CN103563805B - 一种翘嘴鲌雌核发育诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种翘嘴鲌雌核发育诱导方法，包括如下步骤：（1）采集鲤鱼精液；（2）对鲤鱼精液进行紫外线遗传灭活处理；（3）采集翘嘴鲌成熟卵子，用经过紫外线遗传灭活处理后的鲤鱼精液进行干法授精；（4）受精卵进行冷休克处理后放入孵化容器中进行孵化，正常成活的鱼苗为雌核发育鱼。本发明采用普通鲤鱼的紫外线遗传灭活精子刺激翘嘴鲌卵子，通过冷休克抑制卵子第二极体释放促使染色体加倍的方法，成功获得翘嘴鲌雌核发育个体。由于正常存活个体即为雌核发育鱼，不需要再进行后续的染色体、遗传标记等鉴定分析，显著简化了鉴定程序。

Description

一种翘嘴鲌雌核发育诱导方法

技术领域

本发明涉及鱼类生物技术，尤其涉及一种翘嘴鲌雌核发育诱导方法。

背景技术

翘嘴鲌（Culter alburnus Basilewsky）是我国重要的淡水经济鱼类之一。目前，养殖用翘嘴鲌大部分仍停留在利用天然亲鱼或多代选留的养殖种，不仅其养殖性状未被挖掘，而且由于亲本选择不当、近亲繁殖等原因，养殖性状已出现生长缓慢、肉质品质下降等不同程度的种质衰退现象。人工雌核发育诱导是鱼类快速固定母本性状和进行性别控制的重要技术手段，可加快鱼类尤其是世代周期较长鱼类的育种进程和效率。已有研究表明，经过一次人工雌核发育诱导约相当于14世代全同胞交配选育，多数鱼类经过连续两次雌核发育就可以作为品系（种）亲本用于育种生产。然而，鱼类雌核发育诱导方法常因种类和选用的刺激源不同而有所差异。选择遗传距离较远且杂交不育的鱼类精子作为激活源，不仅可获得大量雌核发育鱼，而且子代易于鉴别，是一种良好的雌核发育诱导方法。前期，我们开展了鲤鱼与翘嘴鲌的杂交试验，结果表明，鲤鱼精子能激活翘嘴鲌卵子发育，但因染色体数目不匹配等原因，孵化出膜仔鱼多数畸形且出膜不久后死亡，显示鲤鱼可以作为翘嘴鲌雌核发育诱导的激活源。目前，有关翘嘴鲌雌核发育诱导仍未见报道。为此，我们选择鲤鱼精子作为激活，经紫外线灭火精子遗传物质，冷休克抑制卵子第二极体释放，成功建立了翘嘴鲌异源雌核诱导方法，并获得了大量第一代雌核发育鱼和多个第二代雌核发育鱼家系，为后续翘嘴鲌选育及全雌育种提供了重要的技术支撑。

发明内容

本发明目的在于提供一种翘嘴鲌雌核发育诱导方法，选取鲤鱼精子作为激活源，经紫外线遗传灭活，进而冷休克处理抑制卵子第二极体释放，不仅获得了大批量翘嘴鲌雌核发育鱼，而且还极大的简化雌核发育鱼的鉴定工作。

本发明的技术方案为：一种翘嘴鲌雌核发育诱导方法，包括如下步骤：

（1）采集鲤鱼精液；

（2）对鲤鱼精液进行紫外线遗传灭活处理；

（3）采集翘嘴鲌成熟卵子，用经过紫外线遗传灭活处理后的鲤鱼精液进行干法授精；

（4）受精卵进行冷休克处理后放入孵化容器中进行孵化，正常成活的鱼苗即为雌核发育鱼。

受精卵于授精后1-6min内进行10-35min的冷休克处理。

受精卵在2-4℃的温度下进行冷休克处理。

所述受精卵授精后4分钟进行冷休克处理。

所述受精卵进行冷休克处理的最佳时间为15分钟。

鲤鱼精子在进行紫外线遗传灭活处理时，处理到60-70%的鲤鱼精子仍具有活力后停止紫外线处理，将处理后的鲤鱼精子保存用于第（3）步的授精。

鲤鱼精子的紫外线遗传灭活处理方法为：

A、用Hank’s氏液按体积比1:5 稀释鲤鱼精子，将稀释后的鲤鱼精子均匀涂在4℃预冷的培养皿中；

B、用紫外线灯对培养皿上的精液进行照射，照射过程中缓慢摇动培养皿使照射均匀；

C、每隔2-4min观察精子活力，当60-70%的鲤鱼精子具有活力时停止照射。

紫外线遗传灭活处理后的精液保存于4℃的遮光容器中。

用于采集鲤鱼精液的雄鲤鱼亲本为2-3龄，体重0.5 kg以上的健康雄鲤鱼。

用于采集翘嘴鲌卵子的翘嘴鲌雌鱼亲本按以下方式进行强化培育：

a、将体重1.0kg以上的翘嘴鲌进行专池培育，雌雄比2:1；

b、培育初期投喂膨化配合饲料，后期增投鲜活饵料（野生小杂鱼）；

c、繁殖季节时，挑选雌雄翘嘴鲌亲本，人工催产后放入催产池中，流水刺激，雌雄比1:2。

有益效果：

1. 本发明具有较强的可操作性。本发明采用普通鲤鱼的紫外线遗传灭活精子刺激翘嘴鲌卵子，通过冷休克抑制卵子第二极体释放促使染色体加倍的方法，成功获得翘嘴鲌雌核发育个体。雌核发育二倍体仔鱼的孵化率和成活率较高。

本发明获得雌核发育鱼苗易于鉴别。正常存活个体即为雌核发育鱼，不需要再进行后续的染色体、遗传标记等鉴定分析，显著简化了鉴定程序。

附图说明

图1是采用本发明获得的翘嘴鲌雌核发育鱼的初孵仔鱼实体图；

图2是采用本发明获得的翘嘴鲌雌核发育鱼的1冬龄鱼种实体图；

图3是采用本发明获得的翘嘴鲌雌核发育鱼的染色体图

图4是引物HLJHB01在雌核发育群体中的扩增图谱；

图5是引物S129在3个群体中的扩增图谱；

图6是鲤鱼精子与翘嘴鲌卵子杂交获得的畸形胚胎图；

图7是紫外线遗传灭活后的鲤鱼精子与翘嘴鲌卵子授精获得的单倍体胚胎图。

具体实施方式

本发明的翘嘴鲌雌核发育诱导方法具体如下：

涉及亲本强化培育、人工催产、精子遗传物质失活、受精卵染色体加倍等关节环节，具体技术过程及参数如下：

1. 强化培育。获得性腺发育良好的翘嘴鲌和鲤鱼亲本是该项技术发明能否成功的首要条件。12月至翌年1月，从湖泊或池塘中选留3龄以上，无病无伤，体重1.0kg以上的翘嘴鲌良种进行专池培育，雌雄比2:1。培育期间，初期投喂优质膨化配合饲料，后期增投一些鲜活饵料，比如鲜活小杂鱼以及小规格的鲫、鳊鱼苗等，以保证亲鱼的营养需求。雄鲤鱼亲本要求2-3龄，体重0.5 kg以上，体质健壮且鳞、鳍完整无病无伤，多套养于团头鲂等鱼类的亲本培育池内。

人工催产。繁殖季节，水温达到 25℃以上时，挑选性成熟雌雄翘嘴鲌亲本，要求雌鱼卵巢轮廓明显、体侧鳞片排列疏松、触摸腹壁有丰满和松软的感觉。注射方法一般采用胸腔一次注射，雌鱼注射量为(LRH-A2 50μg+HCG 1200IU)/kg，雄鱼注射量减半。注射药物的亲鱼放入催产池中，流水刺激，雌雄比1:2。对于鲤鱼而言，若轻压腹部有乳白色稠状精液流出，并能很快在水中散开，可不用注射催产药物，直接采集精液。若挑选的鲤鱼精液量少，可参考翘嘴鲌激素剂量腹腔注射1次，并进行流水刺激。

紫外线处理。根据紫外线使DNA失活的原理和适宜照射剂量不影响精子入卵能力的特点，参考已有文献，自制紫外线处理装置1套，主要包括两支15W的紫外灯和摇床一台，通过精子稀释度、精子活力等情况的实时观察，具体确定每次精子遗传失活的照射时间。紫外线处理的具体方法为：1）精子的稀释。人工挤取的鲤鱼精液用Hank’s氏液按体积比1:5 稀释，之后均匀涂在4℃预冷的培养皿中,精液厚度控制在1mm以内,并保存于盛有碎冰块的容器上。2）精子遗传物质的失活。保持培养皿精液面与灯管的距离为13-14cm, 照射时间控制在30-50min。照射过程中用摇床不停地缓慢摇动培养皿，以使精子被均匀照射,且每隔一段时间手工摇动几次。当快达到适宜的照射剂量时,每隔2-4min在显微镜下观察精子活力以决定照射的时间长度。当60-70%的鲤鱼精子仍具有活力时，停止照射，完成紫外线灭活处理。处理过的精液保存于4℃的遮光容器中备用。

染色体加倍。影响卵子染色体加倍的主要因素有处理温度、起始时间和处理持续时间。因野外条件下，对水温梯度的控制比较难，但在一定环境条件下，冰水混合物能维持较长一段时间的温度稳定，故选择处理温度范围控制在2-4℃。

（1）处理起始时间。翘嘴鲌亲鱼发情时，亲鱼水面形成波纹，雌、雄鱼有时翻腾水面，急速追逐，这时分别起网捕鱼，采集翘嘴鲌成熟卵子，用事先准备好的遗传灭活的鲤鱼精子进行干法授精，并分别于授精后1、2、3、4、5和6min处理受精卵，水温2-4℃左右，持续处理时间14min，通过胚胎孵化率、成活率及畸形率的比较，结果表明，受精卵于授精后1-6min进行冷休克处理14分钟，均可获得雌核发育鱼苗，但以冷休克处理4min最为适宜，孵化率和成活率分别达15.7％和10.7％。

（2）处理持续时间。授精后4min分别处理10、15、20、25、30和35min，水温控制2-4℃左右，通过胚胎孵化率、成活率及畸形率的比较，结果表明，冷休克持续处理10-35min均有效，但以冷休克处理15min为最佳，孵化率和成活率分别达15.4％和13.7％。

（3）经过多次试验，受精卵在授精后1-6min进行冷休克（2-4℃）处理10-35min都均可以获得雌核发育鱼。但研究认为翘嘴鲌受精卵最适宜的冷休克染色体加倍条件为授精后4min进行冷休克（2-4℃）处理15min。

苗种培育。上述处理后的受精卵在孵化缸内常温( 25-28℃)下流水孵化，以鱼卵不沉积为度，直至鱼苗孵出。孵化获得的体型正常、能主动摄食的鱼苗即为诱导的翘嘴鲌雌核发育鱼，如图1和图2所示，图2中的翘嘴鲌雌核发育鱼为1冬龄鱼种，如图所示，其发育良好，体积大小可参考上方5毛钱的大小。当鱼苗“腰点”出现时，移至池塘中进行夏花培育。

雌核发育鱼鉴定。将体型正常、能主动摄食的鱼苗进行染色体分析（植物血球凝集素体内注射制备鱼类肾细胞染色体法），其染色体数为48对，如图3所示，与母本染色体数一致，证明其为二倍体；然后再用微卫星标记和RAPD标记进行检测，未发现来自父本鲤鱼的遗传物质，子代遗传物质均来自母本，且遗传同质性显著提高，证明得到的后代为雌核发育鱼。如图4和5所示。图4为微卫星引物（F: AATATAGGCAGAGATGACTTCAGAC，R: TTGAAAAGTGGGGACATGG）在翘嘴鲌雌核发育一代（meio-G1）、雌核发育二代（meio-G2）及翘嘴鲌太湖野生群体（control ）之间的扩增结果；图5中的A表示引物S129（CCAAGCTTCC）在标号为meio-G1雌核发育群体中的扩增图谱；B表示引物S129在标号为meio-G2雌核发育群体中的扩增图谱；C表示引物S129在翘嘴鲌太湖野生群体中的扩增图谱，图中F为父本；M为D15000+2000 DNA marker。

对比分析。正常鲤鱼精子与正常翘嘴鲌卵子杂交，获得胚胎均为畸形，如图6所示，孵化后1-2天全部死亡。紫外线处理过的鲤鱼精子与翘嘴鲌卵子进行授精，获得的胚胎表现出明显的单倍体综合症，如图7所示。而采用本发明的方法，将紫外线遗传灭活处理后的鲤鱼精子和翘嘴鲌卵子进行授精，并进行过冷休克加倍处理，孵化出膜的子代存活且形态与亲本一致，如图1和图2所示。本发明获得正常存活个体经过上述的鉴定可以确定为雌核发育鱼，因此，在实际饲养中，只要正常存活个体就可以确认为雌核发育鱼，不再需要进行后续的染色体、遗传标记等鉴定分析（即上述的鉴定），显著简化了鉴定程序，减少了饲养成本。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，便于该技术领域的技术人员能理解和应用本发明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种翘嘴鲌雌核发育诱导方法，包括如下步骤：

（1）采集鲤鱼精液；

（2）对鲤鱼精液进行紫外线遗传灭活处理；

（3）采集翘嘴鲌成熟卵子，用经过紫外线遗传灭活处理后的鲤鱼精液进行干法授精；

（4）受精卵进行冷休克处理后放入孵化容器中进行孵化，正常成活的鱼苗为雌核发育鱼。

2.如权利要求1所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，受精卵于授精后1-6min 内进行10-35min的冷休克处理。

3.如权利要求1所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，受精卵在2-4℃的温度下进行冷休克处理。

4.如权利要求2所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，所述受精卵授精后4分钟进行冷休克处理。

5.如权利要求2所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，所述受精卵进行冷休克处理的最佳时间为15分钟。

6.如权利要求1所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，鲤鱼精子在进行紫外线遗传灭活处理时，处理到60-70%的鲤鱼精子仍具有活力后停止紫外线处理，将处理后的鲤鱼精子保存用于第（3）步的授精。

7.如权利要求6所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，鲤鱼精子的紫外线遗传灭活处理方法为：

A、用Hank’s氏液按体积比1:5 稀释鲤鱼精子，将稀释后的鲤鱼精子均匀涂在4℃预冷的培养皿中；

B、用紫外线灯对培养皿上的精液进行照射，照射过程中缓慢摇动培养皿使照射均匀；

C、每隔2-4min观察精子活力，当60-70%的鲤鱼精子具有活力时停止照射。

8.如权利要求6所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，紫外线遗传灭活处理后的精液保存于4℃的遮光容器中。

9.如权利要求1所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，用于采集鲤鱼精液的雄鲤鱼亲本为2-3龄，体重0.5 kg以上的健康雄鲤鱼。

10.如权利要求1所述的翘嘴鲌雌核发育诱导方法，其特征在于，用于采集翘嘴鲌卵子的翘嘴鲌雌鱼亲本按以下方式进行强化培育：

a、将体重1.0kg以上的翘嘴鲌进行专池培育，雌雄比2:1；

b、培育初期投喂膨化配合饲料，后期增投鲜活饵料；

c、繁殖季节时，挑选雌雄翘嘴鲌亲本，人工催产后放入催产池中，流水刺激，雌雄比1:2。