CN106614123B - 一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法，步骤为：1）建立鲈鱼精子冷冻库；2）精子遗传物质灭活；3）星斑川鲽未受精卵的采集及授精；4）受精卵压力休克诱导；5）雌核发育卵的培养。本发明的方法，有利于提高星斑川鲽雌核发育的受精率和发育率，建立了星斑川鲽雌核发育群体。

Description

一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及是一种培育全雌性、生长快速的星斑川鲽新种质的育种技术。
背景技术
星斑川鲽(Platichthys stellatus)主要分布于北太平洋的亚洲和美洲沿岸，主要分布国家有加拿大，美国，俄罗斯，中国、朝鲜、韩国和日本等。星斑川鲽对水温和盐度的变化具有较强的忍耐力，适应温度范围广，抗逆性强，养殖成活率高，体态浑厚，体色艳丽喜人，具有极高的经济价值，是继大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)之后极具养殖潜力的优良品种，也是我国海水鱼类增殖放流的重要鱼类之一。星斑川鲽雌雄性生长差异较大，2龄雌性体重较雄性重2.48倍以上(中国水产科学研究院黄海水产研究所，田永胜等，海洋学报，2016)，生长较慢的雄性鱼类对于提高养殖产量、扩大养殖规模具有一定的限制作用。因此研发生长快的星斑川鲽全雌鱼苗，对于扩展本品种的养殖规模和提高养殖经济效益具有重要的现实意义。雌核发育是单性生殖的一种，指卵子依靠自己细胞核内遗传物质发育成个体的生殖行为。通过雌核发育可以达到制备全雌性鱼类遗传后代的目的，为鱼类遗传育种创造有价值的繁育群体。雌核发育现象发现于天然鱼类亚马逊花鳉(Poecilia formosa)，分布于我国的方正银鲫、彭泽鲫等也属于天然雌核发鱼类，中国科学院水生生物研究所的桂建芬等(1996)对银鲫天然雌核发育机理进行了大量的研究。中国科学院水生生物研究所吴清江等(1981)在鲤鱼上最早建立了雌核发育技术。德国New Brunswick大学的Harald B Tvedt(2003)利用欧鲽(Hippoglossoides platessoides)、美洲黄盖鲽(Pleuronectesferrugineus)和美洲拟鲽(P.americanus)精子诱导大西洋大比目鱼(Hippoglossushippoglossus L.)卵雌核发育。北卡罗莱拉州立大学的Luckenbach等(2004)利用同源和异源精子诱导漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)雌核发育，Piferrer等对大菱鲆雌核发育技术进行了研究(Institut de Ciències del Mar,Consejo Superior deInvestigaciones Cientificas,Piferrer et al.,2004)，但是星斑川鲽雌核发育技术方法在国内外还未见报导。
发明内容
本发明涉及一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法，首次在在国内外建立了星斑川鲽雌核发育诱导技术，建立了雌核发育群体，这一方法具有操作简单、高效的特点，有利于提高星斑川鲽雌核发育的受精率和发育率，并降低畸形率。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案予以实现:
一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法，步骤为：
1)建立鲈鱼精子冷冻库：在鲈鱼性成熟期，选择发育至可产精液的雄性鲈鱼，采集精液，对活力达到80-90％以上的精子进行冷冻保存，建立精子冷冻库；
2)精子遗传物质灭活：将冷冻精子从液氮中取出并解冻；对精子进行紫外线灭活处理，使精子遗传物质失活，精子的活力保持在30-40％左右；
3)星斑川鲽未受精卵的采集及授精：选择性成熟的星斑川鲽雌鱼，每天5:00、17:00采卵，将上述灭活的鲈鱼精液加入星斑川鲽卵中，轻轻摇动混匀，精液和卵的受精最小体积比为100μL：4mL，加入2倍体积于卵量的海水受精，海水温度为13-14℃；
4)受精卵压力休克诱导：在受精后5min，将受精卵注入压力容器中，快速将压力提升至60MPa，压力提升时间为8-10s，静水压持续时间10min，之后缓慢释放压力；
5)雌核发育卵的培养：将上述经过压力休克后的星斑川鲽受精卵利用海水清洗、沉淀过滤、除去沉淀死卵，将上浮受精卵加入13-14℃的海水，放在网箱中孵化培养。
进一步的，所述步骤1)中对精子进行冷冻保存的方法为，将精液与冷冻保存液以体积比1:1的比例混合，分装到冷冻保存管中，然后放入-196℃的液氮中冷冻保存。
进一步的，所述冷冻保存液的组成为80％的精子稀释液和20％的二甲基亚砜(DMSO),为体积比。
进一步的，所述精子稀释液的组成为NaCl 3.526g/L,NaH2PO40.281g/L；NaHCO30.252g/L，KCl 0.389g/L，D-Glucose(D-葡萄糖)10.0g/L。
进一步的，步骤2)中紫外线灭活处理是将冷冻精液与精子稀释液以1:5的体积比稀释，平铺于培养皿中，将培养皿置于紫外交联仪中，利用80mj/cm2紫外线照射。
进一步的，步骤3)中对发育迟缓的雌鱼注射促黄体素释放激素A210μg/kg,促进星斑川鲽雌鱼性成熟。
进一步的，步骤5)中网箱中孵化培养过程，孵化水温13.5-14.0℃，溶氧量保持在5.0-9mg/L；每日检查卵的发育情况，待发育至出膜前期，收集网箱中成活卵进行鱼苗培育。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明针对星斑川鲽雌雄鱼生长差异大，雄性生长速度慢的问题，在养殖群体中雌鱼体重达到1474.6±393.94g时，雄性为594.2±129.6g，雌鱼的体重为雄性的2.48倍。由于生长较慢的雄性延迟了商品鱼上市的时间，使养殖成本进一步提高，限制了产业发展规模。通过本发明技术方法在国内外首次制备和培育出星斑川鲽全雌性后代和育种群体，为星斑川鲽的全雌化育种建立了有效的繁育群体，通过育种群体的培育和进一步利用，可极大的提高星斑川鲽商品鱼的生长速度，扩大该品种的养殖规模，提高养殖效益。本发明利用压力休克进行星斑川鲽雌核发育诱导具有操作简单、高效特点，技术要点易于筛选和掌握，诱导孵化率较高(2.11±0.37％)，在6-10min就可以完成压力诱导。而在其它鱼类雌核发育中利用冷休克法耗时长，冷冻休克时间需要45-60min；另外冷冻温度的准确性较难掌握，诱导参数的建立较困难，诱导孵化率较低(0.07±0.01％)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
本实施例的压力休克诱导星斑川鲽雌核发育方法主要包括以下几个步骤：鲈鱼精子冷冻库建立，精子遗传物质灭活，星斑川鲽未受精卵的采集和授精，受精卵的压力休克诱导，雌核发育卵的培育，具体为：
1、鲈鱼精子冷冻库建立
在鲈鱼性成熟期，选择发育至可产精液的雄性鲈鱼，用挤压其腹部采集精液。利用显微镜检测精子活力达到80-90％以上，进行冷冻保存；将精液与冷冻保存液(80％LJS+20％DMSO)以体积比1:1的比例混合，分装到2.0mL的冷冻保存管中，然后放入液氮中(-196℃)大量冷冻保存，建立精子冷冻库。
精子稀释液LJS的各成分浓度为：NaCl 3.526g/L，NaH2PO40.281g/L；NaHCO30.252g/L，KCl 0.389g/L，D-Glucose(D-葡萄糖)10.0g/L。冷冻保存液为80％LJS和20％二甲基亚砜(DMSO)，为溶液体积比(v/v)。
本实施例研制了提高精子活力的精子稀释液配方LJS，成份简单经济，易于操作，简化了冷冻保存程序，相比现有的精子冷冻保存液和方法，本实施例可以提高冷冻保存精子的活力，在延长冷冻保存时间的基础上，精子活力达到83.00±1.52％以上，可以达到大量的收集和保存不同生态环境和繁殖时间的鲈鱼精子目的，有利于建立精子冷冻库，为不同繁殖季节的星斑川鲽雌核发育诱导奠定了基础。
2、精子遗传物质灭活
将冷冻精子管从液氮中取出，然后置于37℃的水浴中摇动解冻；镜检冻后精子活力，精子活力达到70-80％以上即可进行紫外线灭活处理；将冷冻精液与LJS稀释以1:5的比例稀释，平铺于直径为9cm的培养皿中，将培养皿置于紫外交联仪(UVC500)中，利用80mj/cm2紫外线照射，使精子遗传物质失活，精子的活力保持在30-40％左右，能够将精子内的遗传物质充分灭活，又能保持精子的受精能力。
3、星斑川鲽未受精卵的采集及授精
选择性成熟的星斑川鲽雌鱼，对发育迟缓的雌鱼注射促黄体素释放激素A2(LHRH-A2)10μg/kg，每天5:00、17:00采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中。将以上经过灭活的鲈鱼精液加入星斑川鲽卵中，轻轻摇动混匀，精液和卵的受精最小体积比为100μL：4mL，加入2倍于卵量的海水受精，海水温度为13-14℃，受精过程在1000mL烧杯中进行。
4、受精卵压力休克诱导
在受精后5min，将受精卵注入800mL的压力容器中，利用静水压机快速将压力提升至60MPa，提升压力的时间是8-10s，静水压持续时间10min，之后缓慢释放压力，将受精卵倒入烧杯。
5、雌核发育卵的培养
将以上经过压力休克后的星斑川鲽受精卵利用海水清洗、沉淀过滤、除去沉淀死卵，将上浮受精卵加入13-14℃的海水，放在网箱中孵化培养，同时观察发育情况。
本实施例采用压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育，其原理是压力可以抑制卵中第二极体的排出，从而使卵核中的染色体变成二倍体。雌核发育是孤雌生殖的一种，是卵子依靠自己细胞核内遗传物质发育成完整个体的生殖行为。遗传物质灭活的同种或异种精子进入卵内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代的遗传物质完全来自雌核，后代只具有母本的性状。
为了获得异种精子，本实施例首先建立鲈鱼精子冷冻库，为星斑川鲽雌核发育诱导提供了大量可随时利用的精子资源，克服了不同繁殖季节、不同繁殖时间和地点的生殖隔离，实现了远缘鱼类遗传物质的有效利用。鲈鱼和星斑川鲽的亲缘关系相当远，分别属于鲈形目和鲽形目，其杂交胚胎不能正常发育，因此保证了星斑川鲽雌核发育后代的可靠性。
通过本实施例的方法构建的星斑川鲽雌核发育群体为该品种遗传育种研究制备了丰富的遗传种群，通过该种群的进一步培育和利用可以培育出生长快、全雌性星斑川鲽苗种，解决该品种生长慢的问题，极大的提高养殖经济效益。
实施例1
1、鲈鱼精子冷冻库建立
2010年从渤海沿岸养殖场收集达到性成熟雄性鲈鱼50多尾，养殖在海阳黄海水产有限公司工厂化流水池中，每年秋季当水温降低到18℃以下时，雄性性腺成熟。可选择发育至可产精液的雄性鲈鱼，挤压其腹部采集精液，利用显微镜检测精子活力达到80％以上，进行冷冻保存；将精液与抗冻稀释液(80％LJS+20％DMSO)以体积比1：1的比例混合，分装到2.0mL的冷冻保存管中，然后放入液氮中(-196℃)大量冷冻保存，2014年和2015年冷冻保存精子400多份，建立鲈鱼精子冷冻库，达到了长期大量保存和应用的目的。
精子稀释液LJS的各成分浓度为：
NaCl 3.526g/L，NaH2PO40.281g/L，NaHCO30.252g/L，KCl 0.389g/L，D-Glucose(D-葡萄糖)10.0g/L。DMSO为市售二甲基亚砜。
2、精子遗传物质灭活
将冷冻精子管从液氮中取出，置于37℃的水浴中摇动解冻；镜检冻后精子活力，精子活力达到83.00±1.52％；将冷冻精液与LJS稀释以1：5的比例稀释，平铺于直径为9cm的培养皿中，将培养皿置于紫外交联仪(UVC500)中，分别利用60、80和100mj/cm2紫外线照射，再用显微镜检测精子活力；然后利用遗传物质失活精子与星斑川鲽卵授精，发育到囊胚时检测其受精率，发育至出膜前期检测其孵化率和畸形率(表1)；发现利用80mj/cm2紫外线照射精子与星斑鲽卵受精具有一定的孵化率，而且畸形率相对较低(P<0.05)。
表1鲈鱼冷冻精子的紫外线灭活处理
注:同列中有不同小写字母者表示组间差异显著(P<0.05)。
3、星斑川鲽未受精卵的采集及授精
2016年3月选择性成熟的星斑川鲽雌鱼50尾，雌鱼体重700－2500g，体长35－50cm，对发育迟缓的雌鱼注射促黄体素释放激素A2(LHRH-A2)10μg/kg,亲鱼培育在30m3的流水池中，每天5:00、17:00采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中。将以上经过灭活的鲈鱼精液加入星斑川鲽卵中，轻轻摇动混匀，精液和卵的受精最小体积比为100μL：4mL，加入2倍于卵量的海水受精，海水温度为13-14℃，受精过程在1000mL烧杯中进行。受精卵利用海水漂洗、静置、沉淀、过滤获得上浮受精卵。
4、受精卵压力休克诱导条件的筛选
将以上受精卵进行压力休克，利用静水压机处理，首先用海水将静水压力缸冲洗干净，并在压力缸中加入少许海水，为加入受精卵时提供缓冲以降低受精卵的损伤，将受精卵倒入压力缸中，加满海水，盖上塞子后，挤出压力缸中的空气，置于压力机上，在达到受精后处理时间时，快速人工加压至所需要压力，维持一定时间后，慢慢拧动减压阀进行减压。最后将卵倒入预先准备好的1000mL量杯中，洗卵后放于网箱中孵化。
受精后时间确定：预先设置4个压力处理的起始时间，分别为受精后3、5、7、9min，静水压力为60Mpa，压力持续时间10min，对处理起始时间进行筛选，发现受精后5min处理的具有一定的孵化率(1.01±0.02％)。
静水压力确定：在受精后5min，分别利用55、60、65MPa的静水压对受精卵处理10min,对静水压力进行筛选，发现静水压力在60MPa时，可以诱导出一定比例的雌核发育后代，孵化率为1.12±0.01％。
压力处理时间确定：然后在受精后5min、静水压力为60MPa时，将压力处理时间设计为6、8、10、12min，对处理时间进行筛选，发现处理时间在10min时，诱导雌核发育孵化率为2.11±0.03％。
从此筛选到了压力休克诱导星斑川鲽雌核发育的条件为：受精后5min、静水压力为60MPa、压力处理时间为10min，可以成功诱导星斑川鲽雌核发育(表2)。
表2静水压诱导雌核发育条件筛选
5、雌核发育卵和鱼苗的培养
受精卵经过漂洗和沉淀，过滤掉死卵和过熟卵，将上浮卵计量体积后放入50×50×100cm的网箱中孵化，孵化水温13.5-14.0℃，同时利用气石给网箱中微充气，溶氧量保持在5.0-9mg/L。每日利用显微镜检查卵的发育情况，待发育至出膜前期，收集网箱中成活卵，将成活卵放入1.5m3的玻璃缸孵化并培育鱼苗。鱼苗培育阶段，水缸保持微流水0.1-0.2m3/h，培育水温保持15.0-18.0℃，利用气石向水缸中充气，保持溶氧量在7-9mg/L。孵化后第5天投喂轮虫，每天两次，水中轮虫量保持在8-10个/mL。15-20天后投喂卤虫，鱼苗伏底后逐渐以投喂人工配合颗粒饵料为主，根据鱼苗大小改变饵料粒径。
2016年利用以上方法诱导和培育星斑川鲽雌核发育鱼苗300尾，生长体重6.72±2.28g、全长7.61±0.98cm、体长6.32±0.88cm、体宽3.55±0.53cm。
以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的一种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法，其特征在于，步骤为：
1）建立鲈鱼精子冷冻库：在鲈鱼性成熟期，选择发育至可产精液的雄性鲈鱼，采集精液，对活力达到80%以上的精子进行冷冻保存，建立精子冷冻库；
对精子进行冷冻保存的方法为，将精液与冷冻保存液以体积比1:1的比例混合，分装到冷冻保存管中，然后放入-196℃的液氮中冷冻保存；所述冷冻保存液的组成为80%的精子稀释液和20%的二甲基亚砜，为体积比；所述精子稀释液的组成为NaCl 3.526g/L，NaH2PO4 0.281g/L，NaHCO3 0.252g/L，KCl 0.389g/L，D-Glucose 10.0g/L；
2）精子遗传物质灭活：将冷冻精子从液氮中取出并解冻；对精子进行紫外线灭活处理，使精子遗传物质失活，精子的活力保持在30-40%；
3）星斑川鲽未受精卵的采集及授精：选择性成熟的星斑川鲽雌鱼，每天5:00、17:00采卵，将上述灭活的鲈鱼精液加入星斑川鲽卵中，轻轻摇动混匀，精液和卵的受精最小体积比为100µL：4mL，加入2倍体积于卵量的海水受精，海水温度为13-14℃；
4）受精卵压力休克诱导：在受精后5min，将受精卵注入压力容器中，快速将压力提升至60MPa，压力提升时间为8-10s，静水压持续时间10min，之后缓慢释放压力；
5）雌核发育卵的培养：将上述经过压力休克后的星斑川鲽受精卵利用海水清洗、沉淀过滤、除去沉淀死卵，将上浮受精卵加入13-14℃的海水，放在网箱中孵化培养。
2.根据权利要求1所述的一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法，其特征在于，步骤2）中紫外线灭活处理是将冷冻精液与精子稀释液以1:5的体积比稀释，平铺于培养皿中，将培养皿置于紫外交联仪中，利用80mj/cm2紫外线照射。
3.根据权利要求1所述的一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法，其特征在于，步骤3）中对发育迟缓的雌鱼注射促黄体素释放激素A210μg/kg，促进星斑川鲽雌鱼性成熟。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的一种压力休克诱导星斑川鲽减数雌核发育方法，其特征在于，步骤5）中网箱中孵化培养过程，孵化水温13.5-14.0℃，溶氧量保持在5.0-9mg/L；每日检查卵的发育情况，待发育至出膜前期，收集网箱中成活卵进行鱼苗培育。
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