CN104322408A - 一种翘嘴鳜多倍体的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种翘嘴鳜多倍体的诱导方法。该翘嘴鳜多倍体诱导方法的主要步骤如下：选取性腺发育成熟的翘嘴鳜雌鱼和雄鱼，分别采集成熟的卵子和精液，人工受精，受精后2～10min用39～43℃的养殖用水热休克处理1～3min，然后在25～28℃的养殖用水中孵化，完成热休克法的翘嘴鳜多倍体诱导。采用本发明所述的该条件进行翘嘴鳜多倍体的诱导，最佳效果可达受精率32.07%，多倍体得率可达80.64%，孵化率可达95.9%，具有良好的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于鱼类育种技术领域。更具体地，涉及一种翘嘴鳜多倍体的诱导方法。
背景技术
翘嘴鳜隶属鲈形目，鮨科，鳜属，是淡水鱼类中的珍品。其肉质细嫩、厚实、少刺，且蛋白质含量极高，营养十分丰富，味道鲜美，深受广大消费者的喜爱，在我国已经成为经济价值很高、市场需求量很大的名特水产养殖品种之一。但是翘嘴鳜天然资源随着大强度捕捞而逐渐减少，因此翘嘴鳜的人工繁殖和苗种培育技术的研究显得十分必要。
从上世纪80年代以来，鳜鱼人工繁殖技术的解决和完善，为翘嘴鳜的大规模养殖创造了条件。但是所养殖的翘嘴鳜无品种可言，繁殖亲本主要是来自长江等水系捕捞的野生鳜或经过数代养殖的鳜，其子代生长速度较慢，抗病力弱，驯食能力差，种质资源退化，适应集约化养殖能力较弱，严重制约着翘嘴鳜养殖产业化道路。近年来，翘嘴鳜的育种方法研究主要集中在杂交育种和雌核发育。但是杂交育种存在期限太长的问题，雌核发育成功率和孵化成活率较低。总之，近年来翘嘴鳜人工繁殖技术存在鱼苗成活率低、生产成本高的问题。
多倍体系指生物体体细胞中含有超过2个染色体组的个体。相对于二倍体，多倍体含有3个、4个或更多的染色体组，而依次被称为三倍体、四倍体和五倍体等。多倍体育种在鱼类遗传育种中具有重要的地位，多倍体鱼类尤其是三倍体鱼类对提高鱼类生长速度、延长鱼类寿命、改善鱼肉品质以及保护鱼类种质资源等方面均有重要意义。目前，鱼类多倍体的诱导方法主要有温度休克（包括冷休克或热休克）、药物处理（包括细胞松弛素B、6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）、咖啡因、秋水仙素和聚乙二醇等）、静水压、杂交等。其中药物处理法具有诱导成功率低，用于试验处理的试验材料（受精卵）数量受到限制，有些诱导剂毒性较大，有致癌性，难溶于水，且价格昂贵等缺点。静水压法处理则需要专门设备，成本较高，并且样本容量有限。杂交，尤其是种间杂交的方法诱导多倍体，则周期较长、诱导率较低。温度休克法诱导鱼类多倍体则具有操作简单、成功率高、育种周期短的优势。但是本领域技术人员公知，不同鱼类的育种方法和条件是不具有参考性和借鉴性的。温度休克法并不适用于所有的鱼类，而且针对不同的鱼类，采用何种温度休克方式，处理的开始时间、持续时间及温度等条件是非常关键的，目前鱼类的多倍体育种还存在许多尚未解决的难题。因此对于特定的鱼种，探索出最佳的多倍体育种方法是一个值得探索的课题。
发明内容
本发明的目的是要解决的技术问题是克服现有翘嘴鳜育种技术的不足和缺陷，提供一种操作简单、成功率高、育种周期短的翘嘴鳜多倍体的诱导方法。
本发明另一目的是提供所述方法在翘嘴鳜育种方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种翘嘴鳜多倍体的诱导方法，包括如下步骤：
S1.获取精卵：选取性腺发育成熟的翘嘴鳜雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；
S2.人工受精：将精液与卵子混合，先轻轻搅拌（可用羽毛），使精卵充分混匀后，加入生理盐水激活精子，进行人工受精；
S3.获得多倍体：将受精后2～10min的受精卵转移至39～43℃养殖用水中进行热休克处理1～3min，使染色体组加倍；
S4.将经过热休克处理的受精卵移至养殖用水中孵化，按照普通翘嘴鳜苗种生产方法管理，培育翘嘴鳜多倍体鱼苗。
优选地，步骤S1所述采集精液和成熟卵子的方法为：
S1.给亲鱼注射催产剂后，放入25～28℃水中，效应时间为22～24h；
S2.提早2 h开始观察，检查亲鱼发情情况，并每隔30 min 检查一次；
S3.当轻压腹部，雌鱼生殖孔中有卵粒流出时，即可进行精卵采集；
S4.采集时，分别用湿毛巾包裹雄鱼和雌鱼，轻压亲鱼腹部，将精、卵挤入干燥洁净的器皿中，精、卵避免阳光直射。
优选地，步骤S2所述生理盐水的水温为25～27℃。
优选地，步骤S3是将受精后8min的受精卵转移至39～41℃养殖用水中进行热休克处理1～2min。
更优选地，步骤S3是将受精后8min的受精卵转移至41℃养殖用水中进行热休克处理2min。
优选地，步骤S4所述孵化的温度为25～28℃。
上述翘嘴鳜多倍体的诱导方法在翘嘴鳜育种方面的应用也在本发明的保护范围之内。
温度休克法包括冷休克和热休克两种截然不同的方法，大量文献表明，一般冷水性的鱼类宜采用热休克，温度范围为28～36℃；温水性的鱼类宜用冷休克，温度范围0℃左右。翘嘴鳜是一种温水性江河湖川名贵底层鱼类，目前公开的利用雌核发育育种时就是利用冷休克的方法使染色体组加倍。但是本发明为了获得更好的诱导效果，经过大量研究和探索，得出了本发明上述的利用热休克法的多倍体诱导育种工艺，取得了显著的效果。
现有技术中，本领域人员公知，不同鱼类第二极体排放时间及卵的耐受温度和耐受时间均不同；第二极体的排放时间也与受精水温、卵子的成熟程度、鱼类的生长环境等有很大的关系，因此利用在利用温度休克的方法进行多倍体育种时，各个环节及其条件都是需要严格控制的，且各环节之间是一个协调统一的整体，对最终育种的成功率和孵化率都有至关重要的影响。一般冷水性鱼类的第二极体排出时间较迟，而温水性鱼类较早，在采用温度休克时通常要用亚致死温度才能有效地抑制第二极体的放出，并且处理时间太短无抑制作用，太长则会对胚体造成较大损伤，导致孵化率下降、畸形率上升而影响整体诱导效果。而温度的高低和处理持续时间控制不好，也会对卵子或受精卵造成很大的损伤。因此需要大量的研究和探索，才能正确判断第二极体排出时间和受精卵的耐受温度和耐受时间等条件，从而确定最佳的诱导育种条件。影响温度休克法诱导多倍体效果的关键因素有：处理的时机、持续时间和温度的高低；受精后立刻进行温度休克，可阻止第二极体的排出；若是在第一次有丝分裂的中期进行休克处理，可抑制第一次卵裂。鱼类温度休克敏感性的差异既与其遗传背景有关，也与卵子的成熟程度有关。综上所述，值得提出的是，针对同一种鱼，不同的人用相同的方法诱导多倍体也可能会得出不同的结果，因为诱导结果与卵子的成熟度、诱导工艺的差异、倍性鉴定方法的不同和鱼种地理种群的不同等因素都有关系。
因此，本发明经过大量的反复验证，严格控制了诱导工艺条件，包括精子、卵子的获取时机，热休克处理的开始时间、温度和持续时间，以及后续的培育条件。首先，对于精子和卵子的获取时机：一般在注射催产剂后，当水温为25～28℃时，效应时间为22～24h，提早2 h开始观察，检查亲鱼发情情况，并每隔30 min 检查一次。当轻压腹部，雌鱼生殖孔中有卵粒流出时，即可进行精卵采集。采集时，分别用湿毛巾包裹雄鱼和雌鱼，轻压亲鱼腹部，将精、卵挤入干燥洁净的器皿中，精、卵避免阳光直射。其次，对于诱导条件则如上所述：受精后2～10min，将受精卵转移至39～43℃养殖用水中进行热休克处理1～3min，再转移至25～28℃的养殖用水中孵化。采用本发明所述的该条件进行翘嘴鳜多倍体的诱导，最佳效果可达受精率32.07%，多倍体得率可达80.64%，孵化率可达95.9%。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种翘嘴鳜多倍体的诱导方法，首次通过热休克法成功诱导出翘嘴鳜多倍体，并且精确控制了精子与卵子的采取时机，以及诱导工艺。最优选的诱导条件为：精确选取性腺发育成熟的翘嘴鳜雌鱼和雄鱼，在严格控制的合适的时机分别采集成熟的精液和卵子，25～27℃生理盐水中人工受精，受精后8min用41℃的养殖用水热休克处理2min，然后在25～28℃的养殖用水中孵化，得到多倍体翘嘴鳜。实验结果表明，最佳效果可达受精率为32.07%，多倍体得率为80.64%，孵化率为95.9%。
另外，本发明的方法具有操作简单、成功率高、育种周期短的显著优势，具有良好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1翘嘴鳜二倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图（DI=1.0）。
图2翘嘴鳜三倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图（DI=1.5）。
图3翘嘴鳜四倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图（DI=1.9）。
图4翘嘴鳜五倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图（DI=2.5）。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、步骤如下：
S1.获取精卵：选取性腺发育成熟的翘嘴鳜雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；
S2.人工受精：将精液与卵子混合，轻轻拌均后加入25～27℃的生理盐水进行人工受精；
S3.获得多倍体：将受精后8min的受精卵转移至39℃养殖用水中进行热休克处理2min，使染色体组加倍；
S4.将经过热休克处理的受精卵移至25～28℃的养殖用水中孵化，按照普通翘嘴鳜苗种生产方法管理，培育翘嘴鳜多倍体鱼苗。
2、实验结果表明，受精率为34.5%，三倍体得率为12%，孵化率为74.29%。
实施例2
1、步骤如下：
S1.获取精卵：选取性腺发育成熟的翘嘴鳜雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；
S2.人工受精：将精液与卵子混合，轻轻拌均后加入25～27℃的生理盐水进行人工受精；
S3.获得多倍体：将受精后8min的受精卵转移至41℃养殖用水中进行热休克处理1min，使染色体组加倍；
S4.将经过热休克处理的受精卵移至25～28℃的养殖用水中孵化，按照普通翘嘴鳜苗种生产方法管理，培育翘嘴鳜多倍体鱼苗。
2、实验结果表明，受精率为33.67%，多倍体得率为6.67%，孵化率为96.72%。
实施例3
1、步骤如下：
S1.获取精卵：选取性腺发育成熟的翘嘴鳜雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；
S2.人工受精：将精液与卵子混合，轻轻拌均后加入25～27℃的生理盐水进行人工受精；
S3.获得多倍体：将受精后8min的受精卵转移至41℃养殖用水中进行热休克处理2min，使染色体组加倍；
S4.将经过热休克处理的受精卵移至25～28℃的养殖用水中孵化，按照普通翘嘴鳜苗种生产方法管理，培育翘嘴鳜多倍体鱼苗。
2、实验结果表明，受精率为32.07%，多倍体得率为80.64%，孵化率为95.9%。
实施例4
1、本实施例对热休克条件进行优化，诱导步骤参照实施例1。
2、结果如表1和表2所示
表1
表2
实施例5
翘嘴鳜多倍体的倍性鉴定：采用美国贝克曼库尔特公司DNA Prep Stain 染液染色，通过流式细胞仪测定细胞DNA含量来鉴定诱导翘嘴鳜的倍性。
以二倍体对照组细胞为参考计算二倍体和三倍体频率，细胞DNA含量以DNA指数（DNAindex，DI）表示。DI=处理组细胞GO/1峰值道数/对照组细胞GO/1峰值道数均值。以DI=1.0±0.1为DNA二倍体的判断标准，如果DI=1.5±0.1，则为三倍体，如果DI=2.0±0.1，则为四倍体，如果DI=2.5±0.1，则为五倍体。
流式细胞仪给出的对照组与多倍体处理组细胞DNA含量荧光分布直方图如附图1～4所示。
Claims (7)
1.一种翘嘴鳜多倍体的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.获取精卵：选取性腺发育成熟的翘嘴鳜雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；
S2.人工受精：将精液与卵子混合，轻轻搅拌使精卵充分混匀后，加入生理盐水激活精子，进行人工受精；
S3.获得多倍体：将受精后2～10min的受精卵转移至39～43℃养殖用水中进行热休克处理1～3min，使染色体组加倍；
S4.将经过热休克处理的受精卵移至养殖用水中孵化，按照普通翘嘴鳜苗种生产方法管理，培育翘嘴鳜多倍体鱼苗。
2. 根据权利要求1所述翘嘴鳜多倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S1所述采集精液和成熟卵子的方法为：
S1.给亲鱼注射催产剂后，放入25～28℃水中，效应时间为22～24h；
S2.提早2 h开始观察，检查亲鱼发情情况，并每隔30 min 检查一次；
S3.当轻压腹部，雌鱼生殖孔中有卵粒流出时，即可进行精卵采集；
S4.采集时，分别用湿毛巾包裹雄鱼和雌鱼，轻压亲鱼腹部，将精、卵挤入干燥洁净的器皿中，精、卵避免阳光直射。
3. 根据权利要求1所述翘嘴鳜多倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S2所述生理盐水的水温为25～27℃。
4. 根据权利要求1所述翘嘴鳜多倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S3是将受精后8min的受精卵转移至39～41℃养殖用水中进行热休克处理1～2min。
5. 根据权利要求4所述翘嘴鳜多倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S3是将受精后8min的受精卵转移至41℃养殖用水中进行热休克处理2min。
6. 根据权利要求1所述翘嘴鳜多倍体的诱导方法，其特征在于，步骤S4所述孵化的温度为25～28℃。
7. 权利要求1所述翘嘴鳜多倍体的诱导方法在翘嘴鳜育种方面的应用。
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