果不稳定，无法在生产实际中广泛应用。因此，培育出抗病的草鱼品系才能在根本上解决草鱼的病害问题。

三龄草鱼很少发生病害，具备很强的抗病能力，这一现象说明草鱼具有建立完善的抗病体系的能力，但草鱼抗病体系的建立非常复杂，是由多个不同基因，在多个不同层次上调控的。

一龄或者二龄草鱼在病害感染后仍会有少量个体能够存活，说明有些具有优良的抗病基因组合的草鱼个体，能在一、二龄阶段即建立起完善的抗病体系。

因此，筛选出具有优良抗病基因组合的草鱼，进而建立具有优良抗病基因组合的草鱼纯系，避免这些优良抗病基因在传代过程中因遗传分离、重组而丢失，则可以建立用于大规模生产育种的抗病草鱼品系，解决草鱼养殖中的病害难题。

用传统的遗传选育方法建立生物品种纯系需要经历数代连续近交选育。由于草鱼是大型鱼类，性成熟周期长达5年，用这种传统的遗传选育方法建立抗病草鱼品种纯系在生产实际中需要数十年甚至上百年的时间，耗费大量的人力、物力。由于选育工程的规模很难包括所有可能的基因组合，所选育的品系很可能因近交衰退而消失，不能达到育种目标。

本发明涵盖了筛选优良抗病基因组合草鱼，快速建立具有优良生产性能抗病基因组合草鱼纯系的一整套新的技术体系。经过在几个不同地区抗病能力对比养殖实验和在全中国范围内不同气候条件下10年大规模生产养殖实验表明：用这一技术体系所培育的草鱼品系比普通草鱼(1)具有明显的抗病优势，平均成活率达70％以上；(2)生长速度快10％以上，饵料转化率高；(3)商品鱼规格整齐，个体差异小。这些结果证明了本发明能快速而经济地建立具有优良生产性能的抗病草鱼品系。

发明内容

发明内容

本发明是抗病草鱼筛选，快速建立具有优良生产性能抗病草鱼纯系的整套新的技术体系。

优良抗病基因组合草鱼母本的筛选方法包括下列步骤：

取体型好、体重大于同龄草鱼平均体重10％-20的性成熟雌、雄草鱼各一条进行交配，所取得的受精卵用单独的孵化槽进行孵化，获得草鱼苗。

取足够数量的鱼苗培育到二月龄后，按成鱼养殖密度在专用池塘中养殖。专用池塘的进排水不能与其他鱼池串通，在随后的整个养殖过程中必须有严格防止外源草鱼进入的设施。

在一、二龄阶段多次将已患出血病、赤皮病等的草鱼放入专用池塘中对所养草鱼进行感染。经感染后绝大部分，甚至全部草鱼会病害死亡，极少部分草鱼能存活，从而筛选出具有抗病能力，因而具有优良抗病基因组合的草鱼。

将病死草鱼捞出进行无害化处理。筛选得到的抗病草鱼留在原来池塘中继续养殖到性成熟，作为生产用于筛选优良抗病纯合体草鱼的亲鱼。

用上述方法筛选出的抗病草鱼具有优良的抗病基因组合，但这些抗病基因大多数处于杂合状态。用其作为亲本通过两性生殖进行繁殖，这些优良抗病基因组合会按照遗传规律分离，所产生的后代大多仍然不具备抗病能力。只有基因组纯合的抗病草鱼才能将完整优良抗病基因组合遗传给每一个后代。因此，需要以上述基因杂合型抗病草鱼作为亲本进行繁殖，才能从其后代中筛选出基因纯合型抗病草鱼，避免传代时抗病基因的分离。按照遗传分离和自由组合定律，杂合体通过两性生殖所产生的后代中，n个基因都是纯合状态的几率是1/(3+1)ⁿ。假如草鱼的抗病性状由6个基因控制，则通过两性生殖近交选育的方式获得基因纯合型抗病草鱼的几率为1/(3+1)⁶＝1/4096。对于草鱼这种性成熟大5年的大型鱼类，要筛选和鉴定出如此低比例的基因纯合型个体是人力、物力以及时间上都难以承担的任务。如通过人工诱导单性生殖结合染色体人工加倍处理，则获得基因纯合型抗病草鱼的几率为1/2⁶＝1/64。通过人工诱导单性生殖比通过两性生殖可以使筛选纯合体的效率提高64倍以上，极大减少养殖试验鱼的规模和简化鉴定纯合体的实验工作量。因此，我们建立了如下通过人工诱导单性生殖和染色体人工加倍的方法，筛选和制备抗病草鱼纯合体的技术程序：

在所筛选的抗病草鱼中选择活力强、形体好、体重大于平均体重10-20％的个体作为亲鱼，通过传统的人工催产方法使其成熟产卵。

用与草鱼杂交致死，但其精子能有效激活草鱼成熟卵子发育的雄性鲤鱼作为异种精子供体。

选择活力强，精液丰富的雄性鲤鱼进行人工催产。在草鱼预定产卵时间前1.5小时通过人工挤压方法获得足够数量的鲤鱼精液。挤出的精液用4倍体积，温度在0-4℃的Hank’s溶液进行稀释。

稀释后的鲤鱼精液置于适当大小的培养皿中，精液的厚度控制在1mm左右，再将培养皿置于冰浴上。

用两支紫外灭菌灯在距离精液表面约为16cm上方对精液进行照射。照射过程中用小摇床不断摇动精液，以使精液能得到均匀照射，并每隔一段时间取少量精液在显微镜下检测精子活力，照射时间为45-70分钟。在这一照射剂量下能彻底破坏鲤鱼精子的遗传物质但保留精子激活草鱼卵子发育的能力。照射处理好的精液放在0-4℃冰箱中避光保存备用。

取适时顺产的草鱼擦干水迹，通过人工轻轻挤压获10万粒以上的草鱼成熟卵子置于适当大小的盆中，立即加入足够量的遗传失活鲤鱼精子并轻轻搅拌均匀，然后加入与外界温度一致，与全部卵子体积相等的清水，继续轻轻搅拌1-2分钟，使遗传失活的鲤鱼精子激活草鱼卵子发育。

将被激活的草鱼卵子放入事先用冰调到4-6℃低温的清水中进行冷休克处理约15min，抑制被激活草鱼卵子的减数第二次分裂，使第二极体不能分离出去而成为两个基因组都来自母本，没有父本基因组，高度纯合的雌核二倍体。

在冷休克处理完成后，加入与环境温度一致的水，逐渐使水温恢复到与环境温度一致，解除被激活卵子的冷休克。然后将被激活的草鱼卵子植入孵化器中用流水孵化。孵化期间保障水质清新，水流适量。

被激活的草鱼卵的第二极体排除如果没有被抑制，则形成单倍体胚胎。单倍体胚胎可以发育畸形发育至孵化期，但最终因单倍体综合症而死亡。未遗传失活的鲤鱼精子与草鱼卵子杂交发育神经胚期后停止发育，胚胎不能拉长，在孵化期前死亡。

通过冷休克处理后恢复二倍体基因组的雌核发育高纯合二倍体胚胎中，由于等位基因的纯化使所有隐性的致死基因得以表达。因此，大部分雌核发育高纯合二倍体胚胎因其基因组中的这种或那种隐性致死基因的表达而不能正常发育，最终死亡。因此，通过上述操作所获得的具有自主生活能力的草鱼苗即是没有隐性致死基因，基因组高度纯合的人工雌核发育二倍体草鱼。

将孵化所得的雌核发育高纯合二倍体草鱼苗在专用池塘中培育到二月龄后，按成鱼养殖密度分到专用池塘中养殖。养殖过程中避免外源草鱼混入。

所得的雌核发育高纯合二倍体草鱼中，只有小部分遗传了抗病母本草鱼的完整抗病基因组合。因此，需要按[0013]的同样方法和程序在一龄和二龄阶段对其接种血病、赤皮病等的草鱼病源进行感染，以筛选出基因型纯合的抗病草鱼纯合体。

获得的抗病草鱼纯合体留在原来池塘中继续养殖到性成熟，作为建立抗病草鱼纯系的亲鱼。养殖过程中避免外源草鱼的混入。

由于从基因组杂合的抗病草鱼中用上述方法筛选出基因组纯合的抗病草鱼的几率很低，所获得的纯合体个体数目很少，不能满足大规模生产抗病草鱼苗种的需要。此外，虽然每个个体的基因型是纯合的，但群体中不同个体的基因组合是不一样的，不同个体在体型、生长速度等方面会出现明显差异。因此，需要通过人工筛选出既具有抗病能力，又有优良体型和快速生长的纯合体。

在所筛选出的体型好，生长速度快的抗病草鱼纯合体性成熟后，通过人工催产获得其成熟卵子，经用遗传失活的鲤鱼精子激活发育，再经上述的染色体人工加倍处理，获得有大量个体的基因纯合抗病雌核发育草鱼群体，从而建立生产性能优良的抗病草鱼纯系。

在抗病草鱼纯系培育工程中，严格管理，防止外源草鱼混入。

在抗病草鱼纯系群体中随机取30条个体的尾鳍样品，以及对照的鲤鱼和草鱼各一条的尾鳍样品，分别用能在草鱼和鲤鱼基因组中都能检测到多态性位点的7对微卫星引物和7条随机扩增多态性引物，通过PCR方法进行基因组的广泛扫描分析和比较。确定所获得的抗病草鱼纯系中，所有个体的基因组都是纯合的，不同个体的基因型都是一致的，没有异源鲤鱼精子遗传物质的存在。没有外源草鱼的混入后，才可用于大规模抗病草鱼苗种生产。

快速、有效而经济的建立起所有个体都遗传了同样优良抗病基因组合和生产性能基因组合的抗病草鱼纯系。

用所建立的纯系生产的草鱼苗种都具有抗病能力强，生长速度快，规格整齐的优良生产性状，不会因基因的分离和自由组合而产生性能差异。

具体实施方式

实施上述发明必须具备足够数目、适合草鱼养殖的池塘和进行抗病筛选管理的条件，草鱼孵化设施，以及草鱼养殖、繁殖和育种的技术人员。

具备进行鱼类精子遗传失活处理和被激活卵染色体加倍处理和胚胎发育观察的冰箱、温度计、定时器、精密电子天平、电动摇床、紫外灭菌灯、用于精子活力观察显微镜和胚胎发育观察的体式显微镜。

具备进行草鱼基因组分析的分子生物学实验室基本设备以及技术人员。

以上说明内容阐述了本发明的基本原理，技术程序，主要特征、有益效果和实施条件。本行业的技术人员应该了解在本发明精神和范围内，根据具体情况差异所进行的各种技术参数和细节调整和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一种通过连续两代人工致病进行筛选和人工诱导单性生殖建立抗病草鱼纯系的技术体系。该技术体系包括以下技术程序：

(1)取体型好、体重大于同龄草鱼平均体重10％-20的性成熟雌、雄草鱼各一条进行交配所繁殖的鱼苗进行养殖，在一、二龄阶段多次将已患出血病、赤皮病等的草鱼放入专用池塘中对所养草鱼进行感染。筛选出具有抗病能力，因而具有优良抗病基因组合的杂合体草鱼。

(2)用所筛选出的，具有优良抗病基因组合的雌性草鱼经人工催产获得适时顺产的成熟卵子。

(3)选择与草鱼卵子杂交致死的鲤鱼精子，用2-4倍体积0-4℃的Hank’s溶液稀释，置于两支15W紫外灭菌灯下16cm处进行45-70分钟照射，照射过程中用小摇床不断摇动精液并维持精液温度在0-4℃，彻底破坏鲤鱼精子的遗传物质但保留精子激活草鱼卵子发育的能力。

(4)用遗传失活的鲤鱼精子激活草鱼卵子发育，精卵接触2分钟后，在4-6℃冷水中对被激活草鱼卵子进行冷休克处理约15min，抑制被激活草鱼卵子的减数第二次分裂，使第二极体不能分离而获得两个基因组都来自母本同源染色体，没有父本基因组的高纯合的雌核二倍体草鱼。

(5)由于草鱼抗病体系是有多基因调控的，在繁殖传代过程中因基因分离和自由组合，所获得的雌性单性生殖高纯合二倍体草鱼中绝大多数个体都不可能遗传母本的完整优良抗病基因组合。因此，需要在一、二龄阶段再次用已患出血病、赤皮病等的草鱼对其进行感染。筛选出遗传了优良抗病基因组合，遗传上高度纯合的少量纯合抗病草鱼。

(6)在所筛选的抗病草鱼纯合体性成熟后，在其中取体型好、体重大于同龄草鱼平均体重10％-20的一条个体，经人工催产获得适时顺产成熟卵子，再用经遗传失活处理，与草鱼卵子杂交致死的鲤鱼精子激活发育，经同样的冷休克条件处理，则所获得的第二代雌性单性生殖草鱼群体中所有个体都遗传了同样的优良抗病基因组合和优良生产性能基因组合，从而建立起具有优良生产性能的抗病草鱼纯系。

(7)在抗病草鱼纯系群体中随机取30条个体的尾鳍样品，以及对照的鲤鱼和草鱼各一条的尾鳍样品，通过多态性分子标记对其基因组进行广泛的扫描分析和比较，确定抗病草鱼纯系基因组的纯合性和一致性，群体中无外源草鱼的混入后，才可用于大规模抗病草鱼苗种生产。

2.根据权利要求1所述的建立抗病草鱼纯系技术体系，其特征在于：经历连续两代人工筛选和人工诱导雌性单性生殖，能可靠、快速、高效和经济地获得抗病草鱼纯系，用于抗病草鱼苗种生产。

3.根据权利要求1所述的建立抗病草鱼纯系技术体系，其特征在于程序(3)选择与草鱼卵子杂交致死的鲤鱼精子经遗传失活处理但保留其激活草鱼卵子发育的能力，从而能简便、准确地鉴定经染色体人工加倍后所产生的草鱼雌性单性生殖纯合二倍体鱼苗，排除草鱼与异种鱼精子杂交而产生杂交后代的可能性。

4.根据权利要求1所述的建立抗病草鱼纯系技术体系，其特征在于程序(3)中所述的能使鲤鱼精子经受紫外线长达70分钟的体外照射而彻底破坏其遗传物质，但保留其激活草鱼卵子发育能力的技术条件。

5.根据权利要求1所述的建立抗病草鱼纯系技术体系，其特征在于程序(4)中所述的能使被激活草鱼卵子基因组高效加倍而成为二倍体的技术条件。

6.根据权利要求1所述的建立抗病草鱼纯系技术体系，其特征在于程序(6)中所述的取体型好、体重大于平均体重10％-20的一条纯合个体的成熟卵子，再用遗传失活的鲤鱼精子激活发育和基因组加倍处理，而建立起所有个体都遗传了同样优良抗病基因组合和生长性能基因组合的抗病草鱼纯系。用其作为亲本所生产的草鱼苗种都具有抗病能力强，生长速度快，规格整齐的优良生产性状，不会因基因的分离和自由组合而产生性能差异。