CN115735858B - 一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，包括S1.父本双二倍体红鲫与母本双三倍体银鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；S2.以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；S3.从双三倍体子代G2筛选能够直接整合精核基因组类型的双三倍体雌鱼，并将其卵子与紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，获得大量人工雌核生殖保持系G3；S4.以人工雌核生殖保持系G3为母本，与团头鲂等二倍体雄鱼杂交，获得合成新多倍体子代G4。本发明提供的育种方法能够大规模创制不育的合成新多倍体，从而为鲫鱼种质创新提供大量的种质资源，是一条非常有潜力的育种途径。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法。
技术背景
多倍化育种技术是目前最经典、且卓有成效的细胞工程育种技术。多倍化育种技术已被广泛地运用于鱼类遗传育种中。在鱼类中有很多天然的或人工合成的多倍体已被广泛揭示具有多种优良性状，例如双三倍体银鲫、三倍体虹鳟等。杂交育种技术是另外一种经典的细胞工程育种技术。通过种内或种间杂交整合两个物种的基因组，后代在外形、抗病能力等方面均可能表现出一定的杂种优势。杂交育种仍然是目前鱼类新品种培育的主要途径，成功案例如将黑尾鲌与团头鲂杂交获得水产新品种“先锋1号”，将瓦氏黄颡鱼与江黄颡鱼杂交培育的水产新品种“全优1号”等。此外，多倍化和杂交均可能导致子代不育或者育性严重降低。由于能量不需要额外提供给性腺发育，很多不育的鱼具有生长快，出肉率高的优势。同时，育性丧失还可以消除不必要的繁殖，避免人工养殖品种逃逸到自然水域后对天然群体的遗传结构产生破坏。因此将多倍化育种与杂交育种技术结合，发展新型的育种技术，创制不育的优良种质，为新品种培育提供核心育种材料，仍然是鱼类遗传育种的重要方向。
鲫鱼是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一，也是国人餐桌上最常见的食用鱼之一，近几年鲫鱼的年总产量已接近300万吨。在天然群体中，鲫鱼包括拥有100条染色体的双二倍体鲫(Carassius auratus)(也可称为异源四倍体AABB)以及拥有超过150条染色体的双三倍体银鲫(Carassius gibelio)(也可称为异源六倍体AAABBB)。双二倍体鲫是典型行有性生殖的物种，其雌雄性比为1:1，雌雄个体经过正常减数分裂后形成染色体数量减半的配子，随后经过精卵融合形成双二倍体受精卵。双三倍体银鲫具有天然单性雌核生殖的能力，银鲫卵子在成熟过程中第一次减数分裂被抑制，因此形成不减数的双三倍体卵子。精子与银鲫卵子受精后，精核一般不解凝，仅激活卵核进入胚胎发育过程。有意思的是，极少数的精核进入银鲫卵子后，不仅会发生解凝，还会与卵核融合形成更高倍性的合成新多倍体，但是这种情况自然发生的概率非常低。例如兴国红鲤(AABB)精子与银鲫卵子受精，大约只有0.3％-0.5％的红鲤精核会在银鲫卵核中自然解凝，并整入银鲫基因组形成合成双四倍体鲤鲫(AAAABBBB)。这种合成双四倍体鲤鲫在基因组组成上包含三套鲫鱼基因组和一套鲤鱼基因组，因此在外形上更接近鲫鱼。同时由于一套鲤鱼基因组的整入，合成双四倍体鲤鲫还具有生长快和抗病力强的优势。
因此利用银鲫整合父源基因组培育新品种是一条非常有潜力的鲫鱼育种途径。然而依赖精核偶发整入银鲫卵核的几率非常低，这也导致筛选和鉴定合成多倍体的工作量极大且效率极低。如何高效创制不育合成新多倍体鲫鱼仍然是目前鲫鱼品种改良以及新品种培育的关键技术瓶颈。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法。
本发明采用了以下技术方案：
一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，包括以下步骤：
S1.创制可育双四倍体鲫：父本双二倍体红鲫与母本双三倍体银鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；
S2.创制新双三倍体群体：以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；
S3.筛选及扩群：从新双三倍体子代G2中筛选出能够直接整合精核基因组类型的雌鱼，并将其卵子与紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，获得人工雌核生殖保持系G3；
S4.创制合成新多倍体：以人工雌核生殖保持系G3为母本，与不同类型的雄鱼杂交，获得合成新多倍体子代G4。
优选的，所述步骤S1中，母本双三倍体银鲫使用异育银鲫“中科3号”。
优选的，所述步骤S1中，繁殖的具体方法为：在鲫鱼繁殖季节，将父本精液以精液：胰蛋白酶溶液体积比为1：20进行混合，25℃下处理精液20min；取母本卵子与处理后的精液混合受精，所得受精卵继续孵化；所述胰蛋白酶溶液的浓度为1％。
优选的，所述步骤S1中，G1代包括双三倍体银鲫和双四倍体鲫，其筛选的具体方法为：
S11.将G1代养殖至性成熟后，剪鳍条采微量血，通过测定每尾个体血细胞的DNA含量，先筛选出四倍体子代；
S12.在S11筛选的四倍体子代，挑选出雄鱼并取精液，将取得的雄鱼精液分别与双二倍体鲫雌鱼卵子受精，根据受精卵孵化率最终筛选得到所述可育双四倍体雄鱼。
优选的，所述步骤S11中，将采集到的血加入CyStain DNA 1Step溶液后迅速混合，再利用流式细胞仪测定血细胞的DNA含量。
优选的，微量血为0.1～0.5μL；步骤S12中，受精卵孵化率＞10％，则雄鱼为可育双四倍体雄鱼。
优选的，所述步骤S3中，筛选能够直接整合精核基因组类型的雌鱼的具体方法为：
S31.挑选性成熟的兴国红鲤雄鱼并取精液，用精子保存液按体积比为1：50对精液进行稀释，将4ml稀释后的精液加入直径为10cm的培养皿中，晃动培养皿并在40W紫外灯下20cm处照射6～8min，获得紫外线灭活的精子；
S32.从新双三倍体子代G2中挑选出性成熟的雌性亲本，将其卵子分别同时与正常以及紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，检测与两种精子受精所形成胚胎G3的倍性；判断新双三倍体雌鱼生殖方式的具体标准为：当新双三倍体雌鱼卵子与紫外线灭活精子受精形成双三倍体胚胎，与正常精子受精形成双四倍体胚胎，则判定产生该新双三倍体雌鱼卵子的雌鱼为能够直接整合精核基因组类型的雌鱼。
优选的，所述步骤S32中，检测胚胎G3倍性的方法为：
S321.待G3胚胎发育至体节期，随机挑选100枚受精卵，混合后吸干多余水分，加入CyStain DNA 1Step溶液，并在溶液中将胚胎剪碎；
S322.剪碎的胚胎过300目滤网后获得细胞悬液，利用流式细胞仪测定所述细胞悬液中混合胚胎细胞的DNA含量。
优选的，所述步骤S4中，不同类型的雄鱼为二倍体团头鲂、草鱼、花鲢、白鲢、翘嘴鲌中的任意一种。
本发明的有益效果在于：
银鲫卵核会偶发整合精核基因组，形成包含三套鲫鱼基因组与一套父本基因组的更高倍性的合成新多倍体，但是这种情况自然发生的概率非常低。虽然通过一定浓度的胰酶处理雄鱼精液再与银鲫卵子受精，后代中可能出现较高比例(5％-20％)的合成多倍体。但胰酶处理会极大影响精子的受精能力，致使受精率低于5％，因此获得合成多倍体的实际概率最高也只能达到约1％，从而无法通过该方法获得大量的合成多倍体。并且不同类型雄鱼的精液耐受胰酶处理的最佳条件存在非常大的差异，所以还需要进行大量预实验摸索，耗时耗力。
本发明建立了一条高效创制合成新多倍体鲫鱼的方法，首先通过向雌核生殖异育银鲫基因组中整入一套有性生殖双二倍体鲫基因组，获得双四倍体雄鱼，然后将双四倍体与双二倍体鲫回交，从而获得一个新双三倍体群体。随后进一步从新双三倍体雌鱼中筛选出一种具有特殊生殖方式的个体，它们既具有与银鲫类似的产生不减数卵子的能力，又具有与双二倍体鲫类似的在受精过程中使精核解凝并与其融合形成胚胎的能力。因此将其卵子与正常精子受精，可直接获得包含三套鲫鱼基因组与一套父本基因组的合成新多倍体。而将其卵子与紫外线灭活的精子受精时，可实现对其进行人工雌核生殖扩群，从而获得大量该类型的雌鱼(保持系)。而进一步将其卵子与团头鲂精子受精，无需任何处理，可直接创制鲂鲫合成新多倍体(AAABBBC)，比例接近100％。
双二倍体鲫(AABB)与二倍体鲂(CC)直接杂交获得的杂交种(ABC)是无法存活的。而本发明创制的合成新多倍体(AAABBBC)不仅能够正常存活，并且在体形上非常接近于鲫鱼，因此可能更受养殖户和消费者喜爱。此外这种合成新多倍体鲂鲫是不育的，它的平均性腺指数低于3％，因此出肉率更高。同时，育性丧失意味着大规模养殖这种合成新多倍体鲂鲫不会引起潜在的生态风险。
将新双三倍体雌鱼卵子与灭活精子受精，获得大量新双三倍体保持系，以这种保持系为母本就可以大批量生产不育的合成新多倍体鲂鲫。
本发明建立的育种路线能够为鲫鱼种质创新提供大量的种质资源，研究者可根据育种需求，将双三倍体鲫(AAABBB)与更多不同类型的二倍体雄鱼(XX)杂交，从而创制更多类型的不育合成新多倍体(AAABBBX)。因此本方法是鲫种质创新与新品种培育的重要途径。
附图说明
图1为本发明提供的创制鲫鱼合成新多倍体方法的育种路线；
图2为本发明中双三倍体鲫与团头鲂杂交获得新多倍体后代的示意图；
图3为本发明中获得的双三倍体鲫(G3)，及其与团头鲂杂交获得的合成新多倍体鲂鲫淋巴细胞的中期分裂相；图中A为双三倍体鲫(约150条染色体)，B为合成新多倍体鲂鲫(约150+24＝174条染色体)；
图4为繁殖季节合成新多倍体鲂鲫的性腺外形及切片，与正常银鲫卵巢相比，新多倍体鲂鲫的卵巢中无任何成熟卵子，其精巢中也无任何成熟精子，表明合成新多倍体鲂鲫是不育的。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
如图1所示，一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，分为下述四个阶段：
第一阶段：创制可育双四倍体鲫
父本双二倍体红鲫(AABB)通过有性生殖减数分裂形成的减数精子(AB)，通过胰蛋白酶处理双二倍体红鲫的精液，再与母本双三倍体银鲫(AAABBB)通过雌核生殖无减数分裂形成的不减数卵子(AAABBB)受精，获得子代(G1)，然后从所述G1中筛选出可育双四倍体雄鱼(AAAABBBB)。本实施例中双三倍体银鲫使用异育银鲫“中科3号”，本阶段操作步骤具体为：
S1.用胰蛋白酶处理双二倍体红鲫雄鱼的精液：用精子保存液配置浓度为1％的胰蛋白酶溶液，按精液：胰蛋白酶溶液体积比为1:20进行混合，25℃下处理精液20min。
S2.将异育银鲫“中科3号”卵子与胰酶处理的红鲫精子受精：在繁殖季节挑选性成熟的异育银鲫“中科3号”进行人工催产，将经过步骤S1处理的精液与异育银鲫的成熟卵子混合后迅速倒入加水的白瓷盘中受精，期间用羽毛迅速搅动使卵子密度均匀地贴在白瓷盘底部，所得受精卵进行孵化，获得子代(G1)。
S3.从G1代中筛选出双四倍体：将受精卵孵化所得到的鱼苗养殖至性成熟，然后剪鳍条并从鳍条断裂血管处，采0.1～0.5μL的微量血，加入CyStain DNA 1Step(来源：德国Partec)溶液后迅速混匀，利用该溶液对血细胞进行快速固定和染色，再通过流式细胞仪，测定每尾个体血细胞的DNA含量，筛选出其中的双四倍体。
S4.从合成双四倍体群体中筛选出可育雄鱼：挑选雄鱼并取精液，然后将雄鱼精液分别与双二倍体鲫雌鱼卵子受精。统计受精卵孵化率，从而判断每尾双四倍体雄鱼的育性，从中筛选出孵化率＞10％的可育双四倍体雄鱼。
本实施例中，参照上述步骤：
S1.将约6000枚异育银鲫“中科3号”的成熟卵子与胰蛋白酶处理后的双二倍体红鲫精子受精，受精率约为5.45％，总计获得受精卵327枚。
S2.将327枚受精卵孵化所得到的鱼苗养至性成熟，获得210尾成鱼，经DNA含量检测后发现其中包括20尾双四倍体以及190尾双三倍体银鲫，因此双四倍体的创制率为9.52％。
S3.20尾双四倍体包括10尾雌性个体和10尾雄性个体，将10尾双四倍体雄鱼精子分别与双二倍体红鲫卵子受精，统计受精卵的孵化率，其中可育双四倍体雄鱼有2尾，比例为20％。
第二阶段：创制新双三倍体群体
以所述可育双四倍体雄鱼(AAAABBBB)为父本(有性生殖产生减数分裂的精子AABB)，双二倍体红鲫(AABB)为母本(有性生殖产生减数分裂的卵子AB)，回交得新双三倍体子代G2(AAABBB)，所述G2中，约80％的雌鱼具有雌核生殖能力。本阶段操作步骤具体为：
将双二倍体红鲫卵子与可育双四倍体鲫精子受精：在繁殖季节挑选性成熟的双二倍体红鲫雌鱼进行人工催产，将可育双四倍体雄鱼的精液与双二倍体红鲫的成熟卵子进行干法授精，具体为：用毛巾擦去亲鱼体表的余水，然后将母本的卵子和父本的精液挤入无水容器中，搅拌均匀后倒入加水的白瓷盘中受精，期间用羽毛迅速搅动使卵子密度均匀地贴在白瓷盘底部。所得受精卵进行孵化获得新双三倍体子代G2。
因此在第一阶段实验基础上，挑选3尾双二倍体红鲫雌鱼分别与获得的1尾可育双四倍体雄鱼进行受精，3个繁殖组的卵受精率分别为83.9％、90.8％、82.3％，受精卵孵化率分别为92.6％、90.8％、90.5％。
第三阶段：筛选能够直接整合精核基因组类型的雌鱼并对其进行人工雌核生殖扩群
从新双三倍体鲫鱼群体G2(AAABBB)中挑选出一批性成熟的雌性亲本，经人工催产后分别取卵子(AAABBB)，与正常以及紫外线灭活的兴国红鲤精子(AB)受精。检测每尾双三倍体雌鱼与两种精子受精所形成胚胎的倍性，如双三倍体雌鱼卵子与紫外线灭活精子受精形成双三倍体胚胎(AAABBB)，而与非灭活精子受精形成双四倍体胚胎(AAAABBBB)，则判定该雌鱼具有直接整合精核基因组能力；如双三倍体雌鱼卵子与正常以及紫外线灭活的精子受精后均形成双三倍体胚胎(AAABBB)，则判定该雌鱼仍然具有雌核生殖的能力。
对具有直接整合精核基因组能力类型的双三倍体雌鱼进行人工雌核生殖扩群的具体方法就是将其卵子与紫外线灭活的精子受精，获得的后代就是人工雌核生殖保持系。
本阶段操作步骤具体为：
S1.兴国红鲤精液的紫外线灭活处理：在繁殖季节挑选性成熟的兴国红鲤雄鱼并取精液，用精子保存液按体积比为1:50对精液进行稀释，将4ml稀释后的精液加入直径为10cm的塑料培养皿中，晃动后铺平培养皿底部，然后在15w紫外灯管下放置一个水平摇床，将培养皿放置在摇床上，中间垫一个冰盒，保持低温，同时使精子液面位于灯管正下方20cm处，照射精液6～8min，获得紫外线灭活的精子。
S2.在繁殖季节从新双三倍体子代G2鲫鱼群体中挑选出一批性成熟的雌性亲本，经人工催产后将它们的卵子分别与正常以及紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，所得受精卵进行孵化。
S3.胚胎倍性鉴定：对S2中不同繁殖组合形成的胚胎进行倍性检测，检测方法与第一阶段的步骤S3测定每尾个体血细胞的DNA含量方法相同，通过判断不同雌鱼分别与两种精子受精所形成胚胎的倍性差异，鉴定出能够直接整合精核基因组能力的雌鱼。
S4.对具有直接整合精核基因组能力的雌鱼进行人工雌核生殖扩群：具有直接整合精核基因组能力的双三倍体雌鱼(AAABBB)与紫外线灭活精子受精仍然形成双三倍体胚胎(AAABBB)，因此将这些胚胎孵化后获得大量该类型雌鱼的人工雌核生殖保持系G3。
在第二阶段实验的基础上，从G2代中挑选87尾性成熟的双三倍体雌鱼进行繁殖试验，其中80尾雌鱼属于雌核生殖，占比92.0％。另外7尾雌鱼具有直接整合精核基因组能力，占比8.0％。进一步从7尾雌鱼中随机挑选一尾雌鱼，将其与灭活兴国红鲤精子受精所形成的胚胎进行孵化与养殖，获得约400尾人工雌核生殖保持系G3，这些后代与其母本的生殖方式完全相同，具有直接整合精核基因组的能力。
第四阶段：创制新多倍体
以G3雌鱼为母本，与团头鲂等二倍体父本进行繁殖，获得子代为鲂鲫等合成新多倍体G4。
本发明中，如图2所示，用于创制新多倍体的父本可以选择团头鲂等不同类型的雄鱼。本阶段操作步骤具体为：
S1.在繁殖季节，从人工雌核生殖保持系G3中挑选性成熟个体，经人工催产后，将其卵子分别与团头鲂等雄鱼的精子进行干法授精，所得受精卵进行孵化。
从第三阶段制备的400尾人工雌核生殖保持系G3中随机挑选3尾个体，将其卵子与团头鲂精子受精，平均受精率和胚胎孵化率分别为90.6％±2.9％和91.2％±3.5％。
S2.后代倍性确认：倍性鉴定方法与第一阶段的步骤S3测定每尾个体血细胞的DNA含量方法相同。
将上述胚胎养至成体，随机挑选50尾后代进行倍性鉴定，确认这些个体均为合成新多倍体，说明通过本方法创制合成新多倍体的比例高达100％。进一步计数这些合成新多倍体淋巴细胞中期分裂相的染色体数，如图3所示，确认以团头鲂为父本获得的合成新多倍体鲂鲫具有约150+24＝174条染色体。
S3.后代育性确认：如图4所示，繁殖季节对100尾合成新多倍体鲂鲫的性腺进行解剖和组织学检测，结果显示所有被检测个体卵巢中无任何成熟卵子，精巢中也无任何成熟精子，确认合成新多倍体鲂鲫是不育的。
上述实验证明本发明提供的育种方法能够大规模创制不育的合成新多倍体，从而为鲫鱼种质创新提供大量的种质资源，是培育鲫新品种的高效途径。
根据育种需求，研究者还可将双三倍体鲫与更多不同类型的雄鱼进行杂交，并从中选育出具有不同杂种优势性状的新品种。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.创制可育双四倍体鲫：父本双二倍体红鲫与母本双三倍体银鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；所述母本双三倍体银鲫使用异育银鲫“中科3号”；
S2.创制新双三倍体群体：以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；
S3.筛选及扩群：从双三倍体子代G2中筛选出能够直接整合精核基因组类型的雌鱼，并将其卵子与紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，获得人工雌核生殖保持系G3；
S4.创制合成新多倍体：以人工雌核生殖保持系G3为母本，与不同类型的雄鱼杂交，获得合成新多倍体子代G4。
2.如权利要求1所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S1中，繁殖的具体方法为：在鲫鱼繁殖季节，将父本精液以精液：胰蛋白酶溶液体积比为1：20进行混合，25℃下处理精液20min；取母本卵子与处理后的精液混合受精，所得受精卵继续孵化；所述胰蛋白酶溶液的浓度为1％。
3.如权利要求1所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S1中，G1代包括双三倍体银鲫和双四倍体鲫，其筛选的具体方法为：
S11.将G1代养殖至性成熟后，剪鳍条采微量血，通过测定每尾个体血细胞的DNA含量，先筛选出四倍体子代；
S12.在S11筛选的四倍体子代，挑选雄鱼并取精液，将取得的雄鱼精液分别与双二倍体鲫雌鱼卵子受精，根据受精卵孵化率最终筛选得到所述可育双四倍体雄鱼。
4.如权利要求3所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S11中，将采集到的血加入CyStain DNA 1Step溶液后迅速混合，再利用流式细胞仪测定血细胞的DNA含量。
5.如权利要求3所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，微量血为0.1～0.5μL；步骤S12中，受精卵孵化率＞10％，则雄鱼为可育双四倍体雄鱼。
6.如权利要求1所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S3中，筛选能够直接整合精核基因组类型的雌鱼的具体方法为：
S31.挑选性成熟的兴国红鲤雄鱼并取精液，用精子保存液按体积比为1：50对精液进行稀释，将4ml稀释后的精液加入直径为10cm的培养皿中，晃动培养皿并在40W紫外灯下20cm处照射6～8min，获得紫外线灭活的精子；
S32.从新双三倍体子代G2中挑选出性成熟的雌性亲本，将其卵子分别同时与正常以及紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，检测与两种精子受精所形成胚胎G3的倍性；当新双三倍体雌鱼卵子与紫外线灭活精子受精形成双三倍体胚胎，与正常精子受精形成双四倍体胚胎，则判定产生该新双三倍体雌鱼卵子的雌鱼为能够直接整合精核基因组类型的雌鱼。
7.如权利要求6所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S32中，检测胚胎G3倍性的方法为：
S321.待G3胚胎发育至体节期，随机挑选100枚受精卵，混合后吸干多余水分，加入CyStain DNA 1Step溶液，并在溶液中将胚胎剪碎；
S322.剪碎的胚胎过300目滤网后获得细胞悬液，利用流式细胞仪测定所述细胞悬液中混合胚胎细胞的DNA含量。
8.如权利要求1所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S4中，不同类型的雄鱼为二倍体团头鲂、草鱼、花鲢、白鲢、翘嘴鲌中的任意一种。
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