CN101341859B - 团头鲂与黄尾密鲴间远缘杂交的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种团头鲂与黄尾密鲴间远缘杂交的方法，该方法是以二倍体团头鲂(或黄尾密鲴)为母本亲鱼，二倍体黄尾密鲴(或团头鲂)为父本亲鱼，通过对父母本亲鱼进行人工干法受精，将受精卵进行孵化，孵化出的鱼苗进行饲养，进而得到团头鲂与黄尾密鲴的杂交品种。本发明的方法不仅提高了远缘杂交的受精率和孵化率，而且获得的新品种鱼具有体形美观、肉质细嫩、抗逆性强等优点，对今后的鱼类遗传育种及生物进化学的研究具有重要意义。

Description

团头鲂与黄尾密鲴间远缘杂交的方法
技术领域
本发明涉及鱼类的杂交方法，尤其涉及鲤科鱼类中鲌亚科与鲴亚科间的远缘杂交方法。
背景技术
远缘杂交是指种间或种间以上的物种个体间的杂交。目前，远缘杂交技术已成为一种重要的鱼类遗传育种和性状改良方法。远缘杂交它可以把整套外源基因组转入卵子中，从而改变杂交后代基因的表达调控以及相互作用方式，使得后代可能在生活力、生长势、抗逆性、产量、品质等方面表现出杂种优势，但远缘杂交也容易出现杂交后代不能存活或存活率较低的问题。团头鲂(Megalobrama amblycephala)属于鲤科、鲌亚科中的二倍体鱼(2n＝48)，具有体高、生长速度快等优点，黄尾密鲴(Xenocypris　daviodi Bleeker)属于鲤科、鲴亚科中的二倍体鱼(2n＝48)，具有肉质细嫩、含肉量高等优点，这两种鱼在分类、体形等生物学特性方面存在较大差异，因此这二者间的远缘杂交存在较大困难，至今也尚无鲤科鱼类中鲌亚科与鲴亚科间远缘杂交成功的报道。如何利用远缘杂交技术实现鲌亚科鱼类与鲴亚科鱼类之间的成功杂交，并获得性状优良的新型杂交鱼类就成为本领域具有重要意义的研究方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种受精率和孵化率高、所获杂交鱼品种优良的团头鲂与黄尾密鲴间远缘杂交的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种团头鲂与黄尾密鲴间远缘杂交的方法，其特征在于：以团头鲂为母本亲鱼、黄尾密鲴为父本亲鱼，或者以黄尾密鲴为母本亲鱼、团头鲂为父本亲鱼，对所述父母本亲鱼进行人工干法受精，并将受精卵进行孵化，再对孵化出的鱼苗进行饲养，进而得到团头鲂与黄尾密鲴的杂交品种。
具体来说，上述远缘杂交的方法可按下述操作进行：
1、催产：在繁殖季节，选取性状优良、两龄以上的雌性团头鲂或雌性黄尾密鲴，注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合液催产，其中HCG的用量为600～800IU/kg、LRH-A的用量为20～30μg/kg，均采用胸鳍基部凹陷无鳞处倾斜45°胸腔注射；再选择雄性团头鲂或雄性黄尾密鲴，对其注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液，混合液注射剂量减半，注射方法同雌性亲鱼；注射时，一次性注射或分两次注射均可，一般分两次注射；
2、授精：将父母本亲鱼放入同一产卵池，当雌性亲鱼开始产卵时，把成熟的雌性团头鲂(雌性黄尾密鲴)选出，同时选出相应的雄性黄尾密鲴(雄性团头鲂)，并采用人工干法授精；
3、孵化：将团头鲂(♀)×黄尾密鲴
Figure G2008100321971D00021
(后代可简称“鲂鲴”)或黄尾密鲴(♀)×团头鲂
Figure G2008100321971D00022
(后代可简称“鲴鲂”)的受精卵放在培养皿中孵化，培养皿中的受精卵尽量不要重叠，孵化时，受精卵的密度控制在3～5粒/cm2，孵化的水温控制在20～21℃；
4、饲养：将孵化出的鲂鲴或鲴鲂的鱼苗进行饲养，饲养的具体步骤为：先在盛有清水的实验盆或水箱等小容器中养殖1～2天，其后放入网箱(2m×1m×1.5m)或小水泥池(5m×8m×2m)中继续饲养，其中清水的高度从30cm高逐渐提升，在一周内升高到0.8～1.2米；当鱼苗长到2.5～4cm长时，转入池塘中饲养。
与现有技术相比，本发明的优点在于利用团头鲂和黄尾密鲴进行亚科间的远缘杂交，首先能够获得一种具备杂交优势的新型杂交鱼类，团头鲂具有体高、生长速度快等优点，而黄尾密鲴具有肉质细嫩、含肉量高等优点，通过亚科间的远缘杂交，整合了父母本体型美观、肉质细嫩等优良性状；其次，本发明的方法成功地解决了远缘杂交容易出现杂交后代不能存活或存活率较低的问题，相比于同类杂交试验，其受精率、孵化率获得了显著提高；再次，在同等养殖条件下，本发明方法培育的鲂鲴、鲴鲂的抗逆性都高于其父母本。
此外，利用团头鲂和黄尾密鲴进行亚科间远缘杂交，还为新型四倍体鱼的形成提供了良好基础，在鱼类多倍体育种和生物进化方面具有重要意义。已有的研究表明，利用红鲫(2n＝100)为母本及湘江野鲤(2n＝100)为父本产生的远缘杂交后代中，F1·F2为二倍体(2n＝100)，而在二倍体F2个体中，存在能分别产生二倍体卵子和二倍体精子的雌、雄个体，二倍体卵子和二倍体精子结合，形成了两性可育的四倍体鱼(F3)。目前四倍体鲫鲤已连续繁殖了16代(F3·F18)，形成了一个遗传性状稳定的四倍体鱼群体(4n＝200)。据此，通过继续在团头鲂(2n＝48)和黄尾密鲴(2n＝48)的杂交后代中进行多代选育，也有望获得两种新型四倍体资源——四倍体鲂鲴和四倍体鲴鲂。因此，二倍体鲂鲴和鲴鲂的培育，不仅为两个优良品种的选育奠定了良好基础，而且为后续的新型多倍体鱼的选育提供了宝贵的资源，对今后的遗传育种及生物进化学的研究具有重要意义。
附图说明
图1为团头鲂(♀)×黄尾密鲴
Figure G2008100321971D00031
后代的外形照片；
图2为团头鲂(♀)×黄尾密鲴
Figure G2008100321971D00032
后代的染色体显微照片(2n＝48)；
图3为黄尾密鲴(♀)×团头鲂
Figure G2008100321971D00033
后代的外形照片；
图4为黄尾密鲴(♀)×团头鲂
Figure G2008100321971D00034
后代的染色体显微照片(2n＝48)。
具体实施方式
实施例：
在繁殖季节，选取性状优良、两龄以上的雌性团头鲂和黄尾密鲴，均注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合液催产，其中HCG的用量为600IU/kg、LRH-A的用量为20μg/kg，均采用胸鳍基部凹陷无鳞处倾斜45°胸腔注射。再选择雄性团头鲂和黄尾密鲴，同样注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合液，但注射剂量减半。注射时均采用分两次注射的方式，第一针剂量为总剂量的1/5，第二针注射余量，两针间隔时间为10小时。
将注射后的父母本亲鱼放入同一产卵池中，池内吊一张网片，便于观察亲鱼是否产卵。第二针注射后10小时左右为药物效应时间，此时雌性亲鱼开始产卵，应提前注意观察亲鱼的活动情况，一旦发现鱼巢网片有少量卵粒，说明已开始产卵，立即拉网检查，把成熟的雌性团头鲂(雌性黄尾密鲴)选出，同时选出相应的雄性黄尾密鲴(雄性团头鲂)，采用人工干法授精，用鹅羽毛搅拌卵子使其受精。鲂鲴和鲴鲂的受精卵分开放在培养皿中孵化，培养皿中的受精卵尽量不要重叠，密度以3～5粒卵子/cm2为宜，水温20～21℃。孵化出鱼苗后分开饲养，本实施例采用的饲养方式为：在盛有清水的瓷盆中养殖2天，在第3天放入水泥池中继续饲养，水泥池中的清水高度从30cm高逐渐提升，在一周内升高到1米左右；当鱼苗长到3cm长时，转入更大的池塘中饲养。
繁殖期间进行人工记数，统计其受精率和孵化率。以团头鲂(黄尾密鲴)为母本，以黄尾密鲴(团头鲂)为父本，实践证明，其正反交均能产生存活后代。经统计，团头鲂(♀)×黄尾密鲴
Figure G2008100321971D00035
的受精率、孵化率分别为58％、41％；黄尾密鲴(♀)×团头鲂
Figure G2008100321971D00036
的受精率、孵化率分别为49％、35％。由此可见，相比于同类杂交试验，该两种亚科间鱼的远缘杂交使其受精率、孵化率获得了显著提高，且鲂鲴要明显高于鲴鲂。
鱼苗饲养三个月左右后，随机抽样，人工测量并分析其生物学性状相关数据，如侧线鳞数、背鳍条数、体长/体高值等，并分别与其父母本成体的各项已知数据进行比较，比较结果如下表一、表二所示。
表一：团头鲂、黄尾密鲴正反交后代的可数性状比较(单位：片或条)
Figure G2008100321971D00041
注：上表中大写的罗马数字代表硬棘条的数目，阿拉伯数字代表鳍条的数目。
表二：团头鲂、黄尾密鲴正反交后代的可比性状比较
Figure G2008100321971D00042
上述生物学性状相关数据分析表明，两种鱼正反交后代(鲂鲴、鲴鲂)在外形上均整合了其父母本团头鲂、黄尾密鲴的特征(见表一，表二)，且长势均一。如三个月左右时，鲂鲴、鲴鲂其体长/体高比值分别为2.60、2.90，均大于团头鲂的2.37，但小于黄尾密鲴的4.07；侧线鳞分别为58～63、61～66，介于团头鲂的49～52以及黄尾密鲴的63～68之间等等。这些数据均说明了团头鲂、黄尾密鲴的杂交后代(鲂鲴、鲴鲂)体高介于其亲本之间，且与其他品种的鱼相比，头相对较小，并获得了其亲本团头鲂体背高以及黄尾密鲴体形圆长等特点(见图1和图3)。另外，鲂鲴的体背比鲴鲂明显要高；鲴鲂的胸鳍条略带桔黄色，鳃盖后缘有一黄斑，说明这两种杂交鱼均更多的继承了其母本的性状。
解剖实验还发现，上述方法培育的鲂鲴、鲴鲂均获得了黄尾密鲴肉质细嫩且含肉量高的优势。在同等养殖条件下，发现鲂鲴、鲴鲂的抗逆性都高于其父母本，如有时池塘缺氧，团头鲂和黄尾密鲴易大规模死亡，而鲂鲴和鲴鲂很少有死亡的现象，说明这两种杂交鱼具有较强的抗逆性。
再用肾细胞直接制片法对鲂鲴和鲴鲂杂交品种的体细胞染色体数目进行抽样检测，肾细胞直接制片法的具体检测方法为：在18～22℃水温下培育实验鱼1～3天后，对实验鱼注射植物血凝素(PHA)1～3次，每次剂量为2～8μg/g体重，间隔时间为12～24小时，在解剖取材前2～6小时，注射秋水仙素，剂量为2～4μg/g体重；取出肾组织，在生理盐水下剪碎肾组织，0.075mol/L氯化钾(KCl)溶液低渗处理，在20℃温度下低渗40～60分钟；用体积比为1：3的冰醋酸：甲醇的混合液固定肾细胞1～3次，再在冰冻载玻片上滴片，Giemsa染液染色。用上述检测方法得到的检测结果如图2、图4所示，由图2和图4可以看出，团头鲂(♀)×黄尾密鲴黄尾密鲴(♀)×团头鲂
Figure G2008100321971D00052
杂交后代F1的染色体数目均为48，证明它们是二倍体(2n＝48)。

Claims (3)

1.一种团头鲂与黄尾密鲴间远缘杂交的方法，其特征在于：以团头鲂为母本亲鱼、黄尾密鲴为父本亲鱼，或者以黄尾密鲴为母本亲鱼、团头鲂为父本亲鱼，对所述父母本亲鱼先进行催产，再对所述父母本亲鱼进行人工干法受精，并将受精卵进行孵化，再对孵化出的鱼苗进行饲养，进而得到团头鲂与黄尾密鲴的杂交品种；
所述催产的操作步骤为：选取两龄以上的雌性亲鱼，注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为600～800IU/kg、黄体素释放激素类似物的用量为20～30μg/kg；再选择雄性亲鱼，对其注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合液，相比雌性亲鱼，其注射剂量减半；所述注射过程分两次进行，第一针剂量为总剂量的1/5，第二针注射余量，两针的间隔时间为9～11小时；注射位置均采用胸鳍基部凹陷无鳞处胸腔注射。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于对受精卵进行孵化时，受精卵的密度控制在3～5粒/cm2，孵化的水温控制在20～21℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于对孵化出的鱼苗进行饲养的步骤包括：先在盛有清水的实验盆或水箱中养殖1～2天，其后放入网箱或小水泥池中继续饲养，网箱或小水泥池中清水的高度从30cm高逐渐提升，在一周内升高到0.8～1.2米；当鱼苗长到2.5～4cm长时，转入池塘中饲养。
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