CN115486412B - 一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，包括S1.创制可育双四倍体鲫：母本双三倍体银鲫与父本双二倍体红鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；S2.创制新双三倍体群体：以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；S3.创制双三倍体雌核生殖克隆系：以新双三倍体G2中的雌鱼为母本，利用兴国红鲤精子刺激其进行天然雌核生殖，得到双三倍体子代G3，G3为新多倍体雌核生殖克隆系。本发明建立了一条高效创制大量银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的育种路线，是银鲫新品种培育的高效途径，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种高效创制大量银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法。
技术背景
随着基因组倍性的增加，往往细胞尺寸会随之增加。因此多倍体常常表现出比二倍体近亲生长更快，营养器官或个体更大的特征。在鱼类中，有很多天然的多倍体物种或多倍体生物型已被广泛揭示具有生长快、适应性广、抗病性强等优良性状。作为一种最为经典的育种方法，多倍体育种技术已被广泛应用于经济鱼类的新品种培育。三倍体虹鳟、多倍体鲟、双三倍体“异育银鲫”等都是其中的典型案例。针对水产养殖产业存在的重大需求，优化与发展新的、高效的育种技术，创建优良种质，仍然是鱼类遗传育种的重要方向之一。
鲫鱼是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一，也是国人餐桌上最常见的食用鱼，近几年鲫鱼的年总产量已接近300万吨。在天然群体中，鲫鱼包括拥有100条染色体的双二倍体鲫(Carassius auratus)(也可称为异源四倍体AABB)以及拥有超过150条染色体的双三倍体银鲫(Carassius gibelio)(也可称为异源六倍体AAABBB)。双二倍体鲫是一种典型行有性生殖的物种，其雌雄性比为1∶1，雌雄个体经过正常减数分裂后形成染色体数量减半的配子，随后经过精卵融合形成双二倍体受精卵。而双三倍体银鲫具有天然单性雌核生殖的能力，银鲫卵子在成熟过程中不进行第一次减数分裂，因此形成不减数的双三倍体卵子。异源精子与银鲫卵子受精后，精核一般不解凝，仅激活卵核进入胚胎发育过程。因此雌核生殖后代均具有与母本相同的基因型，这种遗传上的高度一致性导致这些后代具有体型均一、整齐度高的特点。
从天然鲫鱼群体中，直接选育出银鲫新品种是目前鲫鱼育种的主要途径之一。其一般步骤首先是从天然鲫鱼群体中筛选出野生双三倍体银鲫群体，然后通过遗传鉴定评估该群体的遗传多样性，并对其中具有显著遗传差异的个体分别进行雌核生殖扩群，从而获得对应雌核生殖克隆系，再进一步将其中具有优势性状的克隆系选育成为新品种。近40年来，我国共计有6个鲫鱼水产新品种是从天然的银鲫群体中选育而来，包括第一代异育银鲫(1983)、彭泽鲫(GS-01-003-1996)、松浦银鲫(GS-01-005-1996)、高体型异育银鲫(GS-02-009-1996)、萍乡红鲫(GS-01-001-2007)以及白金丰产鲫(GS-01-001-2015)。然而天然鲫鱼群体的遗传背景非常复杂，往往包括不同倍性，不同龄期的个体，从天然群体中选育新品种不仅周期较长，而且效率较低。因此如何实现在现有银鲫品种的基础上进一步高效创制出大量新的克隆系，为银鲫新品种研发提供核心育种材料，对于银鲫遗传育种具有重大意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，可以实现在银鲫主养品系的基础上，构建核心育种群体，从而进一步创制出大量新的雌核生殖克隆系。
本发明采用了以下技术方案：
一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，包括以下步骤：
S1.创制可育双四倍体鲫：父本双二倍体红鲫与母本双三倍体银鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；
S2.创制新双三倍体群体：以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；
S3.创制双三倍体雌核生殖克隆系：以新双三倍体子代G2中的雌鱼为母本，利用父本兴国红鲤精子刺激母本卵子进行天然雌核生殖，得到双三倍体子代G3，G3为新多倍体雌核生殖克隆系。
优选的，所述步骤S1中，母本双三倍体银鲫使用异育银鲫“中科3号”。
优选的，所述步骤S1中，繁殖的具体方法为：在鲫鱼繁殖季节，将父本精液以精液：胰蛋白酶溶液体积比为1：20进行混合，25℃下处理精液20min；取母本卵子与处理后的精液混合受精，所得受精卵继续孵化；所述胰蛋白酶溶液的浓度为1％。
优选的，所述步骤S2、S3中，父本与母本间均采用干法授精，具体方法为：分别将母本的卵子和父本的精液挤入无水容器中搅拌受精。
优选的，所述步骤S1中，G1代筛选的具体方法为：
S11.将G1代养殖至性成熟后，剪鳍条采微量血，通过测定每尾个体血细胞的DNA含量，先筛选出四倍体子代；
S12.在S11筛选的四倍体子代，根据第二性征挑选雄鱼并取精液，将取得的雄鱼精液分别与双二倍体鲫雌鱼卵子受精，根据受精卵孵化率，最终筛选得到所述可育双四倍体雄鱼。
优选的，所述步骤S11中，将采集到的血加入CyStain DNA 1Step溶液后迅速混合，再利用流式细胞仪测定血细胞的DNA含量。
优选的，所述微量血为0.1～0.5μL。
优选的，所述第二性征为观察鲫鱼鳃盖上有无追星，有追星为雄鱼，没有追星为雌鱼。
优选的，受精卵孵化率＞10％，则雄鱼为可育双四倍体雄鱼。
优选的，步骤S2中，还包括对子代G2进行倍性确认步骤，具体方法为：
S21.待G2胚胎发育至体节期，随机挑选100枚受精卵，混合后吸干多余水分，加入CyStain DNA1Step溶液，并在溶液中将胚胎剪碎；
S22.剪碎的胚胎过300目滤网后获得细胞悬液，利用流式细胞仪测定所述细胞悬液中混合胚胎细胞的DNA含量并与双三倍体体细胞DNA含量进行比较，若结果一致则确认G2代为双三倍体。
本发明的有益效果在于：
本发明建立了一条高效创制大量鲫鱼雌核生殖克隆系的育种路线，通过胰蛋白酶处理精子，向雌核生殖双三倍体异育银鲫中整入一套有性生殖双二倍体鲫基因组，获得倍性升高的可育合成双四倍体雄鱼，然后将其与双二倍体鲫雌鱼回交，从而获得一个倍性恢复并且具有高度遗传多样性的新双三倍体群体。
本发明提供的这种新双三倍体的形成机制类似于大众熟知的“无籽西瓜”，因此一般认为这些新双三倍体是不育的。但本发明突破了传统思维，发现新双三倍体中雌鱼不仅可育，其中大部分个体还重新获得了雌核生殖的能力。因此每一尾双三倍体雌鱼都能被培育成一个新的双三倍体克隆系。
本育种路线的建立能够为银鲫育种提供大量的遗传资源，研究者可根据育种需求，进一步从获得的大量新双三倍体雌核生殖克隆系中筛选出具有不同经济性状优势的新品种。
本发明中双三倍体银鲫使用的是鲫鱼主要养殖品种之一的异育银鲫“中科3号”，因此实现了在银鲫主养品系的基础上，高效且大量地创制出新的雌核生殖克隆系，且这些克隆系均具有清晰的遗传背景。
附图说明
图1为本发明提供的一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的育种路线；
图2为鲫鱼鳃盖上有无追星的对比图，图中a为无追星雌鲫，b为有追星雄鲫；
图3为育种路线中鲫鱼的染色体倍性，图中A-D分别为双二倍体红鲫、双三倍体银鲫、G1代可育双四倍体鲫、G2代新双三倍体鲫；
图4为本发明利用G2代中3尾双三倍体鲫雌鱼，通过其天然雌核生殖能力获得的3个新双三倍体克隆系，可以看出，子代的外形性状与母本基本相同。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：
如图1所示，一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，分为下述三个阶段：
第一阶段：创制可育双四倍体鲫
父本双二倍体红鲫(AABB)通过有性生殖减数分裂形成的减数精子(AB)，通过胰蛋白酶处理双二倍体红鲫的精液，再与母本双三倍体银鲫(AAABBB)通过雌核生殖无减数分裂形成的不减数卵子(AAABBB)受精，获得子代(G1)，然后从所述G1中筛选出可育双四倍体雄鱼(AAAABBBB)。本实施例中双三倍体银鲫使用异育银鲫“中科3号”，本阶段操作步骤具体为：
S1.用胰蛋白酶处理双二倍体红鲫雄鱼的精液：用精子保存液配置浓度为1％的胰蛋白酶溶液，按精液：胰蛋白酶溶液体积比为1：20进行混合，25℃下处理精液20min。
S2.将异育银鲫“中科3号”卵子与胰酶处理的红鲫精子受精：在繁殖季节挑选性成熟的异育银鲫“中科3号”进行人工催产，将经过步骤S1处理的精液与异育银鲫的成熟卵子混合后迅速倒入加水的白瓷盘中受精，期间用羽毛迅速搅动使卵子密度均匀地贴在白瓷盘底部，所得受精卵进行孵化，获得子代(G1)。
S3.从G1代中筛选出双四倍体：将受精卵孵化所得到的鱼苗养殖至性成熟，然后剪鳍条并从鳍条断裂血管处，采0.1～0.5μL的微量血，，加入CyStain DNA 1Step(来源：德国Partec)溶液后迅速混匀，利用该溶液对血细胞进行快速固定和染色，再通过流式细胞仪，测定每尾个体血细胞的DNA含量，筛选出其中的双四倍体。
S4.从合成双四倍体群体中筛选出可育雄鱼：根据鳃盖上有无追星区分雌雄，并挑选有追星的雄鱼取精液。将雄鱼精液分别与双二倍体鲫雌鱼卵子受精，统计受精卵孵化率，从而判断每尾双四倍体雄鱼的育性，从中筛选出孵化率＞10％的可育双四倍体雄鱼。
本实施例中，参照上述步骤：
S1.将约6000枚异育银鲫“中科3号”的成熟卵子与胰蛋白酶处理后的双二倍体红鲫精子受精，受精率约为5.45％，总计获得受精卵327枚。
S2.将327枚受精卵孵化所得到的鱼苗养至性成熟，获得210尾成鱼，经DNA含量检测后发现其中包括20尾双四倍体以及190尾双三倍体银鲫，因此双四倍体的创制率为9.52％。
S3.20尾双四倍体包括10尾雌性个体和10尾雄性个体，将10尾双四倍体雄鱼精子分别与双二倍体红鲫卵子受精，统计受精卵的孵化率，其中可育双四倍体雄鱼有2尾，比例为20％。
第二阶段：创制新双三倍体群体
以所述可育双四倍体雄鱼(AAAABBBB)为父本(有性生殖产生减数分裂的精子AABB)，双二倍体红鲫(AABB)为母本(有性生殖产生减数分裂的卵子AB)，回交得新双三倍体子代G2(AAABBB)，所述G2中，约80％的雌鱼可育，且绝大部分个体具有雌核生殖能力。本阶段操作步骤具体为：
S1.将双二倍体红鲫卵子与可育双四倍体鲫精子受精：在繁殖季节挑选性成熟的双二倍体红鲫雌鱼进行人工催产，将可育双四倍体雄鱼的精液与双二倍体红鲫的成熟卵子进行干法授精，具体为：用毛巾擦去亲鱼体表的余水，然后将母本的卵子和父本的精液挤入无水容器中，搅拌均匀后倒入加水的白瓷盘中受精，期间用羽毛迅速搅动使卵子密度均匀地贴在白瓷盘底部。所得受精卵进行孵化获得子代G2。
S2.子代倍性确认：待胚胎发育至体节期，随机挑选100枚受精卵，混合后吸干多余的水分，然后加入CyStain DNA 1Step(来源：德国Partec)溶液，在溶液中将胚胎剪碎，经300目筛网过滤后获得细胞悬液，利用流式细胞仪，确认混合胚胎细胞的DNA含量。如图3所示，通过检测证明所得G2代为双三倍体。
在第一阶段实验基础上，参照上述步骤：
S1.挑选3尾双二倍体红鲫雌鱼分别与1尾可育双四倍体雄鱼进行受精，3个繁殖组的卵受精率分别为83.9％、90.8％、82.3％，受精卵孵化率分别为92.6％、90.8％、90.5％。
S2.继续从三个繁殖组合中各挑选100枚受精卵进行DNA含量检测，确定混合胚胎的DNA含量。结果显示混合胚胎DNA含量与双三倍体体细胞的DNA含量一致，从而进一步确定说明双二倍体红鲫卵子与可育合成双四倍体鲫精子受精后获得的子代均为双三倍体。
第三阶段：创制双三倍体雌核生殖克隆系
以所述新双三倍体G2(AAABBB)中的雌鱼为母本，利用兴国红鲤精子刺激其进行天然雌核生殖，得到双三倍体子代G3(AAABBB)，所述G3为新多倍体雌核生殖克隆系。本阶段操作步骤具体为：
S1.将新双三倍体鲫卵子与兴国红鲤精子受精：在繁殖季节，从新双三倍体鲫群体G2中挑选性成熟的雌性个体，进行人工催产，然后将卵子与兴国红鲤雄鱼进行干法授精，所得受精卵进行孵化。
S2.子代倍性确认：对不同母本形成的胚胎进行倍性确认，倍性鉴定方法与第二阶段的步骤S2相同，确认胚胎细胞的倍性仍然是双三倍体。
在第二阶段实验基础上，共挑选87尾性成熟的双三倍体雌鱼进行繁殖试验，其中80尾雌鱼的后代基本都是双三倍体，部分繁殖结果参见图4。说明92.0％的雌鱼均能行雌核生殖，这些雌鱼都能形成一个新双三倍体雌核生殖克隆系，80尾雌鱼可以形成80个克隆系。
上述实验证明本发明提供的方法能够在主养银鲫品种“中科3号”的基础上，高效且大量创制出新的雌核生殖克隆系，因此是银鲫新品种培育的高效途径。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.创制可育双四倍体鲫：父本双二倍体红鲫与母本双三倍体银鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；
所述母本双三倍体银鲫使用异育银鲫“中科3号”，所述繁殖的具体方法为：在鲫鱼繁殖季节，将父本精液以精液：胰蛋白酶溶液体积比为1：20进行混合，25℃下处理精液20min；取母本卵子与处理后的精液混合受精，所得受精卵继续孵化；所述胰蛋白酶溶液的浓度为1％；
S2.创制新双三倍体群体：以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；
S3.创制双三倍体雌核生殖克隆系：以新双三倍体子代G2中的雌鱼为母本，利用父本兴国红鲤精子刺激母本卵子进行天然雌核生殖，得到双三倍体子代G3，G3为新多倍体雌核生殖克隆系。
2.如权利要求1所述的一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，其特征在于，所述步骤S2、S3中，父本与母本间均采用干法授精，具体方法为：分别将母本的卵子和父本的精液挤入无水容器中搅拌受精。
3.如权利要求1所述的一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，其特征在于，所述步骤S1中，G1代筛选的具体方法为：
S11.将G1代养殖至性成熟后，剪鳍条采微量血，通过测定每尾个体血细胞的DNA含量，先筛选出四倍体子代；
S12.在S11筛选的四倍体子代，根据第二性征挑选雄鱼并取精液，将取得的雄鱼精液分别与双二倍体鲫雌鱼卵子受精，根据受精卵孵化率，最终筛选得到所述可育双四倍体雄鱼。
4.如权利要求3所述的一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，其特征在于，所述步骤S11中，将采集到的血加入CyStain DNA 1Step溶液后迅速混合，再利用流式细胞仪测定血细胞的DNA含量。
5.如权利要求3所述的一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，其特征在于，所述微量血为0.1～0.5μL。
6.如权利要求3所述的一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，其特征在于，所述第二性征为观察鲫鱼鳃盖上有无追星，有追星为雄鱼，没有追星为雌鱼。
7.如权利要求3所述的一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，其特征在于，受精卵孵化率＞10％，则雄鱼为可育双四倍体雄鱼。
8.如权利要求1所述的一种高效创制银鲫新多倍体雌核生殖克隆系的方法，其特征在于，步骤S2中，还包括对子代G2进行倍性确认步骤，具体方法为：
S21.待G2胚胎发育至体节期，随机挑选100枚受精卵，混合后吸干多余水分，加入CyStain DNA 1Step溶液，并在溶液中将胚胎剪碎；
S22.剪碎的胚胎过300目滤网后获得细胞悬液，利用流式细胞仪测定所述细胞悬液中混合胚胎细胞的DNA含量并与双三倍体体细胞DNA含量进行比较，若结果一致则确认G2代为双三倍体。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1454467A (zh) * | 2003-06-06 | 2003-11-12 | 中国科学院水生生物研究所 | 银鲫品种培育和苗种生产的方法 |
| WO2006035513A1 (ja) * | 2004-09-29 | 2006-04-06 | Matsumoto Institute Of Microorganisms Co., Ltd. | 複２倍体水棲動物とその育種法 |
| CN1875700A (zh) * | 2006-07-07 | 2006-12-13 | 华南师范大学 | 新型鲫鱼复合鲫的产生方法 |
| CN101796932A (zh) * | 2010-04-07 | 2010-08-11 | 江苏海辰科技集团 | 异育银鲫新品系优化选育育苗方法 |
| CN103875574A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-06-25 | 湖南师范大学 | 两性可育同源四倍体鲫鱼的选育方法及其品系的建立方法、三倍体鱼的选育方法 |
| CN109329128A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-02-15 | 湖南师范大学 | 日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法及合方鲫2号的培育方法 |
| CN109874707A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-06-14 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种高效创制异源八倍体银鲫的方法 |
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1454467A (zh) * | 2003-06-06 | 2003-11-12 | 中国科学院水生生物研究所 | 银鲫品种培育和苗种生产的方法 |
| WO2006035513A1 (ja) * | 2004-09-29 | 2006-04-06 | Matsumoto Institute Of Microorganisms Co., Ltd. | 複２倍体水棲動物とその育種法 |
| CN101026956A (zh) * | 2004-09-29 | 2007-08-29 | 株式会社松本微生物研究所 | 双二倍体水生动物及其培育方法 |
| CN1875700A (zh) * | 2006-07-07 | 2006-12-13 | 华南师范大学 | 新型鲫鱼复合鲫的产生方法 |
| CN101796932A (zh) * | 2010-04-07 | 2010-08-11 | 江苏海辰科技集团 | 异育银鲫新品系优化选育育苗方法 |
| CN103875574A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-06-25 | 湖南师范大学 | 两性可育同源四倍体鲫鱼的选育方法及其品系的建立方法、三倍体鱼的选育方法 |
| CN109329128A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-02-15 | 湖南师范大学 | 日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法及合方鲫2号的培育方法 |
| CN109874707A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-06-14 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种高效创制异源八倍体银鲫的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 外源精子基因组整入雌核生殖银鲫卵子创制异源八倍体的有效方法;李志等;水生生物学报;20200131;第44卷(第1期);26-35 * |
| 多倍体银鲫克隆多样性和双重生殖方式的遗传基础和育种应用;桂建芳等;中国科学: 生命科学;20101231;第40卷(第2期);97-103 * |
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