CN107810888A - 一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法,包括受精后15‑20min,将受精卵放入17‑20℃水浴中过渡1min;然后放入26℃水浴中热处理10‑20min;再置于6‑10℃孵化水温的容器中进行孵化。采用本发明方法30天左右得到细鳞鲑三倍体仔鱼。孵化期间受精卵发眼率为80%以上,孵化率达到90%以上,得到的仔鱼经流式细胞仪检测,三倍体率达到100%。本发明提供的细鳞鲑三倍体苗种制备方法,缓解了由于亲鱼繁殖后死亡率高、幼鱼生长速度慢、抗病力低、稚鱼开口驯化成活率低等问题,具有成本低,易操作等优点,具有较好的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法。
背景技术
鲑鳟鱼是世界目前主要养殖的鱼类之一,由于其自身的品质和对生活环境的特殊要求,决定了它绿色、环保营养食品的性质,因此颇受消费者的青睐。据FAO统计资料,近年来全球鲑鳟鱼养殖年产量超过200万t,排在鲤科鱼类和罗非鱼之后,是世界第三大主要养殖鱼类(纪锋等.水产学杂志,2012,25(3):63-68)。鲑鳟鱼是我国目前主要的冷水性养殖鱼类,随着我国鲑鳟鱼养殖的迅速发展,基础理论研究相对滞后、亲鱼种质退化导致苗种质量退化、生产效益下降等问题逐渐突出,从而制约了鲑鳟鱼养殖业的可持续发展(孙大江等.水产学杂志,2010,23(2):56-63)。我国目前仍需要大量进口鲑鳟鱼,进口量超过同期国内鲑鳟鱼年度养殖产量2倍以上(农业部渔业渔政管理局.中国渔业统计年鉴.2016)。利用现代生物技术,培育生长迅速、个体大、肉质好、抗病能力强的种苗,成为我国鲑鳟鱼养殖业的持续、稳定、健康发展的必由之路。
鱼类染色体组操作是遗传育种工作的重点研究领域之一。在多倍体鱼中,三倍体鱼因染色体组成不平衡,性腺不能发育成熟,避免了性腺发育时期生长停滞和鱼肉质量下降等不利影响,对控制过度繁殖、增加生长速率、延长成熟鱼的寿命以及提高养殖产量和鱼肉质量具有重要的意义。自上世纪80年代以来,国内外三倍体鱼的人工诱导工作取得了长足进展,已获得60多种三倍体鱼。我国三倍体的异育银鲫、湘云鲫已进入实用化生产阶段,在鲑鳟鱼方面尚不能达到规模化生产程度,年度进口鲑鳟鱼发眼卵约3000万粒以上,占据虹鳟全雌三倍体发眼卵市场的几乎全部份额(农业部渔业渔政管理局.中国渔业统计年鉴.2016)。国产鲑科鱼类的三倍体育种生产还是空白。
细鳞鲑(Brachymystax lenok)是我国名贵的鲑科冷水性鱼类,常见个体1kg左右,具有重要的经济价值,由于幼鱼生长速度较慢,繁殖后亲鱼死亡率较高等因素影响了规模化生产。三倍体鱼可有效解决上述问题。温度休克法是成本最低、技术最易掌握的鱼类三倍体育种方法。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法。
本发明采用如下技术方案:
一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法,包括:受精后15-20min,将受精卵放入17-20℃(优选17℃)水浴中过渡1min;然后放入26℃水浴中热处理10-20min;再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
进一步地,上述细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法,包括:受精后15-20min,将受精卵放入17℃水浴中过渡1min;然后放入26℃水浴中热处理20min;再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
较佳地,上述细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法,包括:受精后20min,将受精卵放入17℃水浴中过渡1min;然后放入26℃水浴中热处理20min;再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
进一步地,将性腺发育成熟的亲鱼经注射催产剂催产,采用干法受精,获得受精卵。
所述催产剂可用促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮混合使用。
进一步地,受精卵孵化可采用虹鳟常规孵化方法。
进一步地,将热处理后的受精卵置于6-10℃孵化水温的容器中2-4h内,检出死卵,再进入正常孵化。
进一步地,受精卵发眼前用孵化桶孵化,发眼后移入到平列槽。
进一步地,受精卵孵化期控制水温8-10℃,溶解氧>5mg/L;和/或,整个孵化期积温需要260-280度·日。
具体地,上述细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法,包括如下步骤:
1)采卵与受精:
将性腺发育成熟的亲鱼经注射催产剂催产,干法受精获得受精卵;
亲鱼年龄:雌亲鱼4+龄以上,雄亲鱼3+龄以上;最小规格:雄亲鱼500g以上,雌亲鱼750g以上;催产剂为促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮;受精时雌雄亲鱼尾数配比接近1:1;采卵水温6-8℃;精卵用羽毛搅拌15-20s使精卵混合均匀,加入少量清水缓慢搅拌1min,再用清水冲洗2-3遍,洗去过多精液、卵皮、血块,加入清水放置,待卵吸水膨胀;
2)热休克诱导:
受精后15-20min,将受精卵放入不锈钢漏网(例如直径15cm)中,先在17-20℃水浴锅中过渡1min;然后再放入26℃的电子恒温水槽中,轻轻上下晃动漏网,使受精卵尽快与周围水温相一致;热处理10-20min后将受精卵直接放入6-8℃孵化水温的容器中,2-4h内检出死卵,进入正常孵化;
3)受精卵孵化:
采用虹鳟常规孵化方法;受精卵发眼前用孵化桶孵化,发眼后移入到平列槽;孵化期控制水温8-10℃,溶解氧>5mg/L;整个孵化期积温需要260-280度·日。
采用本发明方法,一般30天左右即可得到细鳞鲑三倍体仔鱼。孵化期间受精卵发眼率为80%以上,孵化率达到90%以上,得到的仔鱼经流式细胞仪检测,三倍体率达到100%。
如无特殊说明,本发明倍性检测采用Pactec CyFlow Cube8型流式细胞仪检测鱼苗血液DNA相对含量的方法确定三倍体率。鱼苗培育至5cm左右,试验组每组随机采样25-30尾,断尾抽血,每次检测3尾二倍体鱼苗作为对照。
有益效果:
1)本发明方法所用雌亲鱼4+龄以上,雄亲鱼3+龄以上,经流水刺激、药物催产,采卵水温6℃以上,催产率可达90%以上。
2)掌握采卵时机,防止卵过熟,雌雄亲鱼尾数配比接近1:1,受精率可达95%以上。
3)受精卵热休克处理前,在17-20℃水中过渡1min,可减少温差过大对卵的刺激,2-4h死亡率控制在10%以下。受精后15-20min,热处理10-20min,三倍体率可达100%。
4)孵化期用蓄水箱调节水温在8-10℃,避免水温浮动过大,定期用药物消毒,控制水霉菌滋生,孵化率可达90%以上。
实验结果表明,采用本发明方法,受精卵2-4h死亡率4.71-8.31%,发眼率78.18-92.62%,孵化率82.59-90.74%,三倍体率68.56-100%。
本发明提供的细鳞鲑三倍体苗种制备方法,缓解了由于亲鱼繁殖后死亡率高、幼鱼生长速度慢、抗病力低、稚鱼开口驯化成活率低等问题,具有成本低,易操作等优点,具有较好的市场价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用水浴锅和电子恒温水槽控制温度范围5-99℃,误差≦0.5℃,灵敏度0.1℃。
催产剂为宁波激素总厂生产的促黄体素释放激素类似物(LHRH-A2)和马来酸地欧酮(DOM)。
实施例1
一种细鳞鲑三倍体苗种的制备方法,具体包括如下步骤:
1)采卵与受精:挑选4+龄以上,体质健壮,发育良好的亲鱼,雄亲鱼规格500g以上,雌亲鱼规格750g以上。雌鱼使用催产剂剂量为每千克鱼2.5ugLHRH-A2+2.5mgDOM,雄鱼减半,雌雄配比为1:1,干法受精。采卵水温6-8℃。精卵用羽毛搅拌15-20s使精卵混合均匀,加入少量清水缓慢搅拌1min,再用清水冲洗2-3遍,洗去过多精液、卵皮、血块,加入清水放置,待卵吸水膨胀。
2)热休克诱导:受精后15-20min,将受精卵放入直径15cm的不锈钢漏网中,先在水温17℃的水浴锅中过渡1min,再放入24-28℃的水槽中进行热处理,轻轻上下晃动漏网,使受精卵尽快与周围水温相一致。热处理10-20min后将受精卵取出直接放入6-8℃孵化水温的容器中,2-4h内检出死卵,计数,进入正常孵化。
3)受精卵孵化:在室内进行,要求光线昏暗,避免震动。受精卵发眼前用孵化桶孵化,发眼后移入到平列槽。发眼后随机取样300粒卵,胚体有明显黑色眼点为发眼卵,检出未发眼卵、白卵,计算发眼率。出膜期,统计检出死卵数,计算孵化率。孵化期水温8-10℃,溶解氧>5mg/L,整个孵化期积温需要260-280度·日。
4)倍性检测:采用Pactec CyFlow Cube8型流式细胞仪检测鱼苗血液DNA相对含量的方法确定三倍体率。鱼苗培育至5cm左右,试验组每组随机采样25-30尾,断尾抽血,每次检测3尾二倍体鱼苗作为对照。
仅仅改变步骤2)受精卵热休克诱导起始处理时间、热处理温度及持续处理时间,设置6组实验,各组步骤2)处理方法及相关实验结果如下:
1)受精后20min,24℃处理20min,4h死亡率(12.57±0.24)%,发眼率(84.19±0.21)%,孵化率(85.56±1.15)%,三倍体率48.25%;
2)受精后15min,26℃处理10min,4h死亡率(4.71±0.15)%,发眼率(78.18±0.23)%,孵化率(88.31±0.71)%,三倍体率68.53%;
3)受精后15min,26℃处理20min,4h死亡率(5.98±0.20)%,发眼率(89.73±0.37)89.72%,孵化率(82.59±0.39)%,三倍体率90.06%;
4)受精后20min,26℃处理10min,4h死亡率(4.85±0.02)%,发眼率(85.83±0.16)%,孵化率(88.33±0.79)%,三倍体率74.17%;
5)受精后20min,26℃处理20min,4h死亡率(8.31±0.64)%,发眼率(92.62±0.74)%,孵化率(90.74±0.03)%,三倍体率100%;
6)受精后20min,28℃处理20min,4h死亡率(21.76±0.12)%,发眼率(79.22±0.30)%,孵化率(25.63±0.17)%,三倍体率57.62%。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种细鳞鲑三倍体苗种的育苗方法,其特征在于,包括:受精后15-20min,将受精卵放入17-20℃水浴中过渡1min;然后放入26℃水浴中热处理10-20min;再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
2.根据权利要求1所述的育苗方法,其特征在于,包括:受精后15-20min,将受精卵放入17℃水浴中过渡1min;然后放入26℃水浴中热处理20min;再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
3.根据权利要求1所述的育苗方法,其特征在于,受精后20min,将受精卵放入17℃水浴中过渡1min;然后放入26℃水浴中热处理20min;再置于6-10℃孵化水温的容器中进行孵化。
4.根据权利要求1-3任一项所述的育苗方法,其特征在于,受精卵孵化期控制水温8-10℃,溶解氧>5mg/L;和/或,整个孵化期积温需要260-280度·日。
5.根据权利要求1-4任一项所述的育苗方法,其特征在于,所用雌亲鱼4+龄以上,雄亲鱼3+龄以上;和/或,所用雄亲鱼500g以上,雌亲鱼750g以上。
6.根据权利要求1-5任一项所述的育苗方法,其特征在于,将性腺发育成熟的亲鱼经注射催产剂催产,采用干法受精,获得受精卵;
优选地,所述催产剂为促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮。
7.根据权利要求1-6任一项所述的育苗方法,其特征在于,受精时雌雄亲鱼尾数配比接近1:1;和/或,采卵水温6-8℃。
8.根据权利要求1-7任一项所述的育苗方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)采卵与受精:
将性腺发育成熟的亲鱼经注射催产剂催产,干法受精获得受精卵;
亲鱼年龄:雌亲鱼4+龄以上,雄亲鱼3+龄以上;最小规格:雄亲鱼500g以上,雌亲鱼750g以上;催产剂为促黄体素释放激素类似物和马来酸地欧酮;受精时雌雄亲鱼尾数配比接近1:1;采卵水温6-8℃;精卵用羽毛搅拌15-20s使精卵混合均匀,加入少量清水缓慢搅拌1min,再用清水冲洗2-3遍,洗去过多精液、卵皮、血块,加入清水放置,待卵吸水膨胀;
2)热休克诱导:
受精后15-20min,将受精卵放入不锈钢漏网中,先在17-20℃水浴锅中过渡1min;然后再放入26℃的电子恒温水槽中,轻轻上下晃动漏网,使受精卵尽快与周围水温相一致;热处理10-20min后将受精卵直接放入6-8℃孵化水温的容器中,处理后2-4h内检出死卵,进入正常孵化;
3)受精卵孵化:
采用虹鳟常规孵化方法;受精卵发眼前用孵化桶孵化,发眼后移入到平列槽;孵化期控制水温8-10℃,溶解氧>5mg/L;整个孵化期积温需要260-280度·日。
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