CN111480617A - 制备两性可育四倍体杂合鲫鱼的方法和制备不育三倍体杂合鲫鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备两性可育四倍体杂合鲫鱼的方法和制备不育三倍体杂合鲫鱼的方法。所述方法包括以下步骤：准备健康的母本鲫鱼和父本鲤鱼；对鲫鱼进行人工催产得到鱼卵，利用鲤鱼的精子对其进行人工受精获得受精卵；对受精卵进行培养，在其进行第一次卵裂期间进行冷休克处理使染色体加倍；解除受精卵的冷休克抑制，在室温下将受精卵孵化成鱼苗，然后在专养池塘培养成成鱼；在成鱼中挑选具有自然繁殖能力的雄性杂合鲫鱼和具有自然繁殖能力的雌性鲫鱼进行自交，获得稳定的四倍体杂合鲫鱼群体。根据本发明的制备方法具有偶然性低、可重复性好等优点，并且用该方法生产的不育三倍体黑鲫生长速度快、个体大、营养价值高。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类遗传选育的技术领域，尤其涉及制备两性可育四倍体杂合鲫鱼的方法和制备不育三倍体杂合鲫鱼的方法。
背景技术
鲫鱼是一种杂食性鱼类，其食性广、适应性强、繁殖力强、抗病力强、生长快、对水温要求不高，便于养殖，是我国重要的淡水养殖性鱼类。鲫鱼是主要以植物为食的杂食性鱼，肉质细嫩，营养价值高，每百克鱼肉含蛋白质13克、脂肪11克，并含有大量的钙、磷、铁等多种矿物质。
鲫鱼品种繁多，养殖生长速度差异明显。但是总体而言，杂交鲫鱼生长速度明显优于原种鲫鱼。为了提高鲫鱼的生产效益，近年来，通过定向培育和遗传改良等方法培育了多种新的鲫鱼品种，例如三倍体杂合鲫鱼、四倍体杂合鲫鱼等。
目前，获得多倍体杂合鲫鱼的方法主要采用自然杂交法，例如，以鲫和鲂进行鲫鲂杂交挑选出异源四倍体鲫鲂，然后挑选能产生大小不同的卵子的雌性个体以及能产生水状精液的雄性个体进行催产并进行人工干法授精，然后将受精卵进行流水孵化，再进行饲养，最后在自交后代中得到多倍体鲫鱼。然而，这样的自然杂交方法存在较大的偶然性，导致遗传性状稳定性较差、经济性较差等问题。
因此，在本领域中仍然需要一种比较简单、经济且能获得具有稳定遗传特性的两性可育多倍体杂合鲫鱼以及不育多倍体杂合鲫鱼的方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种人工制备稳定的两性可育四倍体杂合鲫鱼和不育三倍体杂合鲫鱼的方法。
本发明的目的通过以下技术方案解决：
在第一方面，提供了一种制备两性可育四倍体杂合鲫鱼的方法，所述方法包括以下步骤：（1）准备健康的母本鲫鱼和父本鲤鱼；（2）对母本鲫鱼进行人工催产得到鱼卵，利用父本鲤鱼的精子对其进行人工受精获得受精卵；（3）对受精卵进行培养，在其进行第一次卵裂期间进行冷休克处理以使其染色体加倍；（4）解除受精卵的冷休克抑制，在室温下将受精卵孵化成鱼苗，然后在专养池塘培养成成鱼；（5）在成鱼中挑选具有自然繁殖能力的雄性杂合鲫鱼和具有自然繁殖能力的雌性鲫鱼进行自交，获得稳定的四倍体杂合鲫鱼群体。在一个优选方案中，所述母本鲫鱼为日本白鲫，所述父本鲤鱼为纯黑色锦鲤。
利用该技术方案，通过在第一次卵裂期间对受精卵进行冷休克处理，能够使受精卵的染色体加倍，从而获得多倍体受精卵。利用所述多倍体受精卵成长的成鱼自交即可获得稳定的四倍体杂合鲫鱼。所述方法具有步骤简单、所得成鱼遗传稳定性好以及能够获得体积大、肉质优良的多倍体成鱼的优点。
在一个优选方案中，在步骤（2）中，通过人工挤压将适量的鲫鱼卵子和鲤鱼精子同时置入盛有水温为20-25℃清水的培养皿中进行受精，并立即摇动培养皿使受精卵均匀分布并粘附在培养皿底部。
在该技术方案中，采用人工受精的方式使鲫鱼卵子和鲤鱼精子进行受精，能够提高受精的稳定性，相比让鱼类自然受精而言降低了偶然性，提高了可重复性。使受精卵均匀分布并粘附在培养皿底部有利于其发育和生长。
在一个优选方案中，在步骤（3）中，在受精后3-6分钟，将含有鲤鱼精子的水倒出并用20-25℃的清水清洗两次，然后换上同样温度的清水后将受精卵在20-25℃恒温培养。
在对鱼类进行人工受精时，存在大量未与卵子受精的精子，其在水中会很快失活死亡。通过该步骤，能够去除死亡的精子，以保持培养胚胎的水质清新，从而提升其存活率。
在一个优选方案中，在步骤（3）中，在培养35-60分钟后，当约60-80%的受精卵完成了染色体复制而进入第一次卵裂的正中期时，将受精卵在0-2℃的清水中进行冷休克处理10-15分钟。
通过冷休克处理，能够抑制受精卵的第一次分裂而使染色体加倍，从而获得多倍体受精卵。
在一个优选方案中，在步骤（4）中，在冷休克处理完成之后，加入20-25℃的清水，解除受精卵的冷休克抑制。
通过加入温度较高的清水，能够解除冷休克抑制，使染色体加倍的受精卵能够正常生长。
在一个优选方案中，在步骤（4）中，在20-25℃培养至第一次卵裂完成后，将所得胚胎置于室温下培养，每隔2-4小时换一次同样室温的清水，并在培养24小时后去除未受精的卵和死亡的胚胎。
通过定时更换清水，能够保持胚胎培养水质的清新和氧气充足，保证其正常及良好发育；同时，通过去除未受精的卵及死亡的胚胎，能够避免影响其他胚胎的发育。
在一个优选方案中，在步骤（5）中，在所得成鱼中总共约筛选出5-10%具有自然繁殖能力的雄性杂合鲫鱼和15-20%具有自然繁殖能力的雌性杂合鲫鱼并使其自交，从而获得稳定的四倍体杂合鲫鱼群体。
在第二方面，提供了一种制备不育三倍体杂合鲫鱼的方法，所述方法包括以下步骤：（6）利用前述步骤（5）获得的四倍体杂合鲫鱼与初代二倍体雄性或雌性鲫鱼杂交来制备不育三倍体杂合鲫鱼。
在该方案中，用染色体加倍的四倍体杂合鲫鱼与初代二倍体鲫鱼杂交可以更高效地大规模生产三倍体鲫鱼。由于三倍体减数分裂时也不能进行同源染色体的正常配对而变得不育，因此生殖发育的营养转移到鱼的营养生长上而导致其生长快、个体大、营养价值比普通鲫鱼高，从而在生产上具有显著的经济价值。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
根据本发明的两性可育四倍体及不育三倍体杂合鲫鱼制备技术体系有如下优点：
1、本技术体系通过冷休克处理，抑制杂交二倍体受精卵的第一次卵裂，在杂交一代即能直接获得高比例两性可育、能自然生殖的杂合四倍体黑鲫，并能稳定遗传和繁殖四倍体后代，其中人工染色体加倍获得四倍体的机制和过程清楚，偶然性低，可重复性好；
2、所获得的两性可育四倍体黑鲫比目前所用的自然加倍鲫鲤杂合四倍体个体大三倍以上，繁殖能力强；
3、用该四倍体黑鲫与二倍体白鲫杂交可以更高效地大规模生产三倍体，并且用该技术体系生产的不育三倍体黑鲫新品种生长速度快、个体大、营养价值比普通鲫鱼高。
附图说明
图1是在饲养之后筛选出的两性可育性成熟四倍体黑鲫照片，其中（A）为雌鱼，（B）为雄鱼；
图2是筛选出的可育雄性杂合黑鲫染色体和不育黑鲫染色体中期分裂相图，其中可育雄性杂合黑鲫的染色体数目为200条（A），不育杂合黑鲫二倍体染色体数目为100条（B）；
图3是显示根据本发明方法选育的生长1年的不育三倍体黑鲫照片。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明涉及一种利用鲫鱼和鲤鱼人工制备稳定的两性可育四倍体及不育三倍体杂合鲫鱼的方法。具体而言，在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：（1）准备健康的母本鲫鱼和父本鲤鱼；（2）对鲫鱼进行人工催产得到鱼卵，利用鲤鱼的精子对其进行人工受精获得受精卵；（3）对受精卵进行培养，在其进行第一次卵裂期间进行冷休克处理使染色体加倍；（4）解除受精卵的冷休克抑制，在室温下将受精卵培养成成鱼；（5）在成鱼中挑选具有自然繁殖能力的雄性杂合黑鲫和具有自然繁殖能力的雌性黑鲫进行自交，从而获得稳定的四倍体黑鲫群体。在一个进一步的实施方案中，该方法还包括以下步骤：（6）利用前述步骤（5）获得的四倍体杂合鲫鱼与初代二倍体白鲫雄鱼或雌鱼制备不育三倍体杂合鲫鱼。利用本发明的方法能够制备具有稳定遗传特性以及良好生长性能的两性可育四倍体及不育三倍体杂合鲫鱼。
以下将参考具体实施例来进一步详细描述本发明。本领域的普通技术人员会理解，提供这些实施例的目的仅仅是为了举例说明本发明的原理，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：制备两性可育四倍体黑鲫
1、在白鲫的繁殖季节选取体型好、健康的二龄日本白鲫作为母本，纯黑色锦鲤为父本，根据厂家建议剂量，通过注射绒毛膜促性腺激素进行催产。
2、在观察到白鲫产卵开始后取适时顺产的白鲫和黑色锦鲤亲本，通过人工挤压将适量的白鲫卵子和黑色锦鲤的精子同时置入盛有水温为22℃清水的培养皿中进行受精，并立即摇动培养皿使受精卵均匀分布并粘附在培养皿底部。
3、受精3分钟后，将含有鲤鱼精子的水倒出并用22℃的清水清洗两次，然后换上同样温度的清水后将受精卵在22℃恒温培养。
4、在22℃温度下培养35-40分钟后，当有约70%的受精卵完成了染色体复制而进入第一次卵裂的正中期时，将受精卵在0-2℃的清水中进行冷休克处理10-12分钟，抑制受精卵的第一次分裂而使进行染色体加倍。
5、在达到冷休克处理时间后，加入22℃的清水，解除受精卵的冷休克抑制。在22℃培养至第一次卵裂完成后，将胚胎置于室温下培养。在培养过程中每隔3小时换一次同样室温的清水，保持胚胎培养水质清新和氧气充足，并在培养24小时后去除未受精的卵和死亡的胚胎以免影响其他胚胎的发育。
6、在培养至胚胎脱模成为能自主游动和摄食的幼鱼后，将其放在能有效防止逃逸的大塘中，按正常鲫鱼饲养方法饲养至性成熟。
7、饲养2年后，在繁殖季节检测雌雄鱼的繁殖能力，筛选出能自然排精的雄鱼和产卵的雌鱼。在加倍处理获得的实验鱼群体中，总共筛选出5-10%具有自然繁殖能力的雄性杂合黑鲫和15-20%具有自然繁殖能力的雌性黑鲫（图1）。
8、对筛选出的可育雌、雄杂合黑鲫进行染色体数目分析，确定其染色体数目为200条（图2A），而不育的杂合二倍体染色体数目为100条（图2B）。从而证明可育的雌、雄杂合黑鲫为四倍体。
9、用筛选出的可育四倍体黑鲫雌、雄鱼进行自交，所繁殖的后代全部为黑色，染色体的数目为200条。从而确定其为能稳定遗传和自然繁殖的杂合四倍体，并由此建立起四倍体的黑鲫大群体。
实施例2：利用实施例1中制备的四倍体鱼与二倍体鲫鱼制备不育三倍体鲫鱼
在本实施例中，利用二倍体日本白鲫精子与四倍体白色鲫鲤杂合鱼卵子杂交，繁殖了约20万尾三倍体鱼苗，并在2个分开的渔场进行了实验性养殖。12月分别检查了实验池塘中的200尾鱼。检测结果表明该三倍体品系：①生长速度快，平均体重达到了350克；②个体差别小，规格整齐；③体型近似日本白鲫但背较其宽，体色较其黑；④抗病能力强，避免了日本白鲫容易染病的缺陷，养殖成活率高；⑤性腺不发育；⑥没有鲫鲤杂合异源三倍体品种—湘云鲫所具有的鲤鱼形体特征。这些性状说明这是一种优良的三倍体鲫鱼养殖新品种。
另外，在2015年4月初用二倍体红鲫精子与四倍体白色鲫鲤杂合鱼卵子杂交，繁殖了约20万尾三倍体鱼苗。在2个分开的渔场进行了实验性养殖。12月分别检查了实验池塘中的500尾鱼。检测结果表明该三倍体鲫鱼品系：①生长速度快，平均体重达到了500克；②个体差别小，规格整齐；③体型和体色如土生鲫鱼；④抗病能力强，养殖成活率高；⑤性腺不发育；⑥没有鲫鲤杂合异源三倍体品种—湘云鲫所具有的鲤鱼形体特征。这些性状说明这是又一个优良鲫鱼养殖新品种。
与普通鲫鱼的生长性能相比，杂交鲫鱼具有性腺不发育、抗病力强、耐低氧、耐低温、食性广、易起捕等优点，特别是生长速度快的特点；而且在商品特点上也有很多优势，例如出肉率高、优质细嫩、味道鲜美。目前已经培育了亲本繁殖的鲫鱼5000斤，年生产各类优质鲫鱼约2亿尾。
Claims (9)
1.一种制备两性可育四倍体杂合鲫鱼的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
准备健康的母本鲫鱼和父本鲤鱼；
对母本鲫鱼进行人工催产得到鱼卵，利用父本鲤鱼的精子对其进行人工受精获得受精卵；
对受精卵进行培养，在其进行第一次卵裂期间进行冷休克处理以使染色体加倍；
解除受精卵的冷休克抑制，在室温下将受精卵孵化成鱼苗，然后在专养池塘培养成成鱼；
在成鱼中挑选具有自然繁殖能力的雄性杂合鲫鱼和具有自然繁殖能力的雌性鲫鱼进行自交，获得稳定的四倍体杂合鲫鱼群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母本鲫鱼为日本白鲫，所述父本鲤鱼为纯黑色锦鲤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，通过人工挤压将适量的鲫鱼卵子和鲤鱼精子同时置入盛有水温为20-25℃清水的培养皿中进行受精，并立即摇动培养皿使受精卵均匀分布并粘附在培养皿底部。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，在受精后3-6分钟，将含有鲤鱼精子的水倒出并用20-25℃的清水清洗两次，然后换上同样温度的清水后将受精卵在20-25℃恒温培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，在培养35-60分钟后，当约60-80%的受精卵完成了染色体复制而进入第一次卵裂的正中期时，将受精卵在0-2℃的清水中进行冷休克处理10-15分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，在冷休克处理完成之后，加入20-25℃的清水，解除受精卵的冷休克抑制。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，在20-25℃培养至第一次卵裂完成后，将所得胚胎置于室温下培养，每隔2-4小时换一次温度相同的清水，并在培养24小时后去除未受精的卵和死亡的胚胎。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，在所得成鱼中总共筛选出5-10%具有自然繁殖能力的雄性杂合鲫鱼和15-20%具有自然繁殖能力的雌性杂合鲫鱼并使其自交，获得稳定的四倍体杂合鲫鱼群体。
9.一种制备不育三倍体杂合鲫鱼的方法，所述方法包括以下步骤：利用根据权利要求1中的步骤（5）获得的四倍体杂合鲫鱼与母本鲫鱼杂交来制备不育三倍体杂合鲫鱼。
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