CN110199918A - 一种同源四倍体鲤品系的建立方法及选育同源三倍体鲤的方法 - Google Patents
一种同源四倍体鲤品系的建立方法及选育同源三倍体鲤的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种同源四倍体鲤品系的建立方法，以鲤鱼为原始母本，团头鲂为原始父本进行杂交，杂交F1代中挑选出雌性异源四倍体鲤鲂与雄性同源二倍体类鲫，经人工催产、人工干法授精、流水孵化、专池饲养、检测筛选后得到染色体数目为200的同源四倍体鲤F1，雌、雄同源四倍体鲤F1通过多代自交传代培养，得到遗传性状稳定的同源四倍体鲤品系。获得的同源四倍体鲤具有体形优美、生长速度快、抗逆性强、繁殖力强等优点，孵化率及苗种存活率都较高，两性可育且遗传稳定。还公开了一种以二倍体鲤作为母本、同源四倍体鲤作为父本，进行倍间杂交得到同源三倍体鲤的方法。获得的三倍体鱼具有潜在不育、生长快、肉质好等优点，在生产应用上具有重要价值。
Description
技术领域
本发明属于鱼类的远缘杂交领域，尤其涉及一种同源四倍体鲤品系的建立方法及选育同源三倍体鲤的方法。
背景技术
远缘杂交作为一种重要的鱼类遗传育种和性状改良方法，它可以整合整套外源基因，从而改变杂交后代基因结构的遗传组成以及基因的表达调控，甚至改变杂交后代的倍性水平并最终建立遗传稳定的四倍体群体。在鱼类遗传育种中，通常可以利用冷/热休克等方法抑制受精卵的第一次有丝分裂制备出同源四倍体鱼，但其制得的同源四倍体鱼往往性腺发育不正常或单性可育，因育性不稳定而未能形成稳定的四倍体鱼品系。
目前，已报道的稳定四倍体鱼品系仅有：在雌性红鲫(2n＝100)与雄性湘江野鲤(2n＝100)的属间远缘杂交中建立了遗传稳定的异源四倍体鲫鲤品系(4n＝200，F3-F28)；在雌性红鲫(2n＝100)与雄性团头鲂(2n＝48)的亚科间远缘杂交的F1代中形成了异源四倍体鲫鲂(4n＝148)，该异源四倍体鲫鲂通过自交形成了同源四倍体鱼(4n＝200)，这种同源四倍体鱼目前已经形成了一个稳定的四倍体鱼品系(F2-F14)。两性可育的四倍体鱼品系是大规模制备100％不育三倍体鱼(通常在生长速度、抗病性、抗逆性以及肉质等方面表现出显著的杂种优势)的核心亲本种质资源，尽管目前已建立了一些遗传稳定的四倍体鱼品系，但其孵化率及苗种存活率都较低。到目前为止，两性可育的四倍体鱼品系种质资源仍非常少，一直以来存在供不应求的境况，严重制约了不育三倍体鱼的规模化生产。
鲤鱼是我国广为推广的淡水鱼类品种，是一种杂食性鱼类，它具有生长快，抗逆性强，耐低氧等优点，然而其肉质不够鲜美限制了它的进一步推广。团头鲂是我国池塘养殖较为普遍的鱼类品种，是一种草食性鱼类，它具有肉质鲜美的特点，然而其抗逆性不强，不耐低氧，限制了它的规模化养殖。这两种鱼的远缘杂交后代，有望结合亲本鱼的优点，培育出生长快，抗逆性强，耐低氧，肉质鲜美的杂交鱼类。经过多年试验发现，以团头鲂为母本，鲤鱼为父本的杂交组合没有存活后代。以鲤鱼为母本，团头鲂为父本的杂交组合虽然能存活，但其孵化率及苗种存活率都较低，且杂交后代一直未能形成遗传稳定的四倍体品系。
因此，如何利用和改进现有的杂交育种方法，在雌性鲤鱼与雄性团头鲂的远缘杂交后代中选育两性可育、孵化率及苗种存活率都较高且遗传稳定的同源四倍体鱼一直以来是鱼类育种领域急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种两性可育、孵化率及苗种存活率都较高且遗传稳定的同源四倍体鲤品系的建立方法及选育同源三倍体鲤的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种同源四倍体鲤品系的建立方法，包括如下步骤：以鲤鱼为原始母本，团头鲂为原始父本进行杂交，杂交F1代中挑选出雌性异源四倍体鲤鲂与雄性同源二倍体类鲫，进行专池饲养；在繁殖季节，挑选2龄及2龄以上的能产生墨绿色卵子的异源四倍体鲤鲂雌性个体，以及1龄及1龄以上的能产生乳白色精液的同源二倍体类鲫雄性个体，进行人工催产，人工干法授精，授精完成后的受精卵在恒温、通气、流水的环境下孵化；待鱼苗孵化完成后进行专池饲养，再对饲养后的鱼苗进行检测筛选，得到染色体数目为200的同源四倍体鲤F1；将得到的雌、雄同源四倍体鲤F1自交，通过多代自交传代培养，得到遗传性状稳定的同源四倍体鲤品系。
上述的建立方法，优选的，所述雌性异源四倍体鲤鲂、雄性同源二倍体类鲫通过观察生物学特征、检测血细胞DNA含量的方法挑选得到；所述雌性异源四倍体鲤鲂的生物学特征表现为体形侧扁、近似纺锤形、背部青灰色、腹部黄白色、尾鳍灰色，经流式细胞仪检测其血细胞DNA含量为148；所述雄性同源二倍体类鲫的生物学特征表现为体形侧扁、背部隆起高而宽、腹部圆、呈纺锤形、头短而小、背部灰绿色、腹部灰白色，经流式细胞仪检测其血细胞DNA含量为100。
优选的，从杂交F1代中挑选所述雌性异源四倍体鲤鲂、雄性同源二倍体类鲫时，优先挑选性成熟特征明显(雌鱼腹部膨大，雄鱼轻压腹部能挤出乳白色精液)、体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤(无大面积鳞片脱落，身体各部位无明显伤痕等等)、发育良好的雌性异源四倍体鲤鲂和/或雄性同源二倍体类鲫。
优选的，所述人工催产的具体步骤如下：在3月21日至4月30日，水温维持在19℃～24℃，先对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为350IU/kg～450IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为8μg/kg～12μg/kg；3h～5h后再对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素、黄体素释放激素类似物与地欧酮的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为700IU/kg～900IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为16μg/kg～24μg/kg，地欧酮的用量为1.5mg/kg～2.5mg/kg；然后将母本亲鱼与父本亲鱼按1︰(2～3)的数量比放入同一产卵池中待产，视水情及时向池中冲水，在产卵前2h～3h停止往池中冲水，使母、父本亲鱼在静水中待产，直至开始顺利产卵和产精。本发明采用的催产素种类和用量都是经过摸索此种鱼的最佳催产效果而定的，每种鱼的催产剂量因个体的差异而不同。
优选的，所述人工干法授精的具体步骤如下：在所述人工催产9h～12h后，将能够顺利产卵的母本亲鱼擦干水分，挤出墨绿色卵子置于器皿中，然后将能够顺利产精的父本亲鱼擦干水分，挤出乳白色精液置于墨绿色卵子上面，用干燥羽毛将精、卵子搅拌均匀后铺在水缸中平摊开的棕片上使其受精，所述棕片离水面5～10cm。
优选的，所述受精卵的密度控制在2～3粒/cm2，所述孵化的水温控制在21℃～22℃。
优选的，所述鱼苗孵化完成后进行专池饲养的具体步骤如下：将孵化完成后得到的鱼苗先在纯水中养殖3～5天，待鱼苗出现腰点后转入事先暴晒干燥随后蓄水曝气的水泥池中继续饲养，水泥池中引进池塘中的肥水5cm-10cm，加入水生植物构建小型生态系统，饲养初期加入水蚤蚤种用于辅助开口饵料，1～2天后泼洒豆浆用于发酵生产微生物，泼洒次数为2～3次/天，待鱼苗体长3～5cm时，转入池塘中饲养。
优选的，所述检测筛选的方法包括流式细胞DNA含量测定法、肾组织染色体制备法、性腺组织石蜡切片法、红细胞特征比较法和精子扫描电子显微镜测定法中的任意一种或多种。
优选的，所述雌、雄同源四倍体鲤F1自交的具体步骤如下：将1龄及1龄以上的雌、雄同源四倍体鲤F1群体按1︰(2～4)的数量比放入同一产卵池中，进行同源四倍体鲤F1的人工催产，人工干法授精和流水孵化，得到的鱼苗进行饲养，直至鱼苗长到8～10cm长后获得下一代同源四倍体鲤；所述同源四倍体鲤F1进行人工催产时，先对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为300IU/kg～400IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为6μg/kg～10μg/kg；3h～5h后再对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素、黄体素释放激素类似物与地欧酮的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为600IU/kg～800IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为12μg/kg～20μg/kg，地欧酮的用量为1.5mg/kg～2.0mg/kg。
同源四倍体鲤F1相对于其亲本异源四倍体鲤鲂及同源二倍体类鲫而言，其性腺发育较好，雌性个体腹部更加膨大而柔软，雄性个体能挤出较粘稠的乳白色精液，因此在催产药的剂量方面，相对于其亲本而言，采取较低的剂量也能取得好的催产效果。此外，本发明在水泥池饲养鱼苗方面，采取了事先将水泥池池水培肥的措施(在暴晒干燥随后蓄水曝气的水泥池中引进池塘中的肥水5cm-10cm，加入少许豆浆渣用于发酵生产微生物，加入小型水蚤蚤种用于鱼苗初期的辅助开口饵料，再加入水生植物构建小型生态系统)，待鱼苗出现腰点后转入事先培肥的水泥池中饲养，这样水泥池池水中有充足的微生物，水蚤等食物作为辅助饵料，保证了鱼苗较高的存活率。
基于一个总的技术构思，本发明还提供一种利用上述建立方法得到的同源四倍体鲤品系选育同源三倍体鲤的方法，包括如下步骤：以二倍体鲤作为母本亲鱼，所述同源四倍体鲤作为父本亲鱼，进行倍间杂交，得到的后代即为所述同源三倍体鲤。
上述的方法，优选的，所述杂交的具体操作包括如下步骤：在繁殖季节，水温维持在22℃～25℃，挑选2龄及2龄以上的能产生墨绿色卵子的二倍体鲤雌性个体，以及1龄及1龄以上的能产生乳白色精液的同源四倍体鲤的雄性个体，先对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为300～400IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为6μg/kg～10μg/kg；3h～5h后再对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素、黄体素释放激素类似物与地欧酮的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为1000IU/kg～1500IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为20μg/kg～25μg/kg，地欧酮的用量为1.8mg/kg～2.8mg/kg；然后将母本亲鱼与父本亲鱼按1︰(4～6)的数量比放入同一产卵池中待产，直至开始顺利产卵和产精；再进行人工干法授精，授精完成后的受精卵于22℃～24℃恒温、通气、流水的环境下孵化，待鱼苗孵化完成后进行专池饲养，直至鱼苗长到8～10cm长后，通过流式细胞DNA含量测定方法挑选出血细胞DNA含量为150的后代，即获得所述的同源三倍体鲤。
上述的选育方法，优选的，所述二倍体鲤的体形侧扁而腰圆、头后背部稍隆起、有较长的吻须和颌须各一对、背部呈灰黑色、腹部淡白色、尾鳍上叶为红色，优先选择性成熟特征明显(腹部膨大)、体型好、体质健壮、无病无伤(无大面积鳞片脱落，身体各部位无明显伤痕等等)、发育良好的雌性个体；所述同源四倍体鲤的体形侧扁、近似纺锤形、背部黄灰色、腹部黄白色、尾鳍灰色，优先选择性成熟特征明显(轻压腹部能挤出乳白色精液)、无病无伤(无大面积鳞片脱落，身体各部位无明显伤痕等等)、发育良好的雄性个体。
优选的，所述人工催产的繁殖季节在4月16日至5月10日，待产时视水情及时向池中冲水，在产卵前2h～3h停止往池中冲水，使母、父本亲鱼在静水中待产。
优选的，所述人工干法授精的具体步骤如下：在所述人工催产9h～12h后，将能够顺利产卵的母本亲鱼擦干水分，挤出墨绿色卵子置于器皿中，然后将能够顺利产精的父本亲鱼擦干水分，挤出乳白色精液置于墨绿色卵子上面，用干燥羽毛将精、卵子搅拌均匀后铺在水缸中平摊开的棕片上使其受精，所述棕片离水面5～10cm。
更优选的，所述受精卵的密度控制在2～3粒/cm2，所述孵化的水温控制在22℃～24℃。
优选的，所述鱼苗孵化完成后进行专池饲养的具体步骤如下：将孵化完成后得到的鱼苗先在纯水中养殖3～5天，待鱼苗出现腰点后转入事先暴晒干燥随后蓄水曝气且将池水事先培肥的水泥池中继续饲养，1～2天后泼洒豆浆，泼洒次数为2～3次/天，待鱼苗体长3～5cm时，转入池塘中饲养。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明同源四倍体鲤品系的建立方法，获得的同源四倍体鲤具有体形优美、生长速度快、抗逆性强、繁殖力强等优点，孵化率及苗种存活率都较高，两性可育且遗传稳定，这是世界上首例通过远缘杂交及姊妹物种间交配的方法制备的新型同源四倍体鲤品系，提供了新的四倍体鱼类种质资源，不但为制备新型优良三倍体鱼奠定了关键的亲本资源，也提供了遗传背景清晰的四倍体动物品系，是系统研究多倍体动物生物学特性的好材料，在鱼类遗传育种和鱼类物种演化研究方面具有重要的意义。
2、本发明选育同源三倍体鲤的方法，获得的同源三倍体鲤具有潜在不育、生长快、肉质好等优点，在生产应用上具有重要价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中亲本异源四倍体鲤鲂(♀)的外形照片(比例尺为1cm)；
图2为本发明实施例1中亲本同源二倍体类鲫(♂)的外形照片(比例尺为1cm)；
图3为本发明实施例1中获得的同源四倍体鲤的外形照片(比例尺为1cm)；
图4为本发明实施例1中二倍体鲤鱼的DNA含量图；
图5为本发明实施例1中同源四倍体鲤的DNA含量图；
图6为本发明实施例1中同源四倍体鲤的染色体图(4n＝200)(比例尺为3μm)；
图7为本发明实施例1中同源四倍体鲤的精巢性腺切片(比例尺为20μm)；
图8为本发明实施例1中同源四倍体鲤的卵巢性腺切片(比例尺为20μm)；
图9为本发明实施例1中二倍体鲤鱼的红细胞图(比例尺为10μm)；
图10为本发明实施例1中同源四倍体鲤的红细胞图(比例尺为10μm)；
图11为本发明实施例1中同源四倍体鲤的精子外形照片(比例尺为1μm)；
图12为本发明实施例1中同源四倍体鲤自交传代的受精卵照片(受精时间2min)(比例尺为0.2cm)；
图13为本发明实施例1中第4代同源四倍体鲤的染色体图(4n＝200)(比例尺为3μm)；
图14为本发明实施例1中同源三倍体鲤的DNA含量图(图中波峰在150附近)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种本发明的同源四倍体鲤品系的建立方法，包括如下步骤：
1.亲本的选择与培养：在繁殖期前3～4个月，选择杂食性的鲤鱼为原始母本，草食性的团头鲂为原始父本，在杂交F1代中挑选出性成熟特征明显(雌鱼腹部膨大，雄鱼轻压腹部能挤出乳白色精液)、体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤(无大面积鳞片脱落，身体各部位无明显伤痕等等)的雌性异源四倍体鲤鲂(4n＝148)(外形照片参见图1)与雄性同源二倍体类鲫(2n＝100)(外形照片参见图2)，并将其专池饲养，保持水质良好；所述父、母本亲鱼在进行人工催产前，先放入亲鱼池内人工精养3～4个月，保存水质良好，特别是在繁殖期前一个月左右以精饵饲养，每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟，雌、雄比例为1︰2，亲本养殖数量在2000尾以上。
2.人工催产：在当年3月下旬至4月下旬，水温维持在19℃～24℃，选择2龄的轻挤腹部能产生墨绿色卵子的雌性异源四倍体鲤鲂为母本亲鱼，选择1龄的轻挤腹部能挤出乳白色精液的雄性同源二倍体类鲫为父本亲鱼，先对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合催化剂进行催产，其中HCG的用量为400IU/kg，LRH-A的用量为10μg/kg；4h后再对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)，黄体素释放激素类似物(LRH-A)与地欧酮(DOM)的混合催化剂进行催产，其中HCG的用量为800IU/kg，LRH-A的用量为20μg/kg，DOM的用量为2.0mg/kg。注射时优选采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法，以提高亲鱼的存活率；母本亲鱼催产完后，将其与父本亲鱼按1︰3的比例数量放入同一圆形产卵池(80m2左右)中待产，视水情及时向池中冲水，尤其在产卵前2h，注入一定水量后，停止注水，让母、父本亲鱼在静水中待产，直至其开始顺利产卵和产精。
3.人工干法授精与流水孵化：在母本、父本亲鱼人工催产10h之后，当发现亲鱼在产卵池中相互追逐后，开始拉网打捞，对亲鱼进行检测，将催产效果良好的(轻挤腹部能够很顺利产出大量墨绿色的卵子)雌性异源四倍体鲤鲂用干燥毛巾擦干水分，将其墨绿色卵子轻轻挤出置于授精专用干燥的不锈钢碗中，然后将擦拭干净的能够顺利产精的父本亲鱼同源二倍体类鲫的乳白色精液轻轻挤出置于上述有卵子的不锈钢碗中，用干燥羽毛将精、卵子充分搅拌均匀后均匀铺在玻璃水缸水面下8cm平摊开的棕片上使其受精，受精卵的密度控制在2～3粒/cm2，受精卵置于恒温(水温控制在21℃～22℃)、通气(采取小型增氧泵在水中通气的方式增加水体溶氧量)、流水(增加水体活水量)的环境下孵化。孵化期间，统计胚胎的受精率和孵化率。异源四倍体鲤鲂(♀)×同源二倍体类鲫(♂)形成的同源四倍体鲤的受精率和孵化率分别为82％～86％和70％～75％。
4.同源四倍体鲤鱼苗的饲养：鱼苗全部孵出后，先在盛有净水孵化装置制得的纯水水箱中养殖5天，待鱼苗出现腰点后将鱼苗转入事先充分暴晒干燥(杀灭水体中残留的有害细菌)随后蓄水曝气的小水泥池中(暴晒干燥后加入20cm深的水曝气三天以上待用；用水管在肥塘中引入5cm深的肥水，加入水生植物构建小型生态系统，饲养初期加入水蚤蚤种用于辅助开口饵料，两端水管口用细纱布封住，以防肥塘中的鱼苗混入)继续饲养，1～2天后泼洒豆浆水(事先过滤掉豆浆渣)，2～3次/天，力求细、匀。其中清水的高度从25cm高逐渐提升，在一周内升高到0.8米，当鱼苗长到3～5cm长时，转入池塘中饲养。
5.同源四倍体鲤的检测筛选：通过流式细胞DNA含量测定、肾组织染色体倍性检测等方法挑选出染色体数目为200的同源四倍体鲤(4n＝200)；最终挑选出来的同源四倍体鲤(外形照片参见图3)两性可育，雌、雄个体均为1年性成熟，繁殖季节能够产生大量的墨绿色成熟卵子和乳白色粘稠状的精液，对雌、雄同源四倍体鲤F1自交，通过多代培育自交传代，成功建立了遗传性状稳定的同源四倍体鲤品系(4n＝200，F1-F4)。
用流式细胞DNA含量测定法对异源四倍体鲤鲂(♀)×同源二倍体类鲫(♂)形成的同源四倍体鲤的血细胞中DNA含量进行检测。流式细胞DNA含量测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.3ml，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1ml细胞核提取液DAPI-A(nuclei extractionsolution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10～12min；样品经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH提供)静置于暗处染色样品约8～10min，然后上机检测。以普通二倍体鲤鱼为参照(图4所示)，用流式细胞仪测定同源四倍体鲤中血细胞的DNA平均含量，结果如图5所示。分析图中数据可知，同源四倍体鲤的DNA平均含量为191.46，与对照2倍的普通鲤鱼的DNA平均含量比值为0.95，该比值与预计的1︰1理论比值间无显著差异(P＞0.05)，说明同源四倍体鲤含有4套鲤鱼染色体。
用肾组织染色体倍性检测方法对异源四倍体鲤鲂(♀)×同源二倍体类鲫(♂)形成的同源四倍体鲤的体细胞染色体数目进行检测。肾组织染色体倍性检测的方法为：在20℃～22℃水温下培育实验鱼3～5天后，对实验鱼注射植物血凝素(PHA)1～3次，每次剂量为6～15μg/g体重，间隔时间为12～24小时，在解剖取材前4～6小时，注射秋水仙素，剂量为3～4μg/g体重。取出肾组织，在生理盐水下剪碎肾组织，使肾细胞充分分离出来，然后在0.075mol/L氯化钾溶液中低渗处理，在20℃～22℃温度下低渗40～60分钟，使肾细胞充分吸水胀破；接着用体积比为1︰3的冰醋酸：甲醇的混合液固定肾组织(肾细胞)1～3次，固定15～30分钟；再在冰冻载玻片上滴片；姬姆萨(Giemsa)染液染色45～60分钟，细水流冲洗载玻片背面去除染液，风干后镜检、拍照。用上述检测方法得到的检测结果如图6所示，由图6可以看出，同源四倍体鲤的染色体数目为4n＝200。
从同源四倍体鲤2月龄起，每年按月定时取材，每次取三条鱼，利用石蜡切片技术对其性腺发育情况进行检测。石蜡切片具体步骤为：1)固定脱水环节：取实验鱼称重解剖，将取好的性腺材料置于Boin’s液中固定1～3天后，将待切的性腺材料取出绿豆大小规格放在事先已加入70％酒精的干净Ep管中脱水10min，中间换次70％酒精继续脱水10min；然后在不同梯度酒精中分批进行脱水，依次是80％，90％，95％，100％，100％各10min；2)透明环节：将上述脱好水的性腺材料置于事先已加入无水乙醇：二甲苯(1:1)的溶液中进行半透明10min，然后再转移至纯二甲苯溶液中进行两次透明，每次约5min，具体依性腺材料达到透明的程度为标准；3)浸蜡环节：将上述已经透明的性腺材料置于事先预热的62℃的液体石蜡中(普通白蜡与蜂蜡的混合物，反复使用过的澄清石蜡混合液效果最佳)，在62℃左右的烘箱中进行浸蜡操作；4)包埋环节：将上述已经浸好蜡的性腺材料转移到事先折叠好的小纸盒或者小瓷盒的正中央，加入62℃的液体石蜡混合液，置于室温下冷却1h 30min；5)切片、烫片、烘片环节：将上述包埋好的性腺材料石蜡块状物取出来，首先用较锋利的单面刀片将石蜡块状物进行修整(一般修整成梯形体状最好，待切片为小的四方形，底面为大的四方形，侧面均为梯形)，然后将修整好的石蜡块状物固定在小型长方体的木块上，最后将其固定在石蜡切片机上进行切片(切片厚度为6mm最佳)；切好的蜡片用蛋白甘油(用Tip头沾少许蛋白甘油后在载玻片上均匀覆满双蒸水)粘贴在载玻片上，使蜡带悬浮在载玻片上置于42℃烫片机上使其表面水分烫干；将烫干的蜡带载玻片放置在提前调好温度的65℃烘箱中进行烘片处理30min；6)HE(苏木精搭配伊红)染色环节：a.将上述烘干的性腺材料蜡片置于提前预热好的60℃纯二甲苯溶液中进行脱蜡处理3h(中间需要换次新的二甲苯溶液)，使其彻底将蜡带中的蜡物质脱离干净；b.复水处理：按上述脱水、透明环节的反方向进行，每次不同的梯度处理1～2min，最后将其浸泡在自来水中处理2min；c.苏木精染色处理：将载玻片上的性腺材料从自来水中取出来尽量使其表面的水分挥发，再放置在含有苏木精的空缸中进行染色处理30～45min；d.酸化与蓝化处理：先用自来水将上述染好色的性腺材料表面的苏木精染液在其载玻片反面冲洗干净，然后置于酸性溶液(3滴浓盐酸加入100ml的自来水)中进行酸化2s使材料变为淡红色为止，再将其放于自来水中润洗3s，接着置于碱性溶液(3滴浓氨水加入100ml的自来水)中进行蓝化处理3s使材料呈现淡蓝色为止，最后用自来水润洗3s；e.再次脱水处理：按上述脱水环节步骤进行，分批次处理2min，在95％酒精后加一步用95％的伊红酒精进行染色处理2min，最后在无水乙醇：二甲苯(1:1)与纯二甲苯(重复两次)中处理3min；7)树胶封片，镜检，拍照。图7所示为同源四倍体鲤完全能育型精巢的石蜡切片，图8所示为同源四倍体鲤完全发育卵巢的石蜡切片。
用血涂片方法对异源四倍体鲤鲂(♀)×同源二倍体类鲫(♂)形成的同源四倍体鲤的红细胞形态进行检测。具体步骤为：分别从同源四倍体鲤和二倍体鲤的尾静脉取1～2ml的血液，加入三倍体积的磷酸缓冲液，摇匀后均匀涂在载玻片上，用Giemsa染液染色2-4min，染色完毕后将载玻片反面用流水将染液冲洗干净，稍微干燥后进行镜检，拍照。通过公式(4/3)πab2计算红细胞核体积，其中a为细胞核长径的一半，b为细胞核短径的一半。每种样品测量20个红细胞，算出它们细胞核的体积比，用卡方来测定适度。结果表明，同源四倍体鲤的红细胞核的体积(图10所示)约为二倍体鲤鱼(图9所示)的两倍(P＞0.05)。该检测结果与检测染色体数目、DNA含量的结果相一致。同源四倍体鲤和二倍体鲤红细胞核体积的测定结果见表1。
表1同源四倍体鲤、二倍体鲤的红细胞核体积比较
注：a.该比例与2：1没有明显差异(P＞0.05)
在繁殖季节，用干净的吸管吸取刚刚挤出的雄性同源四倍体鲤的乳白色精液，置于提前预冷(4℃)预加3％的戊二醛溶液的Ep管中，固定4～10h；将上述固定好的混合液轻轻摇匀后，滴1滴在提前用多聚赖氨酸处理过的载玻片中央；将上述滴加了样品的载玻片用磷酸缓冲液进行冲洗，连续3次，每次冲洗10min；随后在1％的锇酸中固定1小时，磷酸缓冲液再次冲洗3次；用系列不同梯度的酒精溶液进行脱水处理后在叔丁醇中浸泡2h，在冷冻环境下进行干燥处理后再进行离子溅射镀金；最后用X-650(HIT-ACHI)SEM扫描电镜观察并摄影。用上述检测方法得到的检测结果如图11所示，由图11可以看出，同源四倍体鲤的雄性个体能产生大小(精子头部平均直径)在2.54μm左右的精子，其体积为8.58μm3，而已知的二倍体鲤产生的精子头部平均直径为1.90μm，相应的体积为3.59μm3，同源四倍体鲤的雄性个体产生的精子头部体积约为二倍体鲤的两倍(P＞0.05)，为证明同源四倍体鲤产生二倍体精子提供了重要证据。
6.同源四倍体鲤的人工催产：当同源四倍体鲤达到1年龄时，在当年3月下旬至4月中旬，水温维持在19℃～22℃，先对能顺利轻挤出乳白色精液的父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合催化剂进行催产，其中HCG的用量为300IU/kg，LRH-A的用量为8μg/kg；4h后再对能顺利轻挤出墨绿色卵子的母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素(HCG)，黄体素释放激素类似物(LRH-A)与地欧酮(DOM)的混合催化剂进行催产，其中HCG的用量为600IU/kg，LRH-A的用量为16μg/kg，DOM的用量为1.5mg/kg。母本亲鱼催产完后，将其与父本亲鱼按1︰3的比例数量放入同一圆形产卵池(80m2左右)中待产，视水情及时向池中冲水，尤其在产卵前2h，注入一定水量后，停止注水，让母、父本亲鱼在静水中待产，直至其开始顺利产卵和产精。
7.同源四倍体鲤的人工授精及孵化：上述步骤6的人工催产完后再进行人工干法授精，人工干法授精之前先将能够顺利产卵的母本亲鱼用干燥毛巾擦干水分，将其墨绿色卵子轻轻挤出置于授精专用干燥的不锈钢碗中，然后将擦拭干净的能够顺利产精的父本亲鱼的乳白色精液轻轻挤出置于上述有卵子的不锈钢碗中，用干燥羽毛将精、卵子充分搅拌均匀后均匀铺在玻璃水缸水面下8cm平摊开的棕片上使其受精，受精卵的密度控制在2～3粒/cm2，受精卵(受精卵图见图12所示)置于恒温(水温控制在21℃～22℃)、通气(采取小型增氧泵在水中通气的方式增加水体溶氧量)、流水(增加水体活水量)的环境下孵化。图12所示的同源四倍体鲤的受精卵大小均一，没有大小不一的现象，受精卵大小在1.7mm左右，同源四倍体鲤的卵子大小比二倍体鲤产生的单倍体卵子大小(在1.3mm左右)要大，又与异源四倍体鲫鲤(F3～F22)产生的二倍体卵子大小相等，推测它们是二倍体卵子，为证明同源四倍体鲤产生二倍体卵子提供了重要证据。
鱼苗孵化后，先在盛有净水孵化装置制得的纯水的水箱中养殖5天，待鱼苗出现腰点后将鱼苗转入事先充分暴晒干燥(杀灭水体中残留的有害细菌)随后蓄水曝气的小水泥池中(暴晒干燥后加入20cm深的水曝气三天以上待用；用水管在肥塘中引入5cm深的肥水，两端水管口用细纱布封住，以防肥塘中的鱼苗混入)继续饲养，1～2天后泼洒豆浆水(事先过滤掉豆浆渣)，2～3次/天，力求细、匀。其中清水的高度从25cm高逐渐提升，在一周内升高到0.8米，当鱼苗长到3～5cm长时，转入池塘中饲养获得下一代同源四倍体鲤，并对饲养后的同源四倍体鲤的主要生物学特性进行检测，建立同源四倍体鲤品系。
通过流式细胞DNA含量测定，肾组织染色体制备、性腺组织石蜡切片、红细胞特征比较、精子扫描电子显微镜测定等方法对每代同源四倍体鲤的主要生物学特性进行研究，其结果与第一代同源四倍体鲤的结果一致，说明该同源四倍体鲤品系遗传性状稳定，四倍体特性代代相传。如附图中图13所示，第4代同源四倍体鲤的染色体数目为200，这一结果说明本发明培育的同源四倍体鲤群体遗传性状稳定。
本发明中异源四倍体鲤鲂与同源二倍体类鲫杂交制备的同源四倍体鲤具有4套鲤鱼染色体组，但是在外型特征上与普通鲤鱼有明显的区别，该四倍体鱼仅有一对较短口须，侧线鳞为31-33，鳃耙数为31-37，下咽齿式为4-4；而鲤鱼有两对较长口须，侧线鳞为35-38，鳃耙数为27-28，下咽齿式为1.1.3-3.1.1；在繁殖特性上，该四倍体鱼也与普通鲤鱼有本质区别，该四倍体鱼雌、雄个体一年可以达到性成熟；而普通鲤鱼雌、雄个体性成熟年龄一般为两年，这是世界上首例通过远缘杂交及姊妹物种间交配的方法制备的新型同源四倍体鲤品系，它的形成在鱼类遗传育种甚至在鱼类物种演化研究方面具有重要的意义；其次，本发明克服了人工制备鱼类同源四倍体物种难的瓶颈，本发明方法培育的同源四倍体鲤具有高受精率(82％～86％)和高孵化率(70％～75％)等特点，并通过多代培育建立了一个遗传稳定的同源四倍体鲤品系，满足批量生产的条件，利用该同源四倍体鲤群体与二倍体鲤倍间杂交，制备了具有潜在不育、生长快、肉质好等优点的新型同源三倍体鱼，其在生产应用上具有重要价值。图14所示为本发明中制备的新型同源三倍体鱼的鱼苗DNA含量图，图中显示的波峰在150附近。不难看出，同源四倍体鲤品系的建立具有明显的经济效益和社会效益。因此，该同源四倍体鲤品系的培育，提供了新的四倍体鱼类种质资源，为制备新型优良三倍体鱼奠定了关键的亲本资源，在今后的鱼类遗传育种及鱼类物种演化研究方面具有重要的指导作用。
实施例2：
一种利用实施例1得到的同源四倍体鲤选育同源三倍体鲤的方法，具体包括以下步骤：
1.亲本的选择与培养：在繁殖期前3～4个月，挑选出性成熟特征明显(腹部膨大或轻挤腹部能挤出乳白色精液)、体型好、体色鲜艳、体质健壮、无病无伤(无大面积鳞片脱落，身体各部位无明显伤痕等等)的雌性二倍体鲤(2n＝100)与雄性同源四倍体鲤(4n＝200)(外形照片参见图3)，并将其专池饲养，保持水质良好；所述父、母本亲鱼在进行人工催产前，先放入亲鱼池内人工精养3～4个月，保存水质良好，特别是在繁殖期前一个月左右以精饵饲养，每隔2～3天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟，雌、雄比例为1︰5，亲本养殖数量在500尾以上。
2.人工催产：在当年4月中下旬至5月上旬，水温维持在22℃～25℃，选择2龄的轻挤腹部能产生墨绿色卵子的雌性二倍体鲤为母本亲鱼，选择1龄的轻挤腹部能挤出乳白色精液的雄性同源四倍体鲤为父本亲鱼，先对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为300IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为8μg/kg；4h后再对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素、黄体素释放激素类似物与地欧酮的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为1200IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为20μg/kg，地欧酮的用量为2.0mg/kg；然后将母本亲鱼与父本亲鱼按1︰5的数量比放入同一产卵池中待产，视水情及时向池中冲水，在产卵前2h停止往池中冲水，使母、父本亲鱼在静水中待产，直至开始顺利产卵和产精。
3.人工干法授精与流水孵化：在母本、父本亲鱼人工催产10h后，当发现亲鱼在产卵池中相互追逐后，开始拉网打捞，对亲鱼进行检测，将催产效果良好的(轻挤腹部能够很顺利产出大量墨绿色的卵子)雌性二倍体鲤用干燥毛巾擦干水分，将其墨绿色卵子轻轻挤出置于授精专用干燥的不锈钢碗中，然后将擦拭干净的能够顺利产精的父本亲鱼同源四倍体鲤的乳白色精液轻轻挤出置于上述有卵子的不锈钢碗中，用干燥羽毛将精、卵子充分搅拌均匀后均匀铺在玻璃水缸水面下8cm平摊开的棕片上使其受精，受精卵的密度控制在2～3粒/cm2，受精卵置于恒温(水温控制在22℃～24℃)、通气(采取小型增氧泵在水中通气的方式增加水体溶氧量)、流水(增加水体活水量)的环境下孵化。
4.同源三倍体鲤鱼苗的饲养：鱼苗全部孵出后，先在盛有净水孵化装置制得的纯水水箱中养殖5天，待鱼苗出现腰点后将鱼苗转入事先充分暴晒干燥(杀灭水体中残留的有害细菌)随后蓄水曝气的小水泥池中(暴晒干燥后加入20cm深的水曝气三天以上待用；用水管在肥塘中引入5cm深的肥水，两端水管口用细纱布封住，以防肥塘中的鱼苗混入)继续饲养，1～2天后泼洒豆浆水(事先过滤掉豆浆渣)，2～3次/天，力求细、匀；其中清水的高度从25cm高逐渐提升，在一周内升高到0.8米，当鱼苗长到3～5cm长时，转入池塘中饲养。
5.同源三倍体鲤的检测筛选：直至鱼苗长到8～10cm长后，通过流式细胞DNA含量测定方法挑选出血细胞DNA含量为150左右，即得到选育出的同源三倍体鲤。
本发明获得的同源三倍体鲤具有潜在不育、生长快、肉质好等优点，在生产应用上具有重要价值。
Claims (10)
1.一种同源四倍体鲤品系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：以鲤鱼为原始母本，团头鲂为原始父本进行杂交，杂交F1代中挑选出雌性异源四倍体鲤鲂与雄性同源二倍体类鲫，进行专池饲养；在繁殖季节，挑选2龄及2龄以上的能产生墨绿色卵子的异源四倍体鲤鲂雌性个体，以及1龄及1龄以上的能产生乳白色精液的同源二倍体类鲫雄性个体，进行人工催产，人工干法授精，授精完成后的受精卵在恒温、通气、流水的环境下孵化；待鱼苗孵化完成后进行专池饲养，再对饲养后的鱼苗进行检测筛选，得到染色体数目为200的同源四倍体鲤F1；将得到的雌、雄同源四倍体鲤F1自交，通过多代自交传代培养，得到遗传性状稳定的同源四倍体鲤品系。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述雌性异源四倍体鲤鲂、雄性同源二倍体类鲫通过观察生物学特征、检测血细胞DNA含量的方法挑选得到；所述雌性异源四倍体鲤鲂的生物学特征表现为体形侧扁、近似纺锤形、背部青灰色、腹部黄白色、尾鳍灰色，经流式细胞仪检测其血细胞DNA含量为148；所述雄性同源二倍体类鲫的生物学特征表现为体形侧扁、背部隆起高而宽、腹部圆、呈纺锤形、头短而小、背部灰绿色、腹部灰白色，经流式细胞仪检测其血细胞DNA含量为100。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述人工催产的具体步骤如下：在3月21日至4月30日，水温维持在19℃～24℃，先对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为350IU/kg～450IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为8μg/kg～12μg/kg；3h～5h后再对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素、黄体素释放激素类似物与地欧酮的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为700IU/kg～900IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为16μg/kg～24μg/kg，地欧酮的用量为1.5mg/kg～2.5mg/kg；然后将母本亲鱼与父本亲鱼按1︰(2～3)的数量比放入同一产卵池中待产，视水情及时向池中冲水，在产卵前2h～3h停止往池中冲水，使母、父本亲鱼在静水中待产，直至开始顺利产卵和产精。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述人工干法授精的具体步骤如下：在所述人工催产9h～12h后，将能够顺利产卵的母本亲鱼擦干水分，挤出墨绿色卵子置于器皿中，然后将能够顺利产精的父本亲鱼擦干水分，挤出乳白色精液置于墨绿色卵子上面，用干燥羽毛将精、卵子搅拌均匀后铺在水缸中平摊开的棕片上使其受精，所述棕片离水面5～10cm。
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述受精卵的密度控制在2～3粒/cm2，所述孵化的水温控制在21℃～22℃。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述鱼苗孵化完成后进行专池饲养的具体步骤如下：将孵化完成后得到的鱼苗先在纯水中养殖3～5天，待鱼苗出现腰点后转入事先暴晒干燥随后蓄水曝气的水泥池中继续饲养，水泥池中引进池塘中的肥水，加入水生植物构建小型生态系统，饲养初期加入水蚤蚤种用于辅助开口饵料，1～2天后泼洒豆浆用于发酵生产微生物，泼洒次数为2～3次/天，待鱼苗体长3～5cm时，转入池塘中饲养。
7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述检测筛选的方法包括流式细胞DNA含量测定法、肾组织染色体制备法、性腺组织石蜡切片法、红细胞特征比较法和精子扫描电子显微镜测定法中的任意一种或多种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的建立方法，其特征在于，所述雌、雄同源四倍体鲤F1自交的具体步骤如下：将1龄及1龄以上的雌、雄同源四倍体鲤F1群体按1︰(2～4)的数量比放入同一产卵池中，进行同源四倍体鲤F1的人工催产，人工干法授精和流水孵化，得到的鱼苗进行饲养，直至鱼苗长到8～10cm长后获得下一代同源四倍体鲤；所述同源四倍体鲤F1进行人工催产时，先对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为300IU/kg～400IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为6μg/kg～10μg/kg；3h～5h后再对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素、黄体素释放激素类似物与地欧酮的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为600IU/kg～800IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为12μg/kg～20μg/kg，地欧酮的用量为1.5mg/kg～2.0mg/kg。
9.一种利用权利要求1-8中任一项所述建立方法得到的同源四倍体鲤品系选育同源三倍体鲤的方法，其特征在于，包括如下步骤：以二倍体鲤作为母本亲鱼，所述同源四倍体鲤作为父本亲鱼，进行倍间杂交，得到的后代即为所述同源三倍体鲤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述杂交的具体操作包括如下步骤：在繁殖季节，水温维持在22℃～25℃，挑选2龄及2龄以上的能产生墨绿色卵子的二倍体鲤雌性个体，以及1龄及1龄以上的能产生乳白色精液的同源四倍体鲤的雄性个体，先对父本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素与黄体素释放激素类似物的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为300～400IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为6μg/kg～10μg/kg；3h～5h后再对母本亲鱼注射绒毛膜促性腺激素、黄体素释放激素类似物与地欧酮的混合催产剂进行催产，其中绒毛膜促性腺激素的用量为1000IU/kg～1500IU/kg，黄体素释放激素类似物的用量为20μg/kg～25μg/kg，地欧酮的用量为1.8mg/kg～2.8mg/kg；然后将母本亲鱼与父本亲鱼按1︰(4～6)的数量比放入同一产卵池中待产，直至开始顺利产卵和产精；再进行人工干法授精，授精完成后的受精卵于22℃～24℃恒温、通气、流水的环境下孵化，待鱼苗孵化完成后进行专池饲养，直至鱼苗长到8～10cm长后，通过流式细胞DNA含量测定方法挑选出血细胞DNA含量为150的后代，即获得所述的同源三倍体鲤。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110915727A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-03-27 | 湖南师范大学 | 通过远缘杂交选育多种彩色双尾金鱼的方法 |
| CN110999830A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-04-14 | 广西壮族自治区水产引育种中心 | 一种鲤鱼快速高效选育方法 |
| CN116349626A (zh) * | 2023-04-12 | 2023-06-30 | 湖南师范大学 | 一种雌性可育的同源三倍体鲫的培育方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1709046A (zh) * | 2005-06-10 | 2005-12-21 | 湖南师范大学 | 红鲫、日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 |
| CN103875574A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-06-25 | 湖南师范大学 | 两性可育同源四倍体鲫鱼的选育方法及其品系的建立方法、三倍体鱼的选育方法 |
| CN104585083A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-05-06 | 湖南师范大学 | 鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 |
| CN104585091A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-06 | 湖南师范大学 | 日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法和四倍体杂交鱼的应用 |
-
2019
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1709046A (zh) * | 2005-06-10 | 2005-12-21 | 湖南师范大学 | 红鲫、日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 |
| CN103875574A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-06-25 | 湖南师范大学 | 两性可育同源四倍体鲫鱼的选育方法及其品系的建立方法、三倍体鱼的选育方法 |
| CN104585083A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-05-06 | 湖南师范大学 | 鲤鱼与团头鲂亚科间远缘杂交的方法 |
| CN104585091A (zh) * | 2015-01-12 | 2015-05-06 | 湖南师范大学 | 日本白鲫与团头鲂亚科间远缘杂交的方法和四倍体杂交鱼的应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| -: "远缘杂交造新鱼——记"湖南光召科技奖"获得者、湖南师范大学教授刘少军", 《发明与创新(大科技)》 * |
| FANGZHOUHU: "Production of androgenetic, triploid and tetraploid hybrids from the interspecific hybridization of female Japanese crucian carp and male blunt snout bream", 《AQUACULTURE》 * |
| QIN B: "Differential expression of HPG-axis genes in autotetraploids derived from red crucian carp Carassius auratus red var., ♀ × blunt snout bream Megalobrama amblycephala, ♂", 《FISH BIOLOGY》 * |
| 王石等: "鱼类远缘杂交育种技术的建立及应用", 《中国科学: 生命科学》 * |
| 陈璇: "同源三倍体鱼的遗传及生殖特性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110915727A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-03-27 | 湖南师范大学 | 通过远缘杂交选育多种彩色双尾金鱼的方法 |
| CN110999830A (zh) * | 2020-01-08 | 2020-04-14 | 广西壮族自治区水产引育种中心 | 一种鲤鱼快速高效选育方法 |
| CN116349626A (zh) * | 2023-04-12 | 2023-06-30 | 湖南师范大学 | 一种雌性可育的同源三倍体鲫的培育方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110199918B (zh) | 2021-07-09 |
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