CN109566489A - 一种匙吻鲟育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的一种匙吻鲟育种方法，包括如下步骤：(1)对性腺发育成熟的匙吻鲟雌性亲鱼和雄性亲鱼进行人工催产处理后，得到成熟的卵子和精子；(2)对所述卵子和精子进行人工授精处理，得到匙吻鲟受精卵，将所述受精卵进行短暂恒温热处理，得到染色体加倍的匙吻鲟受精卵；(3)对得到的匙吻鲟受精卵进行孵化处理，得到多倍体匙吻鲟鱼苗。本发明的优点在于，仅通过控制受精卵的培育温度和处理时间就可以培育出染色体加倍的匙吻鲟受精卵，得到三倍体匙吻鲟，且三倍体诱导率达100％，方法简单，无需添加任何生化药物，无污染，食用健康无害。
Description
技术领域
本发明属于水产动物育种技术领域，具体为一种匙吻鲟育种方法。
背景技术
匙吻鲟(Polyodon spathula)属鲟形目、匙吻鲟科、匙吻鲟属,是世界上现存的两种匙吻鲟科鱼类之一,为大型淡水经济鱼类。匙吻鲟原产于美国的密西西比河流域，是一种纯淡水、滤食性鱼类，能常年生活在内陆的江河、湖泊及池塘中。其卵、肉、皮具有极高的经济价值。肉质极为鲜美，肉无肌间刺，尤其是吻部富含胶原蛋白，营养丰富，是酒宴的上等佳肴。其卵加工成鱼子酱，皮是上等制革原料。幼鱼吻似鸭嘴，鳃如“象耳”，全身晶润，泳态特异，为名贵观赏鱼类之一。
匙吻鲟在我国的养殖具有广阔的发展前景，发展潜力巨大。近二十多年来，匙吻鲟已开始在我国各地大规模养殖，养殖面积迅速扩大，但其产量还不能满足国内外市场需要，其原因主要有两个方面，一方面是规模化匙吻鲟苗种繁育技术有待提高；另一方面，缺乏生长速度快、抗病力强的遗传改良的匙吻鲟新品种(品系)。因此，培育出生长快、肉质优、抗逆能力强的新品种，实现匙吻鲟产业的增值增效显得十分必要。
发明内容
为解决现有技术中匙吻鲟产量低的问题，本发明提供了一种匙吻鲟育种方法，实现的目的为得到一种使匙吻鲟生长快、肉质优、抗逆能力强，可批量生产的方法。
为了实现上述目的，本发明提供的一种匙吻鲟育种方法，包括如下步骤：
(1))对性腺发育成熟的匙吻鲟雌性亲鱼和雄性亲鱼进行人工催产处理后，得到发育成熟的卵子和精子；
(2)对所述卵子和精子进行人工授精处理，得到匙吻鲟受精卵，将所述受精卵进行短暂恒温热处理，得到染色体加倍的匙吻鲟受精卵；
(3)对得到匙吻鲟受精卵进行孵化处理，得到多倍体匙吻鲟鱼苗。
进一步的，所述步骤(1)中催产处理包括：对雌性亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物，注射剂量为6～8μg/kg，到达效应时间12-24h后，将成熟卵挤出置于室温条件下待用；
对雄鱼亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物，注射剂量为3～5μg/kg，达到效应时间12-24h后，挤出精液并镜检，将活力良好的精液放于4℃冰箱中待用。
进一步的，所述促黄体素释放激素类似物为LHRH-A2。
进一步的，所述步骤(2)中将经过催产处理的雌性亲鱼捞出，用干净的湿毛巾包住头部，然后向生殖孔方向轻挤鱼腹两侧，将卵子顺利挤出，并迅速向卵中加入精液，用羽毛轻轻搅匀，并加生理盐水活化，进行人工授精，得到受精卵。
进一步的，所述生理盐水的浓度为0.65％，加入量为与受精卵的质量比为1：1～2。
进一步的，所述步骤(2)中将授精处理后16～18min的匙吻鲟受精卵再进行短暂恒温热处理。
进一步的，所述短暂恒温热处理的处理的时间为2～3min，处理温度为36～42℃。
进一步的，所述步骤(3)中孵化处理温度为18～20℃，孵化时间为110～145h。
进一步的，所述步骤(3)中的多倍体匙吻鲟鱼苗为三倍体匙吻鲟鱼苗。由于三倍体鱼类性腺发育受阻，常常表现出不育的性状。相较普通的二倍体鱼类而言，不育的三倍体经济鱼类具有生长速度快且易长成大规格个体、饵料系数低且养殖成本低等优点；另外，三倍体鱼类因其不育，即使流放到江河中也不会污染原生种，造成基因污染。基于三倍体鱼类有上述优势，开展匙吻鲟三倍体育种，培育出生长快、肉质优、抗逆能力强的新品种，实现匙吻鲟产业的增值增效显得十分必要。
进一步的，该方法还包括步骤(4)选择身体良好无伤、体质健壮的所述三倍体匙吻鲟鱼苗，并培养在鱼苗培育池中；
向所述三倍体匙吻鲟鱼苗投喂全价配合浮性饲料，日投饲量为池内匙吻鲟总重量的3～8％；
将所述匙吻鲟鱼苗培育120天即可得到三倍体匙吻鲟幼鱼。
进一步的，所述培育池面积为50m2，水深0.8m，养殖水温在为20℃～23℃，采用微流水养殖。
进一步的，所述得到三倍体匙吻鲟鱼仔的饲料系数为1-1.16。
本发明采用上述技术方案，有益效果包括：1、本发明方法仅通过控制受精卵的培育温度和处理时间就可以培育出染色体加倍的匙吻鲟受精卵，得到三倍体匙吻鲟，且三倍体诱导率达100％，方法简单，无需添加任何生化药物，无污染，食用健康无害。
2、本发明方法得到的三倍体匙吻鲟鱼苗孵化率在100％，成功率高。
3、本发明方法得到的三倍匙吻鲟生长快、品质好、抗病力强，尤其是对饲料的利用率高，对于匙吻鲟苗种的推广及其养殖业的发展具有重要意义。
附图说明
图1为实施例一中三倍体匙吻鲟尾鳍细胞染色体中期分裂相(图1b)和二倍体匙吻鲟尾鳍细胞染色体中期分裂相(图1a)。
图2为实施例一中二倍体(diploid)匙吻鲟血细胞和三倍体(triploid)匙吻鲟血细胞DNA相对含量直方图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例一：本发明提供的一种匙吻鲟育种方法，包括：
1、亲鱼的选择
在每年的3月中旬至5月中旬选择大小合适、体表无伤，身体健壮、性成熟的2～4龄雌、雄匙吻鲟作为亲鱼。
2、卵子的采集
对步骤1选择的性腺发育成熟的雌性亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)作为催产药物，注射剂量为6μg/kg，到达效应时间为24h，放置室温下待用。
3、精子的采集：雄鱼按3μg/kg剂量注射LHRH-A2进行催产。达到效应时间24h后，挤出精液并镜检，将活力良好的精液放于4℃冰箱中待用。
4、授精处理：将雌性亲鱼捞出，用干净的湿毛巾包住头部，然后向生殖孔方向轻挤鱼腹两侧，将卵子顺利挤出，并迅速向卵中加入精液，用羽毛轻轻搅匀，并加生理盐水活化，生理盐水的浓度为0.65％，加入体积比例为与受精卵的体积比为1:2，进行人工授精，得到受精卵，其中，经随机抽样方法测定，其受精率达到75.8％。
5、诱导处理：人工授精后16min，将受精卵置于36℃的精密恒温水浴箱中进行2min的热处理，使第二极体被抑制排出，染色体发生加倍，得到染色体加倍后的受精卵。
6、孵化处理：将染色体加倍后的受精卵转入到18±0.5℃水温中进行孵化，按照普通匙吻鲟苗种生产方法进行管理，孵化145h后，培育得到多倍体的匙吻鲟鱼苗，经测定，得到的多倍体匙吻鲟鱼苗中，三倍体率为100％。
其中，匙吻鲟三倍体倍性鉴定方法如下：
为了验证本申请所得到的三倍体匙吻鲟，将本申请得到的三倍体匙吻鲟与正常二倍体匙吻鲟进行尾鳍细胞染色体计数的比较，具体方法如下：
以人工诱导的匙吻鲟三倍体鱼苗和对照组匙吻鲟鱼苗为对象，待鱼苗长至20-30cm时，各实验组随机取10尾，剪尾鳍进行尾鳍细胞的培养。将传至第2代的尾鳍细胞继续培养24h后更换新鲜培养基，添加终质量浓度为1μg/mL的秋水仙素处理，培养13～15h。吸出培养液，胰酶-EDTA消化分散细胞，离心收集细胞，加入新配制的卡诺氏固定液(V甲醇∶V乙酸＝3∶1)固定15min，高倍显微镜下观察计数尾鳍细胞的染色体数目，并采用Photoshop CS4和Excel统计各个实验组的染色体分布频率。以正常二倍体匙吻鲟尾鳍细胞染色体作对照，观察结果如图1所示。
从图1中可以明显看出，三倍体匙吻鲟尾鳍细胞染色体数目为3n＝180(图1b)，二倍体匙吻鲟尾鳍细胞染色体数目为2n＝120(图1a)，三倍体匙吻鲟尾鳍细胞染色体数目为二倍体匙吻鲟尾鳍细胞染色体数目的1.5倍。
用出膜的鱼苗制成细胞悬液，使用Beckman coulter公司的试剂NIM-DAPI对细胞悬液染色1min后，利用Beckman Coulter公司、型号为Cell Lab QuantaTM SC的流式细胞仪，对染色后的细胞悬液进行DNA含量分析，并采用正常二倍体鱼苗作对照进行检测，根据DNA含量分析结果，对三倍体诱导率进行统计分析，测定结果如图2所示，得到正常二倍体匙吻鲟细胞DNA相对含量为204.0，三倍体匙吻鲟细胞DNA相对含量为306.6，三倍体鱼苗的DNA相对含量是二倍体鱼苗的1.50倍，如图2所示的二倍体匙吻鲟和三倍体匙吻鲟体细胞DNA相对含量直方图，表明利用本申请的方法成功诱导出了三倍体匙吻鲟鱼苗。
匙吻鲟三倍体苗种生长速度和饲料利用率的测定
1、鱼苗选择
选择身体良好无伤、体质健壮的实施例1得到的匙吻鲟三倍体鱼苗及正常二倍体匙吻鲟鱼苗，其中，匙吻鲟三倍体苗种的平均规格为15.8g/尾，共5000尾，正常二倍体匙吻鲟鱼苗平均规格为15.4g/尾，共5000尾，投喂匙吻鲟全价配合浮性饲料饲养。
2、鱼苗的培育
匙吻鲟三倍体鱼苗和正常二倍体匙吻鲟鱼苗分别单独饲养在两个鱼苗培育池中，鱼苗均在水泥培育池中采用行微流水养殖，气泵增氧。鱼种培育池面积为100m2，水深0.8m，养殖水温在为20℃～23℃；鱼种放养密度为50尾/m2；每天投饲3次，即8:00～9:00、12：00～13:00、17:00～18:00各投喂1次。日投饲量为池内匙吻鲟总重量的5％。培育120天即可得到三倍体匙吻鲟幼鱼。
3、培育管理
每隔7天排干池水，彻底清理池底1次，注入新水，每隔30天分别对三倍体鱼苗和二倍体鱼苗随机取样测重，样本量为100尾，测定结果如表1所示。
表1培育过程中鱼苗总体重(kg)
| 投放时 | 第一次 | 第二次 | 第三次 | 第四次 | |
| 三倍体 | 79.0 | 183.5 | 374.9 | 568.3 | 846.1 |
| 二倍体 | 77.0 | 164.3 | 218.4 | 408.4 | 580.5 |
根据表1的数据可以明显看出，利用本申请实施例的方法培育得到的三倍体匙吻鲟鱼苗总重量从投放时的79.0kg增重至846.1kg，增重10.7倍；二倍体匙吻鲟鱼苗总重量从投放时77.0kg增重至580.5kg，增重7.5倍，三倍体匙吻鲟鱼苗的生长速度较二倍体匙吻鲟鱼苗快31.3％，可见本发明培育方法得到三倍体匙吻鲟生长发育较好。
两种鱼种投喂相同的匙吻鲟全价配合浮性饲料，试验期间三倍体匙吻鲟鱼苗池共投喂饲料889.5kg，二倍体匙吻鲟投喂饲料689.8kg，经测算后得到本发明育得的三倍体匙吻鲟鱼苗的饲料系数为1.16；二倍体匙吻鲟的饲料系数为1.37，可以发现三倍体匙吻鲟的饲料利用效率是二倍体匙吻鲟饲料利用效率的1.21倍，可见本发明培育方法得到的三倍体匙吻鲟对饲料的利用率更好。
试验所用鱼种均为体格健壮，无伤病的鱼种，在试验期间没有发病现象，因此本次试验鱼种培育的成活率均很高，三倍体匙吻鲟鱼苗培育成活率达到98.9％，二倍体匙吻鲟培育成活率达到98.7％，无明显的差异。
综上所述，三倍体匙吻鲟无论是在生长速度方面还是饲料利用效率方面均表现出明显优势。可作为一种匙吻鲟新品种进行推广养殖，对于匙吻鲟苗种的推广及其养殖业的发展具有重要意义。
实施例二：本发明提供的一种匙吻鲟育种方法，包括如下步骤：
(1)对性腺发育成熟的匙吻鲟雌性亲鱼和雄性亲鱼进行人工催产处理后，得到发育成熟的卵子和精子；
(2)对所述卵子和精子进行人工授精处理，得到匙吻鲟受精卵，将所述受精卵进行短暂恒温热处理，得到染色体加倍的匙吻鲟受精卵；
(3)对得到的匙吻鲟受精卵进行孵化处理，得到多倍体匙吻鲟鱼苗。
所述步骤(1)中催产处理包括：对雌性亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物，注射剂量为7μg/kg，到达效应时间18h后，将成熟卵挤出置于室温条件下待用；
对雄鱼亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物，注射剂量为3.5μg/kg，达到效应时间18h后，挤出精液并镜检，将活力良好的精液放于4℃冰箱中待用。
所述促黄体素释放激素类似物为LHRH-A2。
所述步骤(2)中将经过催产处理的雌性亲鱼捞出，用干净的湿毛巾包住头部，然后向生殖孔方向轻挤鱼腹两侧，将卵子顺利挤出，并迅速向卵中加入精液，用羽毛轻轻搅匀，并加生理盐水活化，进行人工授精，得到受精卵。
所述生理盐水的浓度为0.65％，加入量为与受精卵的体积比为1：1。
所述步骤(2)中将授精处理后18min的匙吻鲟受精卵再进行短暂恒温热处理。
所述短暂恒温热处理的处理的时间3min，处理温度为42℃。
所述步骤(3)中孵化处理温度为20℃，孵化时间为120h。
所述步骤(3)中的多倍体匙吻鲟鱼苗为三倍体匙吻鲟鱼苗。采用上述实施例一的方法验证得到的多倍体匙吻鲟鱼苗为100％的三倍体匙吻鲟鱼苗。
该方法还包括步骤(4)选择身体良好无伤、体质健壮的所述三倍体匙吻鲟鱼苗，并培养在鱼苗培育池中；
向所述三倍体匙吻鲟鱼苗投喂全价配合浮性饲料，日投饲量为池内匙吻鲟总重量的3％；鱼种放养密度为50尾/m2；每天投饲3次，即8:00～9:00、12：00～13:00、17:00～18:00各投喂1次。将所述匙吻鲟鱼苗培育120天即可得到三倍体匙吻鲟幼鱼。所述培育池面积为50m2，水深0.8m，养殖水温在为20℃～23℃，采用微流水养殖。采用上述实施例一种的方法，测定所述得到三倍体匙吻鲟鱼仔的饲料系数为1。
实施例三：本发明提供的一种匙吻鲟育种方法，包括如下步骤：
(1)对性腺发育成熟的匙吻鲟雌性亲鱼和雄性亲鱼进行催产处理后，得到发育成熟的雌性亲鱼和雄性亲鱼；
(2)对所述雌性亲鱼和雄性亲鱼进行授精处理，得到匙吻鲟受精卵，将所述受精卵进行短暂恒温热处理，得到染色体加倍的匙吻鲟受精卵；
(3)对得到匙吻鲟受精卵进行孵化处理，得到多倍体匙吻鲟鱼苗。
所述步骤(1)中催产处理包括：对雌性亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物，注射剂量为8μg/kg，到达效应时间12h后，将成熟卵挤出置于室温条件下待用；
对雄鱼亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物，注射剂量为5μg/kg，达到效应时间12h后，挤出精液并镜检，将活力良好的精液放于4℃冰箱中待用。
所述促黄体素释放激素类似物为LHRH-A2。
所述步骤(2)中将经过催产处理的雌性亲鱼捞出，用干净的湿毛巾包住头部，然后向生殖孔方向轻挤鱼腹两侧，将卵子顺利挤出，并迅速向卵中加入精液，用羽毛轻轻搅匀，并加生理盐水活化，进行人工授精，得到受精卵。
所述生理盐水的浓度为0.65％，加入量为与受精卵的体积比为1：1。
所述步骤(2)中将授精处理后17min的匙吻鲟受精卵再进行短暂恒温热处理。
所述短暂恒温热处理的处理的时间为2min，处理温度为38℃。
所述步骤(3)中孵化处理温度为20℃，孵化时间为110h。
所述步骤(3)中的多倍体匙吻鲟鱼苗为三倍体匙吻鲟鱼苗。采用上述实施例一的方法验证得到的多倍体匙吻鲟鱼苗为100％的三倍体匙吻鲟鱼苗。
该方法还包括步骤(4)选择身体良好无伤、体质健壮的所述三倍体匙吻鲟鱼苗，并培养在鱼苗培育池中；
向所述三倍体匙吻鲟鱼苗投喂全价配合浮性饲料，日投饲量为池内匙吻鲟总重量的8％；鱼种放养密度为50尾/m2；每天投饲3次，即8:00～9:00、12：00～13:00、17:00～18:00各投喂1次。将所述匙吻鲟鱼苗培育120天即可得到三倍体匙吻鲟幼鱼。所述培育池面积为50m2，水深0.8m，养殖水温在20℃～23℃，采用微流水养殖。采用上述实施例一种的方法，测定所述得到三倍体匙吻鲟鱼仔的饲料系数为1.6。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种匙吻鲟育种方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)对性腺发育成熟的匙吻鲟雌性亲鱼和雄性亲鱼进行人工催产处理后，得到发育成熟的卵子和精子；
(2)对所述卵子和精子进行人工授精处理，得到匙吻鲟受精卵，将所述受精卵进行短暂恒温热处理，得到染色体加倍的匙吻鲟受精卵；
(3)对得到的匙吻鲟受精卵进行孵化处理，得到多倍体匙吻鲟鱼苗。
2.根据权利要求1所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，所述步骤(1)中催产处理包括：对雌性亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物，注射剂量为6～8μg/kg，到达效应时间12-24h后，将成熟卵挤出置于室温条件下待用；
对雄鱼亲鱼一次注射促黄体素释放激素类似物，注射剂量为3～5μg/kg，达到效应时间12-24h后，挤出精液并镜检，将活力良好的精液放于4℃冰箱中待用。
3.根据权利要求2所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，所述促黄体素释放激素类似物为LHRH-A2。
4.权利要求1所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，所述步骤(2)中将经过催产处理的雌性亲鱼捞出，用干净的湿毛巾包住头部，然后向生殖孔方向轻挤鱼腹两侧，将卵子顺利挤出，并迅速向卵中加入精液，用羽毛轻轻搅匀，并加生理盐水活化，进行人工授精，得到受精卵。
5.根据权利要求4所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，所述生理盐水的浓度为0.65％，加入量为与受精卵的体积比为1：1～2。
6.权利要求1所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，所述步骤(2)中将授精处理后16～18min的匙吻鲟受精卵再进行短暂恒温热处理。
7.权利要求1所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，所述短暂恒温热处理的处理的时间为2～3min，处理温度为36～42℃。
8.权利要求1所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，所述步骤(3)中孵化处理温度为18～20℃，孵化时间为110～145h。
9.权利要求1所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，所述步骤(3)中的多倍体匙吻鲟鱼苗为三倍体匙吻鲟鱼苗。
10.根据权利要求1所述的匙吻鲟育种方法，其特征在于，该方法还包括步骤(4)选择身体良好无伤、体质健壮的所述三倍体匙吻鲟鱼苗，并培养在鱼苗培育池中；
向所述三倍体匙吻鲟鱼苗投喂全价配合浮性饲料，日投饲量为池内匙吻鲟总重量的3～8％；
将所述匙吻鲟鱼苗培育120天即可得到三倍体匙吻鲟幼鱼；
所述培育池面积为50m2，水深0.8m，养殖水温在为20℃～23℃，采用微流水养殖；
所述得到三倍体匙吻鲟鱼仔的饲料系数为1-1.16。
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